藜麥黃酮提取及其抗氧化活性研究

蘆曉芳，李亞諾，宋兵澤，楊美紅，岳愛琴，趙晉忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西晉中 030801）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）是一種雙子葉藜科藜屬植物，具有一定的耐旱、耐寒、耐鹽性，適合高海拔（3 000~4 000 m）的高原或山地地區(qū)生長［1］。藜麥的營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等，其中含量為0.4%~0.7%的藜麥黃酮具有清除體內(nèi)氧自由基、降低膽固醇、改善血液循環(huán)等功效［2，3］。近年來，世界范圍內(nèi)對藜麥的種植與研究越來越多，但對藜麥黃酮類物質(zhì)的研究相對欠缺。目前藜麥黃酮的常用提取方法有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等［4-9］，為進(jìn)一步提高藜麥黃酮的提取效率及最大程度避免其活性組分損耗，本研究以白藜麥子粒為原料，基于超聲輔助提取法，增加外加負(fù)壓，探尋不同超聲時間、固液比及負(fù)壓對藜麥黃酮提取率的影響，通過響應(yīng)面優(yōu)化獲得超聲-負(fù)壓輔助提取藜麥黃酮的最佳工藝條件，為藜麥黃酮的提取提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。粗藜麥黃酮經(jīng)分離純化后得到的藜麥總黃酮，考察其體外抗氧化活性，意在證明藜麥黃酮的潛在利用價值，為藜麥黃酮在醫(yī)藥和功能食品開發(fā)上提供理論依據(jù)，使藜麥的應(yīng)用范圍及商業(yè)價值增大，達(dá)到藜麥資源的充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；UV1100 型分光光度計，長沙科美分析儀器有限公司；DL-0506 型低溫冷卻液循環(huán)泵，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；YRE2000E 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵，鄭州予華儀器制造有限公司；YXSF-500 型中藥粉碎機(jī)，上海百航實(shí)業(yè)有限公司；KM-300DE 型中文液晶臺式超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司；VEGA ⅡRSU 型掃描電子顯微鏡，TESCAN公司。

1.3 藜麥去脂預(yù)處理

藜麥粉碎過孔徑0.33 mm篩，按固液比1∶5（g/mL）加入石油醚，浸泡過夜，反復(fù)3~4 次，至石油醚無色為止。真空抽濾，室溫下?lián)]干濾餅石油醚，即得去脂藜麥粉末，備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［10］。精確稱取0.015 0 g 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，70%乙醇溶解，定容25 mL，即得到濃度為0.6 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

吸取一定量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入70%乙醇、5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、4%氫氧化鈉于具塞試管中，70%乙醇定容至10 mL。全波段掃描蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，確定最大吸收波長。最大吸收波長處分別測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.5 藜麥黃酮含量測定

按照“1.4”的方法配制溶液，在最大吸收波長處測定吸光度。

式中，C為藜麥黃酮濃度（mg/mL），V為提取液體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，m為藜麥的質(zhì)量（g）。

1.6 單因素試驗(yàn)

1.6.1 固液比對藜麥黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 脫脂藜麥粉，分別設(shè)定固液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80（g/mL，下同），乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲功率270 W，超聲溫度50 ℃的條件下超聲20 min。

1.6.2 超聲時間對藜麥黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 脫脂藜麥粉，按固液比1∶20 加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，超聲功率270 W，超聲溫度50 ℃的條件下，分別設(shè)定超聲時間為10、20、30、40、50 min。

1.6.3 負(fù)壓輔助對藜麥黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 脫脂藜麥粉，分別設(shè)定負(fù)壓0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 MPa，按固液比1∶20 加入70%的乙醇，超聲功率270 W，超聲溫度50 ℃的條件下超聲30 min。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

以超聲時間（A）、固液比（B）和負(fù)壓（C）3 個條件為自變量因素，根據(jù)藜麥黃酮提取單因素試驗(yàn)的結(jié)果得到3 個水平，按表1 的條件設(shè)計17 組響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，通過Design-Expert 12.0 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到藜麥黃酮提取的優(yōu)化條件。

表1 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)因素及水平

1.8 藜麥黃酮的純化

藜麥黃酮的純化方法：乙酸乙酯萃取藜麥黃酮粗提濃縮液，旋干溶劑，干法上樣過硅膠層析柱，丙酮洗脫，得到純化藜麥黃酮。

1.9 粉末SEM 表征

掃描電子顯微鏡用于分析和描述藜麥細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)在不同條件（超聲時間、固液比、負(fù)壓）提取前后的變化。SEM表征檢測條件為：加速電壓（HV）20.0 kV，放大（MAG）200 kx，工作距離（WD）7.08 mm。

1.10 藜麥黃酮抗氧化活性

將樣品母液稀釋不同倍數(shù)，以維生素C 為陽性對照分析藜麥黃酮的抗氧化活性。采用普魯士藍(lán)顯色法［11］測定藜麥黃酮還原Fe3+能力；藜麥黃酮對清除DPPH 自由基的能力按白紅進(jìn)等［12］的方法測定。

式中，A0表示未加樣品樣液的空白溶劑混合液的吸光度；A1表示未加樣品溶液的DPPH 溶液的吸光度；A2表示藜麥皂苷樣品或抗壞血酸與DPPH 試劑混合液的吸光度。

1.11 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用Origin 2017 軟件及Design-Expert12.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，ChemSketch12.0 軟件繪制藜麥黃酮結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳檢測波長的確定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品全波段掃描結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，蘆丁最大吸收波長為507 nm，即藜麥黃酮的最大吸收波長。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品全波段掃描

2.2 藜麥總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

蘆丁不同濃度吸光度曲線（蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線）如圖2 所示，線性擬合得蘆丁溶液濃度對吸光度的回歸方程：y=8.250 86x+0.015 54，R2=0.991 93。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）

2.3 藜麥黃酮提取單因素試驗(yàn)

2.3.1 固液比對藜麥黃酮提取量的影響 由圖3 可知，藜麥黃酮提取量隨著提取溶劑體積的增大呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)固液比為1∶20 時，藜麥黃酮提取量最大，為（4.75±0.062）mg/g，可能是固液比為1∶20 時有足夠的溶劑將藜麥黃酮完全溶出；當(dāng)固液比為1∶5~1∶20 時，溶劑量不足以將樣品中的黃酮全部溶出；當(dāng)固液比為1∶20~1∶80 時，增加的提取溶劑量可能會導(dǎo)致藜麥樣品中雜質(zhì)的溶出，影響降低藜麥黃酮的提取量。

圖3 固液比對藜麥黃酮提取量的影響

2.3.2 超聲時間對藜麥黃酮提取量的影響 由圖4可知，藜麥黃酮提取量隨著超聲時間的增加整體上呈先增加后減小的趨勢。當(dāng)超聲時間小于30 min時，黃酮提取量隨著超聲時間的增加而增大；當(dāng)超聲時間為30 min 時藜麥黃酮提取量最大，為（5.21±0.025）mg/g；當(dāng)超聲時間大于30 min 時，黃酮提取量降低。原因可能為在短時間內(nèi)，超聲時間越長，提取液與脫脂藜麥粉接觸時間越長，黃酮溶出率越高，當(dāng)黃酮溶出完全后，隨著提取時間增加，雜質(zhì)溶出率也會相應(yīng)增加，就會導(dǎo)致黃酮提取量降低，其次超聲加熱時間增長也有可能會導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致藜麥黃酮提取率降低［13］。

圖4 超聲時間對藜麥黃酮提取量的影響

2.3.3 負(fù)壓對藜麥黃酮提取量的影響 由圖5 可知，隨著提取壓力的降低藜麥黃酮提取量整體上呈先增加后減小的趨勢。當(dāng)負(fù)壓低于0.05 MPa 時，藜麥黃酮提取量隨著負(fù)壓的增加而增大；當(dāng)負(fù)壓達(dá)到0.05 MPa 時，藜麥黃酮提取量最大，為（5.29±0.061）mg/g；隨著負(fù)壓的進(jìn)一步升高，藜麥黃酮的提取量也相應(yīng)降低，可能的原因?yàn)殡S著提取壓力降低，藜麥黃酮溶出后繼而有其他雜質(zhì)的溶出，從而降低藜麥黃酮的提取量，此現(xiàn)象說明在其他條件相同的情況下，一定程度的減壓處理會促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的溶出，由于在負(fù)壓的條件下，空氣相對稀薄，提取物受到的外力減小［14-18］，細(xì)胞更容易張開破裂，使植物細(xì)胞中有效成分更容易析出。

圖5 負(fù)壓對藜麥黃酮提取量的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design-Expert 12.0 軟件中Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計，根據(jù)前期單因素試驗(yàn)得出的最優(yōu)條件為中心點(diǎn)，用響應(yīng)面分析進(jìn)行三水平三因素的優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。以總黃酮提取量（Y）為響應(yīng)值，回歸擬合，獲得藜麥黃酮提取量的回歸方程：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

該模型的顯著性方差分析結(jié)果如表3 所示。該模型R2=0.997 9，調(diào)整后R2Adj=0.995 3。由回歸模型的方差分析F值可以推測出各因素的主效關(guān)系：固液比（B）＞負(fù)壓（C）＞超聲時間（A）。兩因素間交互作用對藜麥黃酮提取量的影響結(jié)果（響應(yīng)面及等高線）如圖6 至圖8 所示，等高線曲線是響應(yīng)面的投影。

圖6 超聲時間、固液比對總黃酮提取量的等高線及響應(yīng)面

圖8 固液比、負(fù)壓對總黃酮提取量的等高線及響應(yīng)面

表3 方差分析結(jié)果

兩兩因素間的交互作用對響應(yīng)值影響水平可由等高線的形狀來確定。由圖6 至圖8 可知，超聲時間和固液比之間、超聲時間和負(fù)壓之間及負(fù)壓和固液比之間兩兩因素交互作用顯著。隨著每個因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到最大值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小［19，20］。該模型有最大值，即綜合單因素試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件得出最佳提取量。

藜麥黃酮最佳提取量及操作條件求算過程：將回歸方程求導(dǎo)，得到三元一次方程組。

求解得A=27.234，B=0.028，C=0.059，即該模型最優(yōu)結(jié)果：超聲時間27 min、固液比1∶36 和負(fù)壓0.059 MPa，在此條件下獲得藜麥黃酮預(yù)測提取量為5.28 mg/g。優(yōu)化后重復(fù)3 次試驗(yàn)，獲得藜麥黃酮實(shí)際提取量為（5.31±0.038）mg/g，與預(yù)測值相近，證明該模型能準(zhǔn)確可靠地預(yù)測藜麥黃酮的總提取量。

2.5 藜麥黃酮提取后粉末SEM 表征

脫脂藜麥粉末在超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W條件下，不同超聲時間、固液比和負(fù)壓提取條件下藜麥樣品的SEM 表征如圖9 所示。

圖9 藜麥粉末不同提取條件下的SEM 圖

樣品SEM 表征符號說明如表4 所示。由表4 可知，SEM 表征樣品各提取條件分別為“2.3”和“2.4”提取單因素試驗(yàn)中每組的最優(yōu)條件及響應(yīng)面擬合優(yōu)化得出最優(yōu)條件，結(jié)合“2.3”和“2.4”的藜麥黃酮提取量可知藜麥細(xì)胞壁破損程度越大，藜麥黃酮提取量越大，細(xì)胞壁的破損程度依次為d＞c＞b＞a。對應(yīng)藜麥黃酮的提取量分別為（5.31±0.038）mg/g ＞（5.29±0.061）mg/g＞（5.21±0.025）mg/g＞（4.75±0.062）mg/g。由此可知，藜麥細(xì)胞壁在超聲-負(fù)壓條件下破損最嚴(yán)重，更有利于藜麥黃酮溶入提取液中，從而提高了藜麥黃酮的提取量。

表4 樣品SEM 表征符號說明

2.6 純化藜麥黃酮體外抗氧化活性

2.6.1 純化藜麥黃酮總還原能力 由圖10 可知，在試驗(yàn)溶液濃度范圍（0~0.25 mg/mL）內(nèi)，純化藜麥黃酮的還原能力與溶液濃度呈正相關(guān)。純化藜麥黃酮的還原能力小于維生素C，在0.25 mg/mL 的濃度下，維生素C 的總還原能力約為純化藜麥黃酮的2.1 倍。

圖10 藜麥黃酮與維生素C 的總還原能力

2.6.2 純化藜麥黃酮對DPPH 自由基的清除作用由圖11 可知，純化藜麥黃酮對DPPH 自由基的清除能力與其濃度呈正相關(guān)。DPPH 自由基清除能力低于維生素C，在藜麥黃酮濃度達(dá)到0.25 mg/mL 時對DPPH 自由基的清除率（89.5±0.43）%接近于維生素C。

圖11 藜麥黃酮與維生素C 對DPPH 自由基的清除作用

3 結(jié)論

1）基于單因素（固液比、超聲時間和負(fù)壓）試驗(yàn)，通過響應(yīng)面法優(yōu)化獲得藜麥黃酮超聲-負(fù)壓法提取最佳工藝參數(shù)為超聲時間27 min，固液比1∶36 和負(fù)壓0.059 MPa，該條件下藜麥黃酮提取量為（5.31±0.038）mg/g，與預(yù)測提取量5.28 mg/g 接近，根據(jù)響應(yīng)面分析獲得各因素對藜麥黃酮提取量影響大小依次為固液比＞負(fù)壓＞超聲時間。藜麥黃酮提取量（Y）回歸方程為Y=-1.062 09+0.144 733A+9.488 99B+178.536 92C+0.240 37AB-0.023 915AC-237.169 05BC-0.002 659A2-79.605 11B2-1 760.253 85C2。該條件下可以有效提取藜麥黃酮，且提取條件容易實(shí)現(xiàn)。

2）純化藜麥黃酮具有良好的體外抗氧化活性，純化藜麥黃酮的抗氧化活性與其濃度呈正相關(guān)。