新生抗原在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展*

李佳樂,高雯(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科,南京 210029)

理想的癌癥治療方法不僅可以殺死惡性腫瘤細(xì)胞,還可以保留健康組織細(xì)胞。越來越多的臨床試驗(yàn)證實(shí),免疫治療對(duì)多種腫瘤有效,特別是對(duì)于晚期實(shí)體瘤,免疫療法已成為無驅(qū)動(dòng)基因改變腫瘤患者的一種有前途的治療方法[1-3]。在這個(gè)精準(zhǔn)醫(yī)療的時(shí)代,需要利用對(duì)癌癥生物學(xué)和基因組學(xué)的更好理解來開發(fā)免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)志物,識(shí)別有益臨床反應(yīng)和不良事件風(fēng)險(xiǎn)低的患者,以便患者獲益。生物學(xué)標(biāo)志物還將有助于確定適合ICIs的患者,以及決定其應(yīng)該接受單一療法還是聯(lián)合療法。為了更好地區(qū)分對(duì)腫瘤免疫治療敏感患者和非敏感患者,科學(xué)家們迫切需要尋找可靠的生物學(xué)標(biāo)志物。程序性死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)、腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden,TMB)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)等已被證實(shí)可以作為預(yù)測(cè)患者對(duì)ICIs治療反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志物[4-5]。筆者介紹一種來源于病毒致癌蛋白或非同義體細(xì)胞突變的新生抗原(neoantigen),并證實(shí)TMB和MSI均是新生抗原的間接檢測(cè)指標(biāo)[6]。新生抗原的特異性識(shí)別在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著重要作用,新生抗原可能是ICIs的一種新興的預(yù)測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物。筆者總結(jié)了新生抗原預(yù)測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物的特點(diǎn),并討論了新生抗原在免疫治療中的應(yīng)用。

1 新生抗原的定義

腫瘤抗原是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗原物質(zhì),可引發(fā)宿主的免疫反應(yīng),目前共發(fā)現(xiàn)有15種腫瘤抗原。根據(jù)特異性,腫瘤抗原可分為腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens,TAA)、病毒抗原(virus antigen)、腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen,TSA)和非傳統(tǒng)腫瘤抗原(unconventional tumor antigens)[7]。

腫瘤特異性抗原也稱為新生抗原,它來源于體細(xì)胞突變或基因重排蛋白,在單個(gè)腫瘤組織中過度表達(dá),可以被T細(xì)胞受體特異性識(shí)別,包括單個(gè)核苷酸突變來源抗原(single nucleotide variants-derived neoantigens),插入突變來源抗原(indel-derived neoantigens),基因融合來源抗原(gene fusion-derived neoantigens),mRNA剪切異常來源抗原(splice variant-derived neoantigens),未注釋開放閱讀框架來源抗原(translated unannotated ORFs derived neoantigens),線粒體基因組來源抗原(mitochondrial genome derived neoantigens)和熱點(diǎn)突變類抗原(hotspot mutation derived neoantigens)[5,8]。圖1介紹了不同腫瘤類型形成新生抗原的可能性[3]。與未突變的自身抗原相比,新生抗原真正區(qū)別于正常組織,可使免疫系統(tǒng)識(shí)別為非自身抗原,避免了自身免疫的風(fēng)險(xiǎn)[7]。新生抗原是由脫氧核苷酸(deoxyribonucleic acid,DNA)損傷和/或DNA修復(fù)機(jī)制的隨機(jī)錯(cuò)誤引起的零星突變的結(jié)果,且腫瘤的新生抗原不能在患者之間共享,這意味著每個(gè)癌癥患者都有其獨(dú)特的基因突變,這一個(gè)體特異性特征將新生抗原與個(gè)體間共享的其他腫瘤抗原區(qū)分開來[5]。新生抗原在正常組織中表達(dá)很少或沒有表達(dá),這預(yù)示著新生抗原可能是免疫治療的潛在靶點(diǎn),具有高特異性、高有效性和高安全性[9-10]。

注:任何形式的基因組不穩(wěn)定都可能導(dǎo)致新生抗原的產(chǎn)生。通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工,多肽與MHC結(jié)合,組裝的p-MHC遞呈至細(xì)胞表面誘導(dǎo)T細(xì)胞的激活。圖1 新生抗原的來源示意圖

2 新生抗原的優(yōu)勢(shì)與不足

隨著對(duì)腫瘤免疫治療的認(rèn)識(shí),人們發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生持久抗腫瘤反應(yīng)的淋巴細(xì)胞大多針對(duì)突變基因產(chǎn)生的新生抗原。細(xì)胞介導(dǎo)免疫是抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要機(jī)制。在這個(gè)過程中,體細(xì)胞突變產(chǎn)生突變抗原,這些抗原加工成肽,然后該肽與主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)結(jié)合,組裝好的肽-MHC (peptide-MHC,p-MHC)被呈現(xiàn)至細(xì)胞表面,誘導(dǎo)T細(xì)胞啟動(dòng)和激活。T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)和p-MHC的相互作用,特異性識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞。新生抗原被識(shí)別后,腫瘤細(xì)胞被腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)殺死[6]。

由于新生抗原在免疫反應(yīng)中的特殊性,其在免疫治療中的潛在預(yù)測(cè)價(jià)值引起了許多人的興趣,并開展了各種各樣的研究。越來越多的證據(jù)證明,新生抗原與延長(zhǎng)患者生存期相關(guān),新生抗原可以成為預(yù)測(cè)ICIs療效的生物學(xué)標(biāo)志物[11]。關(guān)于新生抗原的不足主要為檢測(cè)技術(shù)的敏感性低和細(xì)胞用量大[12-15]。對(duì)于無法手術(shù)的晚期腫瘤患者,穿刺所獲得的新鮮腫瘤組織可能無法獲得足夠的細(xì)胞量以檢測(cè)新生抗原[12]。

3 新生抗原的檢測(cè)方法

新生抗原是腫瘤細(xì)胞中突變基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯,包括編輯和修飾,合成的多肽,然后新生抗原被MHC分子識(shí)別,在細(xì)胞表面加工表達(dá),最后遞呈給T細(xì)胞。T細(xì)胞受體識(shí)別特異性p-MHC復(fù)合體(MHC Ⅰ呈現(xiàn)給CD8+T細(xì)胞,MHC Ⅱ呈現(xiàn)給CD4+T細(xì)胞),然后誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞擴(kuò)增和免疫應(yīng)答。概括地說,對(duì)新生抗原的檢測(cè)需要通過3個(gè)條件:突變(單個(gè)氨基酸突變、移碼突變、基因融合、可變剪切、熱點(diǎn)突變等),特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答,加工遞呈(腫瘤細(xì)胞將突變蛋白加工、遞呈給MHC,以p-MHC的形式存在于細(xì)胞膜表面)。其中關(guān)鍵的步驟是如何驗(yàn)證新生抗原的免疫原性、特異性反應(yīng)和能否被內(nèi)源性加工遞呈。由于不是所有的非同義突變都能產(chǎn)生T細(xì)胞識(shí)別的產(chǎn)物,而且免疫原性也不一致,因此識(shí)別能引起免疫反應(yīng)的新生抗原具有很高的價(jià)值[16]。通過下一代測(cè)序(next-generation sequencing,NGS)發(fā)現(xiàn)腫瘤突變,然后通過生物信息法預(yù)測(cè)新抗原,最后采用傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法篩選和證明新抗原。目前有兩種檢測(cè)方法:間接檢測(cè)法和直接檢測(cè)法[7,12-15,17-22]。見圖2。

注:直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法。圖2 新生抗原的檢測(cè)示意圖

3.1間接檢測(cè)法 Robbins等[17]在TIL療法的研究中曾報(bào)道過新生抗原的檢測(cè)方式,主要分為五步:外顯子測(cè)序腫瘤原代細(xì)胞系、突變分析、預(yù)測(cè)特定HLA與突變抗原結(jié)合的親和性、合成親和力高的肽、T細(xì)胞反應(yīng)分析。該學(xué)者首先將測(cè)序與突變分析的基因序列用生物學(xué)信息軟件NetMHCPan 2.4(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)進(jìn)行親和力預(yù)測(cè),將親和力高的肽加載至抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APC),與回輸?shù)腡IL細(xì)胞共育,然后用ELISA法檢測(cè)IFN-γ識(shí)別出能刺激TIL特異性反應(yīng)的肽,這是對(duì)突變肽免疫原性評(píng)價(jià)。進(jìn)一步對(duì)特異性反應(yīng)檢測(cè),尋找基因的突變位點(diǎn),分別轉(zhuǎn)錄、翻譯野生型肽與突變型肽。隨著APC加載肽的濃度增加,具有特異性反應(yīng)的突變肽可以刺激TIL細(xì)胞產(chǎn)生更多的IFN-γ,而野生型肽無法檢測(cè)出增加的IFN-γ。進(jìn)一步將APC轉(zhuǎn)染具有突變基因的表達(dá)質(zhì)粒,與TIL共育,檢測(cè)IFN-γ以驗(yàn)證突變抗原能否被內(nèi)源性加工提呈。通過上述步驟,Robbins等[17]識(shí)別出至少3種新生抗原。間接檢測(cè)法可以概括為以下幾步:首先,通過腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的全基因組測(cè)序或外顯子測(cè)序識(shí)別腫瘤中的非同義突變(non-synonymous mutation,NSM),并將其作為候選新生抗原,其中RNA測(cè)序可以作為反向鑒定的替代方法。然后根據(jù)候選新生抗原的免疫原性進(jìn)行進(jìn)一步篩選,將TIL與第一步識(shí)別的非同義突變合成的所有候選新生抗原共培養(yǎng)。候選新生抗原的免疫原性可以通過評(píng)估T細(xì)胞的反應(yīng)來確定。這種方法主要適用于突變數(shù)量有限的腫瘤。通過現(xiàn)有的預(yù)測(cè)算法可以篩選出與MHC分子更有親和力的多肽,該算法可以根據(jù)肽加工、運(yùn)輸和與MHC Ⅰ結(jié)合步驟的生化和生物物理特性,優(yōu)先考慮更有可能出現(xiàn)在MHC Ⅰ上的候選多肽。因此,現(xiàn)有的預(yù)測(cè)算法大多是針對(duì)MHC Ⅰ限制性肽的預(yù)測(cè)。雖然預(yù)測(cè)算法已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步,但由于預(yù)測(cè)算法不能將影響免疫原性的所有因素都考慮在內(nèi),預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性還需要進(jìn)一步提高[7,12-13]。另一方面,這些算法建立在每個(gè)開發(fā)人員設(shè)置的特征的基礎(chǔ)上,因此最終的結(jié)果可能不一致。如何協(xié)調(diào)和建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),仍然是一個(gè)有待解決的問題。

3.2直接檢測(cè)法 體內(nèi)T細(xì)胞通過TCR識(shí)別p-MHC發(fā)揮免疫作用,MHC結(jié)合的肽是T細(xì)胞治療最核心的靶點(diǎn)?；谝合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)可以直接鑒定與MHC分子TCR結(jié)合的肽段。首先將腫瘤細(xì)胞裂解,通過抗MHC抗體富集p-MHC,洗脫與MHC分子結(jié)合的肽段,然后鑒定被洗脫肽段的氨基酸序列。下一步采用預(yù)測(cè)算法或評(píng)估T細(xì)胞反應(yīng)性以確定候選新生抗原的免疫原性,并確定真正的免疫原性新生抗原[14-15,22]。通過質(zhì)譜方式獲得抗原,極大地提高了MHC Ⅰ類新生抗原預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,并且通過深度學(xué)習(xí)可以提高M(jìn)HC Ⅱ類新生抗原的準(zhǔn)確性[13-15]。然而,這種方法在實(shí)踐中可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤[7,23]。盡管技術(shù)進(jìn)步很大,但免疫治療的預(yù)測(cè)對(duì)新生抗原的準(zhǔn)確識(shí)別有更高的要求。

4 新生抗原的臨床應(yīng)用

新生抗原的腫瘤治療性疫苗有多種形式,如肽疫苗、RNA疫苗、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)疫苗。新生抗原疫苗可以誘發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)[24-25]。在過繼性細(xì)胞免疫(adoptive cell transfer,ACT)治療領(lǐng)域,通過篩選新生抗原可發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞靶點(diǎn),并在取得不錯(cuò)的療效[18,20-21]。首個(gè)報(bào)告的新生抗原的T細(xì)胞受體(neoantigen-specific TCR,neoTCR)的細(xì)胞療法臨床研究已證明了其安全性[19],其他多種實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)如NCT03412877還在進(jìn)行中。

5 總結(jié)與展望

由于腫瘤免疫療法的療效僅限于一部分腫瘤患者,并且免疫治療可能誘發(fā)免疫相關(guān)不良事件,為了克服這些限制,識(shí)別ICIs的預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)志物迫在眉睫。本文討論的新生抗原是一種新的潛在的腫瘤免疫治療預(yù)測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物。新生抗原可能會(huì)是免疫治療的關(guān)鍵所在,筆者介紹了目前新生抗原識(shí)別的方法和技術(shù)。然而,在實(shí)際應(yīng)用中,新生抗原的動(dòng)態(tài)變異和潛在新生抗原的識(shí)別等障礙尚未克服,基于NGS和數(shù)據(jù)庫(kù),建立和優(yōu)化多種新生抗原預(yù)測(cè)算法是必不可少的。