血清LDH、TIMP1、BLC、Eotaxin2預(yù)測(cè)骨髓增殖性腫瘤患者骨髓纖維化程度的效能*

陳禾惠,王沖,陳樸,于正麟,馬艷婷,陳楠,潘柏申,王蓓麗,郭瑋(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200032)

骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)作為一種慢性遷延性疾病,確診患者需長(zhǎng)期隨訪,監(jiān)測(cè)進(jìn)展[1]。骨髓纖維化(myelofibrosis, MF)是MPN發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中最主要的并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及預(yù)后,故而早期發(fā)現(xiàn)纖維化并及時(shí)干預(yù)意義重大。目前骨髓纖維化診斷主要依賴于骨髓活檢,但是骨髓穿刺創(chuàng)傷性大,患者依從性較差,且臨床表現(xiàn)較為隱匿,部分患者因錯(cuò)過(guò)最佳的干預(yù)時(shí)機(jī)導(dǎo)致預(yù)后較差,這進(jìn)一步凸顯了篩選便捷、可靠的血清學(xué)預(yù)測(cè)指標(biāo)的迫切性及重要性。

近年來(lái)研究表明,炎癥與MPN發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期通過(guò)細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MPN患者血漿中的金屬蛋白酶組織抑制劑1(the tumor inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP1)、B淋巴細(xì)胞趨化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子2(Eotaxin2)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor, M-CSF)及可溶性細(xì)胞間黏附分子(soluble intercellular adhesion molecule-1, sICAM-1)均顯著高于健康人對(duì)照組,且與其在骨髓上清中的表達(dá)水平具有良好的相關(guān)性,可作為潛在的分子靶標(biāo)[2]。既往研究[3-5]表明,TIMP1、BLC及Eotaxin2在肺、肝等多種組織器官的纖維化進(jìn)程中具有促進(jìn)作用。此外,作為MPN重要的血清學(xué)預(yù)后評(píng)估指標(biāo),乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)在MPN患者中與腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)[6-7]。因此,本研究通過(guò)對(duì)MPN患者的上述血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),探索其在骨髓纖維化進(jìn)展及監(jiān)測(cè)中的作用。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2017年7月至2018年12月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科確診為費(fèi)城染色體陰性(Philadelphia-nagetive,Ph-)MPN患者40例,男24例,女16例,年齡(59.8±10.2)歲。包括真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera,PV)9例、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia,ET)15例和原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis,PMF)16例。納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2016年BCR-ABL陰性MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]確診為MPN且伴有JAK2V617F,JAK2EXON12,MPLW515L/K,CALR等突變。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)Ph或BCR-ABL融合基因陽(yáng)性;(2)確診前接受過(guò)臨床治療;(3)伴有其他血液疾病或其他纖維化疾病;(4)研究資料不完整。根據(jù)WHO 2016年骨髓纖維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]分為纖維化前/早期組(MF-0和MF-1級(jí))24例,明顯纖維化期組(MF-2和MF-3級(jí))16例。另選取同期體檢健康者20例作為健康人對(duì)照組,其中男10例,女10例,年齡(56.9±5.6)歲。MPN患者及健康人對(duì)照組間的性別(χ2=1.497,P>0.05)、年齡(t=1.184,P>0.05)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):B2022-516R),患者及家屬知情同意。

1.2樣本采集 采集MPN患者治療前(體檢健康者于體檢時(shí)采集)的空腹外周靜脈血5 mL于含二氧化硅及分離膠的真空采血管中,待自然凝固后,1 500×g離心10 min,分離血清1 mL于離心管中,其余血液樣本置于-80 ℃保存。

1.3儀器與試劑 cobas c702全自動(dòng)生化分析儀及配套的LDH試劑盒(瑞士羅氏公司),RayBio?人TIMP1/Eotaxin2/BLC ELISA試劑盒(美國(guó)RayBiotech公司),ST-360酶標(biāo)儀(上?？迫A生物公司),TS-1脫色搖床(海門市其林貝爾公司),Sysmex XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套的血常規(guī)檢測(cè)試劑(日本希森美康公司)。

1.4血清TIMP1、Eotaxin2、BLC水平檢測(cè) 基于ELISA法,按照RayBio?人TIMP1/Eotaxin2/BLC ELISA試劑盒及說(shuō)明書(shū)操作,通過(guò)ST-360酶標(biāo)儀讀取吸光度(A)值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各組血清TIMP1、Eotaxin2、BLC的濃度。TIMP1參考區(qū)間:40～18 000 pg/mL,Eotaxin2參考區(qū)間:2～1 000 pg/mL,BLC參考區(qū)間:1.5～1 000 pg/mL。

1.5血清LDH測(cè)定 基于速率法,按照cobas c702全自動(dòng)生化分析儀及配套的LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)各組血清LDH水平。LDH參考區(qū)間:109.0～245.0 U/L。

1.6紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(Hb)測(cè)定 按照Sysmex XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套的血常規(guī)檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)操作,基于電阻抗法檢測(cè)參數(shù)RBC和PLT,基于光電比色法檢測(cè)Hb水平。RBC參考區(qū)間:(4.3～5.8)×1012/L,PLT參考區(qū)間:(125～350)×109/L,Hb參考區(qū)間:130～175 g/L。

2 結(jié)果

2.1各組血清學(xué)及血常規(guī)指標(biāo)比較結(jié)果 MPN患者血清LDH、TIMP1、BLC、Eotaxin2水平及PLT顯著高于健康人對(duì)照組,但RBC、Hb在兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。進(jìn)一步進(jìn)行亞組間的分析結(jié)果表明,明顯纖維化期組患者血清LDH、TIMP1顯著高于纖維化前/早期組,而血清BLC、Eotaxin2及RBC、Hb、PLT在兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表1 MPN組及健康人對(duì)照組血清學(xué)及血常規(guī)指標(biāo)比較結(jié)果

表2 纖維化前/早期組與明顯纖維化期組血清學(xué)及血常規(guī)指標(biāo)比較結(jié)果

2.2各指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果 MPN患者血清TIMP1、BLC、Eotaxin2水平與RBC、Hb、PLT均無(wú)相關(guān)性(P>0.05),而血清LDH與RBC(r=-0.353 6,P=0.025 2)、Hb(r=-0.505 7,P=0.000 9)呈負(fù)相關(guān)性。進(jìn)一步進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清LDH(r=0.588 6,P<0.000 1)、TIMP1(r=0.482 4,P=0.001 6)、BLC(r=0.315 8,P=0.047 1)與MPN患者M(jìn)F分級(jí)呈正相關(guān)性。見(jiàn)表3。

表3 MPN患者血清學(xué)指標(biāo)與血常規(guī)指標(biāo)及MF分級(jí)的相關(guān)系數(shù)(r)

2.3血清學(xué)指標(biāo)對(duì)MPN患者骨髓纖維化的預(yù)測(cè)效能分析 選取在纖維化前/早期組與明顯纖維化期組間差異最為顯著的LDH、TIMP1,通過(guò)二元Logistic回歸分析二者聯(lián)合預(yù)測(cè)因子的計(jì)算公式:LDH、TIMP1聯(lián)合預(yù)測(cè)因子=0.004×TIMP+10.008×LDH-8.153。以纖維化前/早期組為對(duì)照組,明顯纖維化期組為疾病組,繪制ROC曲線并評(píng)估各指標(biāo)對(duì)MPN患者骨髓纖維化程度的預(yù)測(cè)價(jià)值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清LDH、TIMP1單獨(dú)及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)因子對(duì)MPN患者骨髓纖維化程度預(yù)測(cè)效能較佳,而血清BLC、Eotaxin2預(yù)測(cè)效能較差(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表4。

圖1 血清LDH、TIMP1單獨(dú)及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)骨髓纖維化程度的ROC曲線

表4 血清學(xué)指標(biāo)在MF分級(jí)鑒別中的價(jià)值

3 討論

骨髓纖維化是MPN患者疾病進(jìn)展過(guò)程中的嚴(yán)重不良事件,目前臨床上缺乏有價(jià)值的骨髓纖維化篩查的血清學(xué)標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,MPN患者血清TIMP1、BLC、Eotaxin2及LDH的表達(dá)水平顯著高于健康人對(duì)照組,明顯纖維化期組血清LDH、TIMP1的表達(dá)水平顯著高于纖維化前/早期組。結(jié)合ROC曲線分析提示,LDH、TIMP1單獨(dú)及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)因子具有作為骨髓纖維化進(jìn)展輔助篩查標(biāo)志物的潛能。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),血清LDH、TIMP1、BLC、Eotaxin2在MPN患者中呈高表達(dá),且LDH、TIMP1與MF分級(jí)呈正相關(guān)。Wang等[9]研究證實(shí),TIMP1在MPN患者血清中的表達(dá)水平升高,引起基質(zhì)蛋白合成與降解平衡紊亂,導(dǎo)致纖維化發(fā)生,與本研究結(jié)果相一致。Murate等[10]發(fā)現(xiàn), MPN患者TIMP1水平升高且與PLT呈正相關(guān),并證實(shí)TIMP1與來(lái)源于骨髓內(nèi)異常增殖的巨核細(xì)胞和血小板有關(guān),從而進(jìn)一步促進(jìn)骨髓纖維化形成。本研究發(fā)現(xiàn)血清TIMP1與PLT無(wú)明顯相關(guān)性,分析原因可能是由于納入患者的地域不一致所致,有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行探究。LDH是MPN預(yù)后判斷的重要指標(biāo),Zulkeflee等[11]發(fā)現(xiàn)LDH在MPN患者血清中升高,并證實(shí)與患者腫瘤細(xì)胞惡性增殖程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果亦證實(shí),LDH水平升高與患者貧血、骨髓纖維化進(jìn)展有關(guān),和Shah等[12]發(fā)現(xiàn)的LDH水平升高與MPN患者不良事件的發(fā)生密切相關(guān)結(jié)果相一致。另有研究證實(shí),BLC、Eotaxin2升高在促進(jìn)肺、肝等纖維化進(jìn)展中具有重要作用[4-5]。筆者發(fā)現(xiàn)BLC、Eotaxin2在MPN患者中的表達(dá)水平升高,但與骨髓纖維化嚴(yán)重程度無(wú)關(guān),分析原因可能是由于纖維化組織類型的差異造成,但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本研究進(jìn)一步通過(guò)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),血清LDH、TIMP1在MPN患者骨髓纖維化進(jìn)展中具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。目前針對(duì)骨髓纖維化進(jìn)展監(jiān)測(cè)的血清學(xué)標(biāo)志物研究較少,僅Yokus等[13]發(fā)現(xiàn)60歲以上MF患者血清鐵蛋白水平與MF分級(jí)呈正相關(guān)。筆者發(fā)現(xiàn)血清LDH、TIMP1可以預(yù)測(cè)MPN患者的骨髓纖維化嚴(yán)重程度,這與既往研究中證實(shí)的LDH、TIMP1在肺、肝纖維化診斷和預(yù)測(cè)中的作用基本一致[14]。本研究還發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合應(yīng)用的預(yù)測(cè)效能更佳,故而建議對(duì)血清LDH、TIMP1聯(lián)合預(yù)測(cè)因子升高的MPN患者,及時(shí)給予干預(yù),抑制骨髓纖維化的進(jìn)展,提高患者預(yù)后生存狀態(tài)。

本研究尚存在一定的局限性。首先,本研究入組樣本量偏小,且為單中心研究,后續(xù)研究中需擴(kuò)充樣本量,并進(jìn)行多中心研究,以評(píng)估其對(duì)MPN骨髓纖維化程度的預(yù)測(cè)效能;其次,本研究未對(duì)MPN各亞型間進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的比較,其在MPN亞型鑒別診斷中的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。