扶正化瘀解毒湯調(diào)控ITGB3-Ras軸對(duì)人前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

周仕軼，尤耀東，趙濤，龔艷菊，張國臣，邵繼春▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075；3.成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院/核工業(yè)四一六醫(yī)院 泌尿外科，四川 成都 610051)

前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)一直是歐美國家的高發(fā)病率和高死亡率腫瘤，2021年美國PCa預(yù)計(jì)新增發(fā)病例數(shù)為第1位，已超過肺癌成為男性第一高發(fā)腫瘤，預(yù)計(jì)新增死亡例數(shù)也上升到第2位[1]。近年來，隨著早期診斷和篩查技術(shù)的普及，我國PCa的早期診斷率不斷提高，因此發(fā)病率也不斷增高[2-3]，同時(shí)也為PCa早期治療和轉(zhuǎn)移防治提供了機(jī)會(huì)。目前，雖然醫(yī)學(xué)界在PCa的治療方面已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，根治性前列腺切除術(shù)、雄激素剝奪治療和放射治療是控制原發(fā)性前列腺癌的主要治療策略，可顯著降低前列腺癌患者的死亡率，延長患者的壽命[4]。然而轉(zhuǎn)移性PCa臨床預(yù)后較差，甚至在1-2年內(nèi)進(jìn)展為去勢(shì)耐藥性PCa，且對(duì)靶向治療表現(xiàn)出耐藥性，并對(duì)免疫治療不敏感。因此，進(jìn)一步研究PCa進(jìn)展的分子機(jī)制，探索控制PCa轉(zhuǎn)移和治療轉(zhuǎn)移性PCa的新治療策略具有重要意義。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥已經(jīng)經(jīng)歷了數(shù)千年的應(yīng)用與驗(yàn)證，在某些情況下，傳統(tǒng)中醫(yī)藥已被證明具有良好的抗癌作用。扶正化瘀解毒湯是臨床經(jīng)驗(yàn)方，由人參(Panax ginseng)、姜黃(Curcumae Longae Rhizoma)和腫節(jié)風(fēng)(Sarcandra Glabra)三種天然草藥組成。本課題組已經(jīng)分別證實(shí)了該方的三個(gè)藥物的復(fù)方、單味藥物或有效成分對(duì)PCa的腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用，提示扶正化瘀解毒湯可能是一種有前途的治療PCa的臨床方案。該方中的每種成分都已被證明具有一定的抗癌活性，但其分子機(jī)制尚不清楚。

研究表明整合素家族在PCa的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中具有重要調(diào)控作用，其中ITGB3是目前研究最多的家族成員。作為細(xì)胞表面黏附受體，它參與了包括PCa在內(nèi)的腫瘤代謝、腫瘤免疫環(huán)境構(gòu)建和促使腫瘤發(fā)生EMT，從而促使腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，它被認(rèn)為是腫瘤微環(huán)境中最具有研究價(jià)值的家族成員[5]。研究表明，在PCa組織中Ras致癌突變表達(dá)水平較正常前列腺組織顯著增高，且Ras致癌突變高表達(dá)患者更易于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時(shí)與PCa的EMT進(jìn)程發(fā)生密切相關(guān)[6]。而ITGB家族則被證實(shí)是Ras的上游激活機(jī)制之一[7]。本研究擬通過觀察扶正化瘀解毒湯對(duì)人PCa細(xì)胞腫瘤生物學(xué)的影響和對(duì)細(xì)胞ITGB3-Ras信號(hào)軸(通路)的調(diào)控作用，從而探明其治療PCa和控制PCa轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 扶正化瘀解毒湯含有以下成分：人參200 g，姜黃100 g，腫節(jié)風(fēng)100 g，均購自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。為獲得該方粗提物，將三種原料粉碎成粗粉，用10倍的70%乙醇浸泡30 min，孵育1 h。將分離后的殘留物提取兩次。在減壓條件下(真空設(shè)置為-0.06-0.08 mPa，蒸餾溫度40-50°C，冷凝溫度0°C)，將三種提取物混合并濃縮成液體萃餾物(蒸餾物重量超過提取物的98%)。隨后，將總體積調(diào)整到400 mL。該方的最終儲(chǔ)存濃度為1 g/mL。

1.1.2 動(dòng)物、細(xì)胞 Spague-Dawley雄性大鼠(150-180 g)和C57BL/6J雄性小鼠(20-22 g)購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002)。動(dòng)物飼養(yǎng)在恒溫環(huán)境中(22±1)°C，12 h光/暗周期，自由獲取水和飼料。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)：2021 DL-099)。人PCa細(xì)胞系LNCaP、DU-145、PC-3和RM-1細(xì)胞以及正常前列腺細(xì)胞系WPMY-1均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

1.1.3 試劑 RPMI-1640、DMEM、青霉素/鏈霉素購自Gibco，10%胎牛血清購自Hyclone，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(稀釋1∶5000)購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，TRIZOL、Lipofectamine 2000和3000試劑購自Invitrogen，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Mix購自TAKARA。ITGB3-質(zhì)粒由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。兔抗-ITGB3(ab182773，稀釋 1∶1 000)、兔抗-Claudin 1(ab129119，稀釋 1∶1 000)、兔抗-Zeb1(ab203829，稀釋 1∶500)、兔抗-β actin(ab179467，稀釋 1∶5 000)購自英國Abcam公司。小鼠抗-E Cadherin(14472，稀釋 1∶1 000)、兔抗-Snail(3879，稀釋1∶1 000)、兔抗-Ras(3965,稀釋 1∶1 000)購自美國Cell Signaling公司。

1.1.4 儀器 超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad ChemiDoc)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad CFX Conect)，數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海天能EPS-300)，生物安全柜(美國Thermo 1384)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(新加坡ESCO CCL-170T-8)，高效液相色譜儀(安捷倫Agilent1260infinity Ⅱ)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LNCaP、DU-145、PC-3、RM-1、WPMY-1細(xì)胞采用含10%胎牛血清和10 mL/L青霉素/鏈霉素的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物含藥血清制備 參照同類方劑實(shí)驗(yàn)方法，將12只Spague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為給藥組(Fu)和空白組(Ctrl)(每組6只)。將上述扶正化瘀解毒湯提取物(1 g/mL)3 mL稀釋至10 mL，給藥組口服稀釋液10 mL/kg，2次/d，原生藥量6 g/kg。空白組被給予相同量的生理鹽水。連續(xù)給藥5 d后，40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，56°C滅活40 min，在-80°C下保存，用于后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)[8]。

1.2.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 采用MTT法檢測(cè)扶正化瘀解毒湯含藥血清對(duì)PC-3、DU-145、LNCaP和WPMY-1細(xì)胞系的增殖抑制作用。分別將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(3 000個(gè)/孔)，加入不同倍數(shù)(1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160)稀釋的血清孵育48 h，每孔加入20 μL MTT/PBS溶液(5 mg/mL)。孵育4 h后，除去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，再孵育30 min。振蕩器搖勻培養(yǎng)板，使用酶標(biāo)儀在490 nm讀取吸光度。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)每次3復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4 集落形成試驗(yàn) 將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(500個(gè)/孔)，與1∶20的扶正化瘀解毒湯血清孵育14 d(血清稀釋比例選擇見結(jié)果2.2，1∶20抑瘤效果顯著)。集落用Giemsa染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。將含有>50細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)被認(rèn)定為形成集落。

1.2.5 細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn) 使用Transwell小室進(jìn)行體外細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn)[9]。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel膠(1∶3)加入Transwell小室，37℃孵育4 h后將細(xì)胞接種于上室。48 h后，刮掉小室上部的細(xì)胞。濾膜用結(jié)晶紫染色，用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)黏附在濾膜底部的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，即：6孔板每孔加入1 mL TRIZOL充分裂解細(xì)胞后，加入200 μL氯仿，劇烈搖晃15 s，靜置分層后12 000 g低溫離心15 min，吸取上層水相RNA，加入等量異丙醇，輕輕晃勻，靜置10 min，12 000 g低溫離心10 min，棄上清后加入1 mL75%乙醇洗滌，7 500g低溫離心5 min，棄上清干燥沉淀，加入50 μL DEPC水溶解RNA。Nanodrop測(cè)定濃度后每個(gè)樣本取1 μg RNA，按試劑盒說明書加入DNA Eraser及緩沖液42°C 孵育2 min去除基因組DNA，再加入PrimeScriptRT Enzyme Mix及緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物37°C孵育15 min，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR法對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行qPCR，引物序列見表1。按試劑盒說明書配制體系，每孔加入1 μL cDNA，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。95°C變性10 s、60°C退火30 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)得到Ct值。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測(cè) 在 SDS 裂解液中(2% SDS，50 mmol/L Tris-HCl pH6.8，0.1% BME，10% 甘油)加入蛋白酶抑制劑混合物，制備全細(xì)胞裂解物。使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，SDS-PAGE每孔上樣量相等(30-60 μg)，轉(zhuǎn)印到 PVDF 膜上后用封閉1 h，相應(yīng)的一抗進(jìn)行孵育：兔抗-ITGB3，鼠抗-E Cadherin，兔抗-Claudin 1，兔抗-Snail，兔抗-Zeb1，兔抗-Ras。一抗在4°C下孵育過夜。多次洗滌后，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗37°C孵育2 h，洗滌后ECL成像。

1.2.8 ITGB3的沉默和過表達(dá) 使用shRNA(序列5’-CCGCTTCAATGAGGAAGTGAA-3’)沉默ITGB3[10]，ITGB3質(zhì)粒過表達(dá)ITGB3。DU-145和PC-3在無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%-80%的密度，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染shRNA(100 nM)，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染ITGB3質(zhì)粒和對(duì)照空載體。轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)相應(yīng)基因和蛋白的變化。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)每次3復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.9 動(dòng)物模型和體內(nèi)腫瘤抑制試驗(yàn) 依據(jù)已有同類研究方法，共將5105 RM-1前列腺腫瘤細(xì)胞注射到C57BL/6J雄性小鼠右側(cè)腹部皮下[11]。24 h后，將小鼠隨機(jī)分為兩組(每組n=5)。對(duì)照組經(jīng)口灌胃生理鹽水10 mL/kg，2次/d。扶正化瘀解毒湯組經(jīng)口灌胃1 g/mL提取物6 g/kg。共給藥20 d。第21天頸椎脫臼法處死動(dòng)物，分離皮下腫瘤并稱重計(jì)算腫瘤大小。隨后，根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積(cm3)=(長×寬2)/2，其中長和寬分別為每個(gè)腫瘤的最長直徑和最短直徑。

1.2.10 iTRAQ分析 將用扶正化瘀解毒湯血清處理的PC-3細(xì)胞與空白組血清處理的PC-3細(xì)胞分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，然后用RIPA裂解液裂解。將裂解的細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面刮入1.5 mL的Eppendorf管中，用微型手持勻漿器進(jìn)行機(jī)械勻漿。在4°C、12 000 g下轉(zhuǎn)離心30 min收集上清。使用Bio-Rad RCDC蛋白測(cè)定法測(cè)定每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)含量，樣品在-80°C條件下等量保存。樣品用iTRAQ試劑(BGI)標(biāo)記，分析該方血清處理誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)譜變化。在標(biāo)記之前，每個(gè)細(xì)胞系中的100 mg蛋白質(zhì)被還原，烷基化，然后用胰蛋白酶消化。將標(biāo)記的樣品合并，真空蒸發(fā)，并在-20°C下保存，然后使用強(qiáng)陽離子交換液相色譜(SCX HPLC)進(jìn)行分離處理。根據(jù)其功能和生物學(xué)過程，對(duì)這些基因集進(jìn)行了分析和富集。當(dāng)P值為<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.11 高效液相色譜分析(High-performance Liquid Chromatography，HPLC) 3種標(biāo)準(zhǔn)純化學(xué)品購買自中國食品藥品檢定研究院(National Institutes for Food and Drug Control)。姜黃有效成分姜黃素(Curcumin)批號(hào)為110823-201706(含量98.7%)，腫節(jié)風(fēng)有效成分迷迭香酸(Rosmarinic acid)批號(hào)為111871-201706(含量98%)，人參有效成分人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3)批號(hào)為110804-201504(含量99.5%)。姜黃素的HPLC分析：采用Kromasil C184.6 mm×250 mm；5 μm高效液相色譜柱進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相由乙腈和4%冰醋酸組成(體積比48∶52)。柱溫設(shè)置為30°C。對(duì)照樣品稀釋至10 μg/mL，扶正化瘀解毒湯提取液稀釋至4 mg/mL。進(jìn)樣量為5 μL,洗脫速率為1 mL/min,檢測(cè)波長設(shè)置為430 nm。迷迭香酸的HPLC分析：采用Kromasil C184.6 mm×250 mm；5 μm高效液相色譜柱進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相由乙腈和0.1%的磷酸組成(體積比為20∶80)。柱溫設(shè)置為30°C。將對(duì)照樣品稀釋至10 μg/mL,該方提取液稀釋至100 mg/mL。進(jìn)樣量為10 μL，洗脫速率為1 mL/min，檢測(cè)波長設(shè)置為342 nm。人參皂苷Rg3的HPLC分析：采用ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相由乙腈和0.05%的磷酸組成(體積比為37∶63)。柱溫設(shè)置為30°C。將對(duì)照樣品稀釋至0.5 mg/mL，該方提取液稀釋至1 g/mL。進(jìn)樣量為10 μL，洗脫速率為1 mL/min，檢測(cè)波長設(shè)為 203 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

所有數(shù)據(jù)均以平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS V.20.0軟件(IBM公司)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組之間的差異采用非配對(duì)的t檢驗(yàn)和多因素方差分析。P值<0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶正化瘀解毒湯對(duì)PCa皮下移植瘤的作用

通過皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方對(duì)PCa的治療作用。結(jié)果顯示，該方可抑制皮下注射RM-1細(xì)胞小鼠的皮下移植瘤生長，見圖1。與對(duì)照組相比，該方治療組腫瘤體積下降了60.0%，見表2；重量下降54.05%，見表2。上述結(jié)果表明，該方能夠抑制RM-1細(xì)胞體內(nèi)移植腫瘤的生長。

注:其中Ctrl為對(duì)照組,Fu為扶正化瘀解毒湯組

表2 扶正化瘀解毒方對(duì)皮下移植瘤體積和質(zhì)量的影響

2.2 扶正化瘀解毒湯對(duì)PCa細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲的影響

為確定該方血清對(duì)不同惡性程度PCa細(xì)胞系的細(xì)胞活性抑制作用，采用不同濃度的該方大鼠含藥血清干預(yù)LNCaP(低轉(zhuǎn)移潛能)、DU-145(中度轉(zhuǎn)移潛能)和PC-3(高轉(zhuǎn)移潛能)以及正常前列腺細(xì)胞系WPMY-1細(xì)胞24 h。結(jié)果顯示，該方血清對(duì)上述細(xì)胞增殖活性有抑制作用且呈劑量依賴性，見圖2A。值得注意的是，與非癌細(xì)胞系相比，兩種轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞系PC-3和DU-145的細(xì)胞活力下降更為顯著，這表明該方對(duì)轉(zhuǎn)移特性PCa細(xì)胞活性的抑制效應(yīng)。集落形成實(shí)驗(yàn)也表明，低濃度(1∶20)該方血清可抑制PC-3和DU-145細(xì)胞集落形成，如圖2B所示。Transwell結(jié)果表明，該血清還可以抑制PC-3和DU-145細(xì)胞的遷移和侵襲，見圖2C、2D，表3、4。

注:A表示對(duì)各細(xì)胞系體外增殖抑制效應(yīng);B表示對(duì)PC-3和DU-145細(xì)胞集落形成抑制效應(yīng);C表示對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲和遷移的抑制效應(yīng)(物鏡20×,標(biāo)尺=50 μm);D表示對(duì)DU-145細(xì)胞侵襲和遷移的抑制效應(yīng)(物鏡20×,標(biāo)尺=50 μm)

表3 扶正化瘀解毒湯抑制PC-3細(xì)胞生物特性 個(gè)

表4 扶正化瘀解毒湯抑制DU-145細(xì)胞生物特性 個(gè)

2.3 扶正化瘀解毒湯對(duì)PCa腫瘤細(xì)胞ITGB3-Ras信號(hào)通路的影響

上述實(shí)驗(yàn)已表明該方含藥血清能抑制PCa細(xì)胞遷移和侵襲。為了篩選和鑒定參與該方血清誘導(dǎo)的PCa細(xì)胞遷移和侵襲抑制的下游信號(hào)通路，我們采對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能的PCa細(xì)胞系中ITGB3-Ras信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的基礎(chǔ)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與LNCaP細(xì)胞相比，PC-3細(xì)胞間充質(zhì)標(biāo)記物Snail、Zeb1增加，連接相關(guān)蛋白E-Cadherin、Claudin1降低，證明其EMT更高，轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)。而高轉(zhuǎn)移性的PC-3較低轉(zhuǎn)移性的LNCaP細(xì)胞ITGB3、Ras的mRNA水平顯著升高，如表5所示，且蛋白水平也升高，如圖4A所示。

注:A表示KEGG通路富集分析扶正化瘀解毒湯處理PC-3細(xì)胞后的差異蛋白;B表示iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析扶正化瘀解毒湯處理PC-3細(xì)胞后的差異表達(dá)蛋白,右側(cè)為含藥血清處理后的PC-3細(xì)胞蛋白表達(dá)水平,綠色代表相對(duì)對(duì)照組表達(dá)下降,紅色代表相對(duì)對(duì)照組表達(dá)增加

表5 PC-3與LNCaP細(xì)胞的ITGB3-Ras通路基因表達(dá)

為驗(yàn)證ITGB3與Ras的相關(guān)性，在PCa細(xì)胞系中過表達(dá)ITGB3，結(jié)果證明，ITGB3不僅可促進(jìn)LNCaP和PC-3細(xì)胞中RAS蛋白的表達(dá)，還會(huì)激活下游RAS-GTP，見圖4B和4C。這些結(jié)果表明，該方血清抑制PCa細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)理中，ITGB3-Ras信號(hào)通路中發(fā)揮了一定的作用。

注:A表示PC-3與LNCap細(xì)胞的ITGB3-Ras通路蛋白表達(dá);B,C表示過表達(dá)ITGB3后LNCap與PC-3細(xì)胞中Ras和RAS-GTP蛋白表達(dá)

2.5 過表達(dá)ITGB3對(duì)PCa細(xì)胞系轉(zhuǎn)移能力的影響

以上研究結(jié)果已表明，該方血清可能通過下調(diào)ITGB3-Ras軸來抑制PCa細(xì)胞的遷移和侵襲。為了確證ITGB3-Ras信號(hào)通路是否在該方血清誘導(dǎo)的PCa細(xì)胞遷移和侵襲抑制中發(fā)揮作用，我們?cè)赑C-3和DU-145細(xì)胞過表達(dá)ITGB3，檢測(cè)下游相關(guān)蛋白的表達(dá)。過表達(dá)ITGB3增強(qiáng)了Snail、ZEB1的表達(dá)，抑制E-cadherin、Claudin-1的表達(dá)。而過表達(dá)ITGB3與該方血清對(duì)E-cadherin、Snail、ZEB1的效應(yīng)呈負(fù)相關(guān)(雙因素方差分析，P<0.0001)，見圖5A、5B，表6、7。說明ITGB3促進(jìn)了PC-3和DU-145細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，且拮抗了該方血清的治療作用。

注:A表示過表達(dá)ITGB3調(diào)控PC-3細(xì)胞ITGB3-Ras軸相關(guān)蛋白表達(dá);B表示過表達(dá)ITGB3調(diào)控DU-145細(xì)胞ITGB3-Ras軸相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6 沉默ITGB3對(duì)PCa細(xì)胞系轉(zhuǎn)移能力的影響

為驗(yàn)證ITGB3-Ras信號(hào)通路在該方血清誘導(dǎo)的PCa細(xì)胞遷移和侵襲中的特異性，shRNA沉默PCa細(xì)胞中ITGB3基因。ITGB3沉默抑制了PC-3和DU-145細(xì)胞ITGB3-Ras軸，見圖6A和6B，表8、9。shRNA誘導(dǎo)的ITGB3沉默與該方血清對(duì)PC-3和DU-145細(xì)胞抑制遷移和侵襲作用一致，且shITGB3和該方血清的聯(lián)合干預(yù)對(duì)EMT相關(guān)指標(biāo)均顯示出了協(xié)同效應(yīng)(雙因素方差分析，P<0.0001)。這可能是由于ITGB3的不完全敲除或該方的多靶點(diǎn)作用涉及了其他信號(hào)通路。

注:A表示shITGB3調(diào)控PC-3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá);B表示shITGB3調(diào)控DU-145細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

2.7 沉默ITGB3對(duì)PCa細(xì)胞系遷移和侵襲的影響

以上研究結(jié)果已表明，該方血清通過特異性下調(diào)ITGB3-Ras軸來抑制PCa細(xì)胞EMT。為了驗(yàn)證該方血清下調(diào)ITGB3-Ras軸抑制PCa細(xì)胞遷移和侵襲的直接關(guān)系，在PC-3和DU-145細(xì)胞沉默ITGB3，檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力。結(jié)果顯示，shITGB3抑制了PC-3和DU-145細(xì)胞的遷移和侵襲，且對(duì)PC-3細(xì)胞的遷移抑制作用和協(xié)同效應(yīng)更加突出(雙因素方差分析，P<0.001)，見圖7A和7B，表10、11。

注:A表示shRNA沉默PC-3細(xì)胞的ITGB3后,細(xì)胞侵襲和遷移的抑制效應(yīng);B表示shRNA沉默DU-145細(xì)胞的ITGB3后,細(xì)胞侵襲和遷移的抑制效應(yīng);物鏡20×,標(biāo)尺=50 μm

2.8 扶正化瘀解毒湯提取物的有效成分分析

采用HPLC分析方法確定該方提取物中的有效成分。結(jié)果表明，該方提取物中含有姜黃素0.79 mg/mL、迷迭香酸0.16 mg/mL和人參皂苷-Rg368.4 μg/mL(圖8)。

圖8 扶正化瘀解毒湯抽提物的有效成分的HPLC分析

3 討論

PCa目前已經(jīng)是世界范圍的預(yù)期第一高發(fā)男性腫瘤，預(yù)期死亡率也達(dá)到第二位。90%的腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，并且目前針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移都沒有特異性的治療方案，因?yàn)槟[瘤轉(zhuǎn)移從原位癌到遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移瘤是一個(gè)復(fù)雜的過程[12]。臨床研究已經(jīng)證實(shí)，80%的PCa患者都會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[13]，PCa不發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者5年生存率為100%，發(fā)生骨轉(zhuǎn)移則大大降低為29.8%[14]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)PCa治療主要方法是內(nèi)分泌治療，但是PCa總會(huì)進(jìn)展到雄激素非依賴性階段，導(dǎo)致該方案療效無法持續(xù)。其他較為新近的治療方案均有副反應(yīng)或療效尚無法科學(xué)評(píng)價(jià)[15-17]。因此本研究將PCa轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞DU-145和PC-3細(xì)胞作為研究要點(diǎn)，探索中醫(yī)藥療法對(duì)轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞的腫瘤生物特性調(diào)控效應(yīng)和分子機(jī)制。

PCa的發(fā)病年齡多在50歲之后，基本病機(jī)和病性為正氣不足為本，瘀血、痰濁、邪毒為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之病[18]，因此，治療基本原則為扶正祛邪、活血化瘀、清熱解毒。本研究的扶正化瘀解毒湯包括人參、姜黃和腫節(jié)風(fēng)3種中草藥。其中人參為君藥，大補(bǔ)元?dú)?，是扶助正氣，提高免疫力的第一要藥，其主要有效成分為人參皂苷。姜黃為臣藥，活血行氣，臨床廣泛用于血瘀氣滯諸痛癥，其主要成分為姜黃素。腫節(jié)風(fēng)為佐藥，清熱解毒，活血散結(jié)，臨床廣泛用于抗菌消炎和抗腫瘤，其主要成分為迷迭香酸。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)以人參為主要藥物的中成藥得力生注射液對(duì)PCa的DU-145細(xì)胞具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用[9]；姜黃素通過TGF-β及下游蛋白Smad2、Smad4、Smad7的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)DU-145細(xì)胞凋亡和抑制其生長[19]。腫節(jié)風(fēng)能通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制PCa的DU-145細(xì)胞增殖[20-21]。因此，根據(jù)中醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)理論和前期的研究，我們推測(cè)該方可能對(duì)PCa細(xì)胞系的腫瘤生物學(xué)行為具有影響。本研究結(jié)果表明，該方含藥血清對(duì)PCa的腫瘤細(xì)胞的生長活性有抑制作用，高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞PC-3(骨轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞)和DU-145的抑制作用較低轉(zhuǎn)移細(xì)胞LNCaP更加明顯。此外，該方血清可抑制PCa腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。因此，該方血清具有抑制PCa腫瘤細(xì)胞生物行為的效應(yīng)。該方血清也抑制了PCa的RM-1細(xì)胞小鼠皮下移植瘤的增殖。本課題研究也通過HPLC檢驗(yàn)了扶正化瘀解毒湯的中藥的有效成分含量，選擇成分包含人參皂苷Rg3，姜黃素和迷迭香酸，其中姜黃素已被我們前期證實(shí)具有抗PCa功效；人參皂苷Rg3則對(duì)多系統(tǒng)腫瘤具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成，以及解除免疫抑制和促進(jìn)免疫應(yīng)答作用[22]；迷迭香酸則已被證實(shí)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移并促使其凋亡[23]。

整合素(Integrin)是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的跨膜蛋白[24]。該蛋白家族已被證實(shí)與廣泛的生理過程有關(guān)，包括細(xì)胞增殖、分化、衰老和凋亡。目前，已經(jīng)鑒定出超過24種整合素亞型，其中至少8種在PCa中上調(diào)[25-26]，而其中整合素β3(ITGB3)的作用機(jī)制研究較為廣泛。已有研究表明ITGB3可通過黏著斑激酶(FAK)激活以及EMT誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌耐藥[27]。而完全激活的FAK通過兩條途徑激活Ras途徑，一條是磷酸化蛋白和Cas的酪氨酸殘基進(jìn)入Ras途徑激活MAPK，另一條是接頭蛋白Grb2與磷酸化的Src-FAK激酶復(fù)合物所致的磷酸化Tyr397相結(jié)合[28]?；罨腞as與Raf即MAPKKK)結(jié)合成復(fù)合物并將Raf固定于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，進(jìn)一步激活Raf，活化的Raf結(jié)合磷酸化并激活MAPKK，而MAPKK進(jìn)一步激活MAPK，這就構(gòu)成了MAPK通路的三級(jí)活化，激活后的MAPK轉(zhuǎn)位至核內(nèi)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖與分化。并且在PCa骨轉(zhuǎn)移過程中，Ras信號(hào)主要通過激活MEPK、STAT3和PI3K，觸發(fā)NF-κB介導(dǎo)的EMT，從而促進(jìn)其發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[29]。因此，我們認(rèn)為ITGB3-Ras通路與PCa骨轉(zhuǎn)移具有較為密切關(guān)系。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀解毒湯血清可通過下調(diào)ITGB3的表達(dá)來抑制Ras蛋白水平，從而抑制PC-3和DU-145細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性、集落形成、遷移和侵襲能力，進(jìn)而明顯抑制細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)行為，而PC-3細(xì)胞則是公認(rèn)的骨轉(zhuǎn)移來源細(xì)胞。為驗(yàn)證產(chǎn)生上述效應(yīng)的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步進(jìn)行了“回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)”和“沉默實(shí)驗(yàn)”，發(fā)現(xiàn)該方血清與shRNA沉默ITGB3具有類似抑制PC-3和DU-145細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用和協(xié)同作用。而過表達(dá)ITGB3可顯著抑制該方血清的這一作用，這也同時(shí)也表明了ITGB3-Ras軸在PCa的進(jìn)展中起著重要作用。

綜上所述，本研究表明，扶正化瘀解毒湯血清可通過調(diào)控ITGB3-Ras通路，抑制PCa的具有轉(zhuǎn)移特性的PC-3和DU-145細(xì)胞的體外生長、侵襲和遷移，體內(nèi)抑制RM-1小鼠皮下移植瘤的生長。本研究結(jié)果提示，扶正化瘀解毒湯可能是一種很有前途的治療PCa進(jìn)展和阻延其轉(zhuǎn)移的中藥處方，本研究為該方的PCa治療提供了分子基礎(chǔ)，有利于進(jìn)一步推進(jìn)該方的臨床實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用。