膽汁酸替代膽固醇制備鹽酸伊立替康脂質(zhì)體的可行性研究

劉均晶，周濤，胡明浩，徐敏，陳俞辰，陳蓉，葉強

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

脂質(zhì)體具備良好的生物相容性和生物可降解性，被認(rèn)為是理想的藥物載體，常用作抗腫瘤藥物輸送系統(tǒng)，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的意義。脂質(zhì)體的疏水體膜和親水內(nèi)核，分別為包裹親脂性藥物和親水性藥物提供條件，以解決傳統(tǒng)化療藥物溶解性差和毒副作用強等問題[1]。膽固醇在脂質(zhì)體系統(tǒng)里扮演了重要的角色。

膽固醇是脂質(zhì)體重要的組成成分，對脂質(zhì)體的功能和穩(wěn)定性至關(guān)重要。首先膽固醇影響脂質(zhì)體膜的通透性，是影響脂質(zhì)體載藥能力的關(guān)鍵因素。通常磷脂構(gòu)成的脂膜具有高通透性，可使包封的藥物快速泄露，然而僅由磷脂組成的脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差[2-3]，添加適量的膽固醇可使脂質(zhì)體膜保持流動性的同時具備相對剛性及不可滲透性[4]。此外，膽固醇影響磷脂的氧化穩(wěn)定性。脂質(zhì)體常用的磷脂多為不飽和脂肪酸，容易發(fā)生氧化或過氧化反應(yīng)，生成具有生物活性的氧化磷脂、溶血磷脂等物質(zhì)，使脂膜流動性和穩(wěn)定性下降[5]，膽固醇有一定防止磷脂氧化作用[6]。

適量的膽固醇對維持人體正常的生理功能具有重要的意義，但體內(nèi)堆積過多也會影響人體自身的健康。常見的冠心病、動脈粥樣硬化、高脂血癥等疾病均與血清膽固醇水平過高有關(guān)[7-8]。因此在脂質(zhì)體的制備中，研究者不得不注意膽固醇的使用量，設(shè)計一種新型脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)是非常重要的，有學(xué)者已經(jīng)將目光聚焦在膽固醇的替代品上。

傳統(tǒng)脂質(zhì)體由不同比例的磷脂和膽固醇組成，現(xiàn)有利用甾醇[9-10]、中藥皂苷[11]等類似化合物替換脂質(zhì)體中膽固醇的研究。雖然這些已經(jīng)被證實對磷脂雙分子層具有類似膽固醇的作用，并被用作制備非膽固醇脂質(zhì)體的替代品，但這種遞送系統(tǒng)的治療效果尚未得到充分的驗證。膽汁酸類化合物是一類膽固醇衍生物，其結(jié)構(gòu)與膽固醇相似，同時具有類似磷脂的兩親性，可以在溶液中有序化，這為膽汁酸代替或者修飾脂質(zhì)體提供了可能性[12]。膽汁酸是人體肝腸循環(huán)重要的內(nèi)源性物質(zhì)，人體腸道內(nèi)的食物消化每天需要12～32 g膽汁酸，膽汁酸對人體較安全并與人體細(xì)胞膜有較高親和力，是理想的載體材料[13-14]。本文以鹽酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride，CPT-11)為模式藥物，創(chuàng)造性地探索一種新型的納米脂質(zhì)體，研究膽汁酸替代膽固醇的可能性。

1 儀器與材料

1.1 試劑

CPT-11(批號：RFS-Y15211812016，中國成都瑞芬斯生物技術(shù)有限公司)；膽酸(批號：C11707803，成都麥克林生物技術(shù)有限公司)；牛磺熊去氧膽酸(批號：PS210629-01，成都普思生物科技股份有限公司)；卵磷脂(批號：2022040601，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；膽固醇(批號：2020010101，成都市科隆化學(xué)品有限公司)。色譜純乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；三氟乙酸，分析純甲醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；Sephadex G-50葡聚糖凝膠(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 儀器

1260 infinity II型高效液相色譜儀(美國Agilent科技有限公司)；KM-500DE型超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；JEM-1400FLASH透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；Litesizer 500納米粒度及電位分析儀(奧地利Anton Paar公司)；SLK-O3000-S型搖床(美國SCILOGEX公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 CPT-11高效液相色譜(HPLC)測定方法的建立

2.1.1 脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備膽酸-CPT-11脂質(zhì)體溶液(CA-CPT-11-Lip)、CPT-11脂質(zhì)體溶液 (CPT-11-Lip)和空白脂質(zhì)體溶液。將150 mg卵磷脂、30 mg膽固醇和15 mg膽酸稱量到250 mL茄形瓶中，加入20 mL氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液進行超聲處理，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，40℃在真空下除去有機溶劑，直到瓶壁上形成均勻的薄膜。然后將10 mL 0.5 mg/mL的CPT-11水溶液加入到脂質(zhì)體薄膜中，水化1.5 h。將形成的脂質(zhì)體溶液在冰水浴中超聲處理5 min，使其均勻分散，然后依次通過0.45 μm和0.22 μm的微孔膜過濾，即得CA-CPT-11-Lip，4 ℃儲存。同法制備CPT-11-Lip和空白脂質(zhì)體溶液，CPT-11-Lip中不加入膽酸，空白脂質(zhì)體溶液中不加入膽酸和CPT-11。

2.1.2 色譜條件

色譜柱為中譜科技C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%三氟乙酸溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，20% A→80% A)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為371 nm。

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取CPT-11對照品10.00 mg，加甲醇溶于10 mL容量瓶中，超聲溶解，定容，制得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的CPT-11對照品儲備液，依次稀釋成50.00、25.00、10.00、2.00、1.00 μg/mL對照品溶液，備用。

2.1.4 供試品溶液的制備

分別精密移取CA-CPT-11-Lip、CPT-11-Lip和空白脂質(zhì)體溶液0.50 mL至不同的10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，渦旋儀劇烈震蕩，破乳，制得供試品溶液。

2.1.5 專屬性實驗

分別精密移取CPT-11對照品溶液、CA-CPT-11-Lip溶液、CPT-11-Lip溶液、空白脂質(zhì)體溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣并記錄色譜圖。結(jié)果表明(圖1)，脂質(zhì)體中CPT-11達到基線分離且對稱性良好，陰性對照對CPT-11測定無干擾。

圖1 4種樣本HPLC圖

2.1.6 線性關(guān)系考察

將“2.1.3”項下稀釋的對照品溶液進行HPLC分析，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，計算線性回歸方程，得線性回歸方程為Y=42.095X-17.538，r=0.999 9，結(jié)果表明CPT-11在1.02～51.00 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度實驗

精密吸取質(zhì)量濃度為10.00 μg/mL的CPT-11對照品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件測定，重復(fù)進樣5次，計算日內(nèi)精密度，連續(xù)進樣5 d，計算日間精密度，結(jié)果峰面積的RSD分別為1.03%和1.70%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性實驗

取同一批脂質(zhì)體溶液5份，按照“2.1.4”項下供試品溶液制備方法操作并進行含量測定，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為2.34%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9穩(wěn)定性實驗

取“2.1.4”項下供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12，24h進樣20μL，測定并記錄CPT-11的峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.96%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10加樣回收實驗

從同一CA-CPT-11-Lip溶液中精密量取0.5mL的樣品6份，加入限度水平的CPT-11對照品溶液，再加甲醇稀釋至相應(yīng)的濃度，按“2.1.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果回收率為96.53%，RSD為2.71%，表明該方法可行。

2.2 脂質(zhì)體包封率、載藥量的測定方法

采用Sephadex G-50凝膠色譜法分離游離的CPT-11和脂質(zhì)體。層析柱的內(nèi)徑為2.5 cm。Sephadex G-50的裝填高度約為15 cm。脂質(zhì)體的上樣量為1 mL，以純水為洗脫溶劑，流速為0.5 mL/min。將收集到的脂質(zhì)體取0.5 mL于10 mL容量瓶中，甲醇破乳，定容，進行HPLC分析。公式(1)和(2)分別用于計算脂質(zhì)體的包封率(EE)和載藥量(DL)，其中W1為包封的CPT-11含量，W2為加入的CPT-11的量，W為加入的卵磷脂、膽固醇、膽酸、CPT-11的總量。

(1)

(2)

2.3 脂質(zhì)體粒徑、分散性指數(shù)和剪切面(Zeta)電位的測定

取適量CA-CPT-11-Lip和CPT-11-Lip用純凈水稀釋15倍，測定前使用0.22 μm的微孔膜過濾，注入Litesizer 500納米粒度及電位分析儀樣品池中，測定脂質(zhì)體的粒徑，分散性指數(shù)(PDI)和Zeta電位。

2.4 不同比例的膽汁酸-膽固醇脂質(zhì)體的制備

膽汁酸是膽汁的重要活性成分，主要存在形式分為游離型和結(jié)合型兩大類[15]。本文以膽酸(游離型)和?；切苋パ跄懰?結(jié)合型)為代表，探討膽汁酸對脂質(zhì)體的影響。參照“2.1.1”項下脂質(zhì)體制備方法，固定膽汁酸-膽固醇總量為45.00 mg，制備不同比例的膽酸-膽固醇、牛磺熊去氧膽酸-膽固醇的脂質(zhì)體，以EE、DL、粒徑、PDI為評價指標(biāo)，分析不同膽汁酸-膽固醇用量對脂質(zhì)體的影響。結(jié)果膽汁酸占比在1/2～2/1之間，脂質(zhì)體的特征參數(shù)與兩者的比例無關(guān)。與傳統(tǒng)脂質(zhì)體(序號1)相比，膽酸的加入小幅度降低了脂質(zhì)體的EE，但減小了粒徑和PDI；?；切苋パ跄懰岬募尤雽E影響較小，增大了粒徑，減小了PDI。膽酸與?；切苋パ跄懰嵯啾?，脂質(zhì)體的粒徑和PDI指數(shù)更小，并且重現(xiàn)性更好(標(biāo)準(zhǔn)差更小)。另外，不含膽固醇的脂質(zhì)體組(序號5、9)，雖然顯示出了替代膽固醇的可能性，但是穩(wěn)定性差，三天內(nèi)有沉淀析出。未來關(guān)于膽汁酸在脂質(zhì)體中位置、作用和毒效關(guān)系值得更升入的研究(見表1)。

表1 不同膽汁酸/膽固醇用量對脂質(zhì)體的影響

2.5 Box-Behnken實驗設(shè)計法(BBD)優(yōu)化脂質(zhì)體處方工藝

選擇膽酸作為輔料，固定膽酸用量為15.00 mg，采用Box-Behnken 12軟件對卵磷脂的用量、卵磷脂-膽固醇的用量比和CPT-11的用量進行設(shè)計和優(yōu)化。實驗結(jié)果以EE和DL為評價指標(biāo)，并對結(jié)果進一步使用方差分析。優(yōu)化的相關(guān)數(shù)據(jù)見表2-表5，對EE(見表4)和DL(見表5)的單因素方差分析結(jié)果顯示，模型P<0.01，失擬項P>0.05，表明該模型可用于優(yōu)化工藝預(yù)測，具有適用價值。

表2 響應(yīng)面因素水平設(shè)計 mg

表3 BBD結(jié)果

表4 EE方差分析結(jié)果

注：*P<0.05，**P<0.01

表5 DL方差分析結(jié)果

注：*P<0.05，**P<0.01

通常脂質(zhì)體的EE要求在80%以上，DL越高越適應(yīng)臨床需要。因此，以EE和DL的權(quán)重比為3∶1預(yù)測CA-CPT-11-Lip的最佳制備工藝為：104.80 mg卵磷脂，6.28∶1的卵磷脂-膽固醇比例，6.45 mg的CPT-11。EE的預(yù)測值為80.27%，DL為3.92%。表6所示，EE和DL的測量值和預(yù)測值之間的偏差分別為1.77%和-0.2%，表明二項式擬合的結(jié)果良好，可靠性高。

表6 預(yù)測值與結(jié)果比較 %

2.6 脂質(zhì)體特征研究

2.6.1 形態(tài)

脂質(zhì)體樣品適當(dāng)稀釋后，取少許樣品滴在銅網(wǎng)上，進一步分析之前，用2%的磷鎢酸在室溫下染色1-2 min，然后通過透射電子顯微鏡觀察和拍照。如圖2所示，脂質(zhì)體呈類球形，磷脂雙分子層明顯，與測定的粒徑大小一致。

CA-CPT-11-Lip CPT-11-Lip

2.6.2 EE、DL、粒徑、PDI和Zeta電位

結(jié)果表明，膽酸的加入提高了脂質(zhì)體的EE(見表7)。取適量脂質(zhì)體用純凈水稀釋15倍，測定粒徑，Zeta電位和PDI。通常，較高的Zeta電位與制劑的穩(wěn)定性有關(guān)，所以兩種脂質(zhì)體都有一定的穩(wěn)定性[16]。兩種脂質(zhì)體的粒徑小于200 nm，且PDI較低(PDI<0.25)，有利于避免物理清除[17]。在粒徑、PDI和EE方面，CA-CPT-11-Lip顯示出優(yōu)勢。其粒徑較小，PDI較低，包封率較高，尤其是粒徑的差異很明顯(見圖3)。因此，膽酸優(yōu)化了傳統(tǒng)脂質(zhì)體的特性。

表7 脂質(zhì)體的特征結(jié)果

圖3 CPT-11-Lip和CA-CPT-11-Lip的粒徑分布圖

2.6.3 穩(wěn)定性研究

將脂質(zhì)體分裝在西林瓶中，4℃放置，分別在1、3、7、15 d后測定脂質(zhì)體粒徑，結(jié)果如圖4所示，兩種脂質(zhì)體的外觀在15 d內(nèi)都是均勻的，而且粒徑是恒定的，表明該制劑可以在4℃下穩(wěn)定地儲存15 d。

圖4 CPT-11-Lip、CA-CPT-11-Lip

3 討論

一般來說，pH梯度法、硫酸銨梯度法等主動載藥技術(shù)被認(rèn)為更適合于弱堿性藥物脂質(zhì)體的制備[18-20]，這也是CPT-11脂質(zhì)體的最佳制備方法[21]。但是此方法制備工藝復(fù)雜、繁瑣，不適合大規(guī)模的工藝生產(chǎn)。在BBD工藝優(yōu)化中(見表3)，發(fā)現(xiàn)用薄膜分散法制備CA-CPT-11-Lip操作簡單，并且重復(fù)性良好，這意味著膽酸作為一種輔料簡化了CPT-11脂質(zhì)體的制備，為弱堿性藥物脂質(zhì)體的制備提供了一種思路。值得注意的是，EE的準(zhǔn)確性是實驗的關(guān)鍵。脂質(zhì)體EE的測定方法有凝膠色譜法、超濾法、高速離心法、魚精蛋白凝聚法、透析法、熒光淬滅反應(yīng)法、微型柱離心法等[22]。本實驗選擇經(jīng)典的凝膠色譜法，但使用Sephadex G-50凝膠柱分離游離藥物和脂質(zhì)體時，流速影響EE的計算。通常情況下，脂質(zhì)體在分離過程中會造成凝膠堵塞，使流速減慢。因此，凝膠柱在使用后應(yīng)使用大量洗脫液進行清洗。

隨著人們生活水平的提高，人群中高膽固醇水平相關(guān)的疾病發(fā)病率越來越高，但人們遠(yuǎn)未對高膽固醇血癥的危害引起重視。研究表明，過多的攝入膽固醇與高脂血癥、冠心病以及動脈粥樣硬化等多種心血管疾病有關(guān)[7]。本實驗對比研究膽固醇型脂質(zhì)體、膽汁酸型脂質(zhì)體以及兩者不同比例的混合型脂質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)膽汁酸可以部分替代膽固醇的作用，混合型脂質(zhì)體的EE、粒徑等指標(biāo)符合一般要求，與膽固醇型脂質(zhì)體相似，一定程度上可以減少膽固醇的使用，雖然制備的脂質(zhì)體并不穩(wěn)定，膽汁酸在脂質(zhì)體中的位置及作用并不清楚，但給未來探索膽固醇的替代品提供了參考。

本實驗優(yōu)化了膽酸-膽固醇型脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)膽酸的使用提高了脂質(zhì)體的EE，減小了粒徑和PDI。脂質(zhì)體的粒徑在很大程度上決定了它們在體內(nèi)的表現(xiàn)。通常情況下，減小粒徑可以增加脂質(zhì)體的擴散能力，有利于擴散到腫瘤區(qū)域，增強腫瘤細(xì)胞的攝取，從而達到治療效果[23]。而PDI是一個描述脂質(zhì)體顆粒大小均勻性的參數(shù)。粒度均一的脂質(zhì)體可以在作用部位均勻地釋放藥物[24]。這些結(jié)果表明膽汁酸是潛在的一種輔料，為脂質(zhì)體的處方研究提供了新思路，具有良好的研究及應(yīng)用前景。