黃萎病菌激活蛋白的提取及對棉花發(fā)芽的影響

張海萍+馬前程+麻浩+哈那提別克+顧愛星

摘要：為探索棉花黃萎病的生物防治方法，對棉花黃萎病病菌激活蛋白的提取方法及活性進(jìn)行了研究。將從感染黃萎病的棉花組織中分離培養(yǎng)的棉花黃萎病病菌置于不同溫度、不同轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行培養(yǎng)，對棉花黃萎病病菌的激活蛋白進(jìn)行提取，用1 000倍、1 500倍、2 000倍激活蛋白稀釋液分別處理2個(gè)棉花品種（新陸中11號、新陸中50號）的種子，檢測激活蛋白對棉花種子發(fā)芽率的影響。結(jié)果表明，獲得該菌最佳發(fā)酵條件為26 ℃、200 r/min、72 h，在此條件下，菌絲干質(zhì)量達(dá)5.88 g/L。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在分子量為25 ku附近有1條集中的電泳譜帶；激活蛋白稀釋液能夠提高這2種棉花種子的發(fā)芽率，其中稀釋1 500倍時(shí)效果最明顯。結(jié)果表明，棉花黃萎病病菌激活蛋白具有高效的誘導(dǎo)激活活性，可為研制低成本的蛋白生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：棉花；黃萎病菌；激活蛋白；發(fā)芽率

中圖分類號： S435.621.2+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0096-03

棉花黃萎病是一種世界性病害，其危害大、持續(xù)時(shí)間長、可導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失。棉花黃萎病的發(fā)生是因?yàn)橥寥篮罅烤?，病原菌產(chǎn)生分化，缺乏抗棉花黃萎病的優(yōu)良品種，溫濕度適宜條件不好，缺乏對棉花黃萎病嚴(yán)格的檢疫制度和有效快速的檢疫手段等。1935年棉花黃萎病從美國傳入我國，在陜西涇陽、山西運(yùn)城、山東高密和河南安陽等地區(qū)相繼發(fā)生[1]。1970年以后，我國12個(gè)?。ㄊ?、區(qū)）均發(fā)生了棉花黃萎病，主要集中在黃河流域棉區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000年棉花黃萎病發(fā)病面積已經(jīng)達(dá)到300萬hm2 [2]，種子交流使病原菌的種類越來越多，形成了復(fù)合種群（基因型）[3]。有研究表明，棉花黃萎病病菌的致病力均存在分化和變異，造成棉花黃萎病逐年加重的主要原因之一是強(qiáng)致病力菌系的出現(xiàn)[4]。農(nóng)藥對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)，但是副作用很多，如環(huán)境污染、生態(tài)破壞、病蟲抗藥性和農(nóng)產(chǎn)品安全性等問題，為解決這些問題出現(xiàn)了生物農(nóng)藥、生物肥料，使用生物農(nóng)藥、生物肥料是確?，F(xiàn)代農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)、保護(hù)環(huán)境的關(guān)鍵技術(shù)措施，用生物肥料代替農(nóng)藥已經(jīng)成為一種趨勢。美國康奈爾大學(xué)韋忠民博士提出了過敏蛋白具有抗病性功能[5]。2001年美國Cornell 大學(xué)和EDEN 生物科技公司從過敏反應(yīng)蛋白中共同開發(fā)和研制了具有抗病防蟲功能的蛋白質(zhì)分子生物新農(nóng)藥Messenger [6]。這[JP2]種產(chǎn)品在多種大田作物、經(jīng)濟(jì)作物上效果十分明顯，對多種病蟲防治效果達(dá)50%～80%，增產(chǎn)10%～20%，是一種較為理想的環(huán)境友好型生物農(nóng)藥。目前，具有代表性的微生物蛋白農(nóng)藥有過敏蛋白（harpin）、隱地蛋白（crypogein）[7]和激活蛋白（activator）[8]等幾種類型。激活蛋白的作用機(jī)理在性質(zhì)上類似動物免疫的一種抗病機(jī)制，無毒，在植物體內(nèi)和土壤中易分解、無殘留，是一種適合農(nóng)業(yè)需求和環(huán)境友好的生物農(nóng)藥[9]。[JP]

黃萎病菌激活蛋白主要通過激活植物體內(nèi)分子免疫系統(tǒng)，提高植物自身免疫力；通過激發(fā)植物體內(nèi)的一系列代謝調(diào)控，促進(jìn)植物根、莖、葉生長和提高葉綠素含量，從而提高作物產(chǎn)量。

本試驗(yàn)為探索棉花黃萎病的生物防治方法，對棉花黃萎病病菌激活蛋白的提取及活性進(jìn)行了初步研究。從感染黃萎病的棉花組織中分離培養(yǎng)棉花黃萎病病菌，置于不同溫度下以不同轉(zhuǎn)速進(jìn)行培養(yǎng)，對棉花黃萎病病菌的激活蛋白進(jìn)行提取，用激活蛋白處理棉花種子，檢測激活蛋白對棉花種子發(fā)芽的影響，探明棉花黃萎病病菌激活蛋白是否具有誘導(dǎo)激活活性，為研制低成本的蛋白生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

1.1.1菌種棉花黃萎病病菌，采自石河子棉田的帶病棉花植株上，病原菌在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)，經(jīng)鑒定為棉花黃萎病病菌。

1.1.2棉花種子棉花品種為新陸中11號、新陸中50號，均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3儀器立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；1-15K高速冷凍離心機(jī)，購自德國SIGMA公司；HH.SY11-N單列兩孔水浴鍋，購自金壇市醫(yī)療儀器廠；FM100雪花制冰機(jī)，購自美國GRANT公司；FM2004電子天平，購自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.1.4試劑Tris-HCl、丙烯酰胺、甘氨酸、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、考馬斯亮蘭R-250、二硫蘇糖醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴酚藍(lán)、甘油、甲醇、乙酸等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1棉花黃萎病病菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[10]

將棉花黃萎病病菌接種在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，打3個(gè)菌餅置于裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶（ 250 mL）中，設(shè)9個(gè)重復(fù)，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，記錄菌絲干質(zhì)量。振蕩溫度為24、26、28 ℃；轉(zhuǎn)速為160、180、200 r/min；振蕩時(shí)間為24、48、72 h。

1.2.2棉花黃萎病病菌激活蛋白的提取及原液的設(shè)定

激活蛋白的提取參照文獻(xiàn)[11]中的方法進(jìn)行。依次用無菌水和 0.5 mol/L Tris-HCL緩沖液沖洗菌體去除孢子，抽濾得菌絲體；將菌絲體研磨（冰上操作），每次研磨5 min；在4 ℃下，以15 000 r/min離心15 min，取上清液于沸水中加熱10～15 min，取出置于冰上冷卻5 min；再于4 ℃下，15 000 r/min離心15 min，上清液即為激活蛋白粗提液原液，然后對其進(jìn)行 SDS-PAGE分析。

1.2.3棉花黃萎病病菌激活蛋白對棉花種子發(fā)芽的影響[12]

將棉花黃萎病病菌激活蛋白粗提液原液依次用水稀釋 1 000倍、1 500倍、2 000倍，分別對2個(gè)棉花品種的種子浸泡處理 8 h，以清水浸泡作對照。每個(gè)處理浸泡種子20粒，重復(fù)3次。取出后用濾紙吸干濾液，將種子放在墊有濾紙（用蒸餾水潤濕）的培養(yǎng)皿中，置于人工模擬氣候箱中培養(yǎng)。每隔 24 h 檢測1次種子發(fā)芽率和幼根生長情況。

2結(jié)果與分析

2.1棉花黃萎病病菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2棉花黃萎病病菌激活蛋白的提取結(jié)果

電泳檢測結(jié)果顯示，提取蛋白分子量大小分布范圍較廣，其中最為明顯的是在分子量為25 ku附近有1條較為集中的電泳譜帶（圖4）。

2.3棉花黃萎病病菌激活蛋白對棉花種子發(fā)芽的影響

2.3.1發(fā)芽率

從圖5、圖6可知，在培養(yǎng)2 d后，經(jīng)激活蛋白1 500倍稀釋液處理的種子發(fā)芽率明顯高于其他處理，發(fā)芽率高達(dá)95%。對于新陸中50號，激活蛋白稀釋液處理的種子發(fā)芽率均高于對照，其中1 500倍稀釋液處理的種子發(fā)芽率最高，在培養(yǎng)2 d后其發(fā)芽率可達(dá)95%。

2.3.2胚根生長情況

棉花黃萎病病菌激活蛋白對棉花種子的胚根長、胚根鮮質(zhì)量、胚根干質(zhì)量均有一定的影響，用SPSS 18.0軟件處理結(jié)果如表1所示。與對照相比，激活蛋白1 000倍稀釋液和1 500倍稀釋液對棉花種子的胚根長、胚根鮮質(zhì)量、胚根干質(zhì)量均有提升作用。其中稀釋1 500倍時(shí)，激活[CM（25]蛋白對棉花種子胚根生長的促進(jìn)作用最強(qiáng)，且均達(dá)到顯著[CM）]

水平，新陸中11號胚根長 5.36 cm，胚根鮮質(zhì)量80.56 mg，胚根干質(zhì)量7.45 mg；新陸中50號胚根長5.12 cm，胚根鮮質(zhì)量75.67 mg，胚根干質(zhì)量713 mg。表明棉花黃萎病病菌激活蛋白具有一定的誘導(dǎo)激活活性。

3討論

近年來，從植物病原菌中研究發(fā)現(xiàn)了具有誘導(dǎo)植物廣譜抗性和促進(jìn)植物生長的多功能植物激活蛋白，稱為微生物蛋白農(nóng)藥[13]。該農(nóng)藥可通過誘導(dǎo)植物本身的抗病基因表達(dá)而起到抗病防蟲、促進(jìn)生長的作用，對多種作物有效。激活蛋白從培養(yǎng)8 h時(shí)產(chǎn)生，到72 h時(shí)最多；在培養(yǎng)24 h時(shí)出現(xiàn)活性，[FL）]

[14]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，棉花黃萎病病菌的最佳發(fā)酵條件為 26 ℃、200 r/min、72 h，在此條件下，菌絲干質(zhì)量可達(dá) 5.88 g/L，這與前人的研究結(jié)論[15]相同，同時(shí)提供了最佳培養(yǎng)溫度和最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速，為棉花黃萎病病菌激活蛋白的批量生產(chǎn)提供了技術(shù)依據(jù)。

4結(jié)論

真菌蛋白的產(chǎn)量取決于其發(fā)酵條件。采用液體搖瓶培養(yǎng)法，就棉花黃萎病病菌的發(fā)酵條件即培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)菌量的影響進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，得到最佳發(fā)酵條件為 26 ℃、200 r/min、72 h，為棉花黃萎病病菌激活蛋白的批量生產(chǎn)提供了技術(shù)依據(jù)。

對棉花黃萎病病菌激活蛋白提取液進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果表明，提取蛋白分子量大小分布范圍較廣，其中在分子量為 25 ku 附近有1條較為集中的電泳譜帶，說明本試驗(yàn)采用的方法適用于提取棉花黃萎病病菌激活蛋白。

激活蛋白對2個(gè)不同品種棉花種子的胚根長、胚根鮮質(zhì)量、胚根干質(zhì)量均有一定的影響。激活蛋白1 000倍稀釋液和1 500倍稀釋液對棉花種子的胚根長、胚根鮮質(zhì)量、胚根干質(zhì)量均有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)稀釋1 500倍時(shí)，激活蛋白對棉花種子胚根生長的促進(jìn)作用最大，此結(jié)果表明棉花黃萎病病菌激活蛋白在稀釋1 500倍時(shí)具有高效的誘導(dǎo)激活活性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu R J. Effect of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi on Verticillium wilt of cotton[J]. Mycorrhiza，1995，5（4）：293-297.

[2]潘光照，何旭平，張敏健，等. 我國棉花黃萎病研究進(jìn)展[J]. 中國棉花，1999，26（3）：9-10.

[3]李金華，王俊紅，孫巖國. 棉花黃枯萎病發(fā)病規(guī)律及防治措施[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（21）：197.[HJ1.76mm]

[4]Sibel D，Latife E，Soner S，et al. Vegetative compatibility groups in Verticillium dahliae isolates from olive in western Turkey[J]. European Journal of Plant Pathology，2007，119（4）：437-447.

[5]Wei Z M，Beer S V. Harpin，elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora[J]. Science，1992，257（5066）：85-88.

[6]邱德文.Messenger 生物活性篩選技術(shù)的開發(fā)[C]//美國植物病理學(xué)會年會論文集. Minnesota Minneapolis：The American Phytopathological Society，2001.

[7]袁肖寒，顧成波，邱德文，等. 新型真菌源激活蛋白誘導(dǎo)水稻抗病性及其生理機(jī)制[J]. 植物研究，2013，33（2）：220-224.

[8]武廣衍，邱德文，吳珍泉，等. 新型激活蛋白對多種作物種子發(fā)芽的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（增刊1）：21-24.

[9]徐鋒，楊勇，謝馥交，等. 稻瘟菌激活蛋白對植物生長及其生理活性的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（5）：1-5.[ZK）]

[10]滕立平. 激活蛋白提高番茄對早疫病抗病性作用的初步研究[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[11] Johnson D A，Baker R，Boydston R A. Field evaluation of mutant and hybrid lines of mint for resistance to Verticillium wilt and yield[J]. Crop Protection，2013，43（1）：1-6.

[12]王宏，項(xiàng)時(shí)康，陳建華，等. 棉花種子發(fā)芽過程中生理生化變化及赤霉素的調(diào)節(jié)[J]. 棉花學(xué)報(bào)，1997，9（2）∶95-101.

[13]楊培嶺，羅遠(yuǎn)培. 用粒徑的重量分布表征的土壤分形特征[J]. 科學(xué)通報(bào)，1993，38（20）：1896-1899.

[14]邱德文. 微生物蛋白農(nóng)藥研究進(jìn)展[J]. 中國生物防治，2004，20（2）：91-94.

[15]滕立平，王蘭，但紅霞. 棉花枯萎病菌激活蛋白的提取及其對棉花種子發(fā)芽的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（4）：82-85.