許氏平鮋源嗜水氣單胞菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

李惠

摘要：為了解青島地區(qū)人工養(yǎng)殖許氏平鮋（Sebastes schlegelii）病原菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的流行情況和耐藥性情況。對(duì)2020～2021年采集青島地區(qū)人工養(yǎng)殖場(chǎng)中病死許氏平鮋的肝臟、腸道等病料組織127份，采用常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定方法和PCR方法進(jìn)行嗜水氣單胞菌分離鑒定，采用人工感染動(dòng)物試驗(yàn)和K-B藥敏紙片法分別檢測(cè)嗜水氣單胞菌分離菌株的致病性和耐藥性。結(jié)果顯示：從127份病料樣品中分離到68株嗜水氣單胞菌，分離率為53.5%（68/127），50株嗜水氣單胞菌可以引起許氏平鮋死亡為致病性菌株；50株許氏平鮋對(duì)新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9種藥物耐藥率在52.0%以上，對(duì)其他的藥物耐藥率為4.0%～30%。該研究為許氏平鮋源嗜水氣單胞菌合理用藥及防控提供了參考。

關(guān)鍵詞：許氏平鮋（Sebastes schlegelii）；嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；分離鑒定；致病性；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q93；S965.399文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

許氏平鮋（Sebastes schlegelii）又稱為黑魚(yú)、黑頭和黑鲪等，屬鮋形目（Scorpaeniformes）、鮋科（Sebastidae）、平鮋屬（Sebastes），主要分布于中國(guó)的渤海、黃海及東海地域，主要以網(wǎng)箱養(yǎng)殖模式進(jìn)行飼養(yǎng)^[1]。許氏平鮋屬于冷水性肉食性魚(yú)類，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)且肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)速度較快、抗病能力強(qiáng)，在中國(guó)北方沿海人工養(yǎng)殖廣泛且成為主要冷水性魚(yú)類養(yǎng)殖品種^[2-3]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila ，以下簡(jiǎn)稱A.hydrophila）為臨床中常見(jiàn)的人-畜-水生動(dòng)物共患的病原菌之一，該菌廣泛存在于自然界中土壤、水源及養(yǎng)殖環(huán)境中，且對(duì)大多數(shù)的哺乳動(dòng)物、水生動(dòng)物及人具有不同的致病性^[4]。A.hydrophila可以引起多種動(dòng)物和人的敗血癥、肺炎、腹瀉、化膿及毒素引起的休克等一系列的臨床癥狀，同時(shí)可以引起食物中毒，嚴(yán)重危害著動(dòng)物和人的健康，對(duì)該病的防控具有重要的意義^[5]。A.hydrophila可以感染多種動(dòng)物及野生動(dòng)物（豬、牛、羊、鹿），尤其對(duì)魚(yú)類（多寶魚(yú)、半滑舌鰨魚(yú)、大黃魚(yú)、黃顙魚(yú)等）致病性較強(qiáng)，其感染率和死亡率均較高，成為魚(yú)類養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)的病原菌之一，嚴(yán)重危害魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展^[5-6]。近年來(lái)，關(guān)于A.hydrophila感染魚(yú)類的報(bào)道越來(lái)越多，臨床中以體表磷脫落出血、肛門(mén)脫垂及腸炎等癥狀為多見(jiàn)，其死亡率較高，給養(yǎng)魚(yú)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失^[7]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，A.hydrophila耐藥性已經(jīng)普遍存在且呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，給臨床用藥帶來(lái)一定困難，已成為公共衛(wèi)生安全問(wèn)題^[8]。該試驗(yàn)對(duì)采集病死許氏平鮋的肝臟、腸道等病料組織127份進(jìn)行嗜水氣單胞菌分離鑒定，并檢測(cè)其致病性和耐藥性，以期為該地區(qū)許氏平鮋源嗜水氣單胞菌合理用藥提供了參考。

1? 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2020～2021年采集青島地區(qū)人工養(yǎng)殖場(chǎng)中病死許氏平鮋的肝臟、腸道等病料組織127份，對(duì)采集的樣品進(jìn)行處理并進(jìn)行嗜水氣單胞菌的分離鑒定。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

將采集的樣品進(jìn)行處理后，無(wú)菌的條件下接種于7%綿羊脫纖血液培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，30℃恒溫培養(yǎng)12hrs～18hrs后，挑取單個(gè)菌落接種于AHM選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12hrs～18hrs，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)。

1.3 生化試驗(yàn)鑒定

參照VITEK2革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡說(shuō)明書(shū)，將分離菌株接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整菌液濃度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，無(wú)菌的條件接種于紙質(zhì)條中， 37℃培養(yǎng)12hrs～18hrs進(jìn)行生化特性鑒定。

1.4 細(xì)菌PCR鑒定

根據(jù)參考文獻(xiàn)^[9]設(shè)計(jì)細(xì)菌16SrRNA 基因通用引物，在上海生共合成引物（表1）。用水煮沸提取分離菌株的基因組并進(jìn)行PCR鑒定。回收PCR產(chǎn)物回收送上海生共測(cè)序與比對(duì)。

1.5 致病性試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)^[7]的方法，將分離菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期調(diào)整菌液濃度為10⁷cfu/mL，每株分離菌株肌肉注射5尾500g左右許氏平鮋，劑量為0.25mL（10⁷cfu/mL），對(duì)照組給予等量的無(wú)菌生理鹽水。試驗(yàn)期為7d并觀察許氏平鮋發(fā)病情況。

1.6 藥敏試驗(yàn)

分離菌株的藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2013年推薦的藥敏試驗(yàn)法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作與結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似A.hydrophila的菌株通過(guò)7%綿羊脫纖血液培養(yǎng)基、AHM選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒別培養(yǎng)分離培養(yǎng)及鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)結(jié)果，均符合A.hydrophila的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)

通過(guò)VITEK2革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行生化鑒定，68株分離菌株初步鑒定為A.hydrophila。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定

對(duì)初步鑒定為A.hydrophila用PCR進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。結(jié)果顯示分離的68株分離菌株均擴(kuò)增出大約為1500 bp的目條帶（圖1）。通過(guò)測(cè)序?qū)Ρ?8株分離菌株與參考株（A.hydrophila）的同源性均大于98%，說(shuō)明分離株為A.hydrophila，分離率為53.5%（68/127）。

2.4 致病性試驗(yàn)

攻毒組許氏平鮋在攻毒后2d～3d出現(xiàn)了不同的發(fā)病情況，且個(gè)別攻毒的許氏平鮋不表現(xiàn)任何癥狀出現(xiàn)急性死亡，剖檢死亡的許氏平鮋后采集病料組織，分離得到A.hydrophila，攻毒試驗(yàn)結(jié)束對(duì)照組許氏平鮋健康存活。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，50株A.hydrophila能引起許氏平鮋死亡為致病性菌株。

2.5 藥敏試驗(yàn)

分離菌株的耐性分析顯示，50株致病性A.hydrophila對(duì)新霉素、氟苯尼考、大觀霉素、氨芐西林、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、多西環(huán)素等9種藥物的耐藥率為52.0%～84.0%之間，對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素5種藥物耐藥率為4.0%～30%；說(shuō)明臨床中分離的50株致病性A.hydrophila對(duì)臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性。

3 討論

A.hydrophila為臨床中常見(jiàn)的人-畜-水生動(dòng)物共患的條件性致病菌，該菌廣泛存在于環(huán)境中及水環(huán)境中，該菌可以通過(guò)多種途徑（直接接觸傳播、空氣傳播、黏膜創(chuàng)傷、消化系統(tǒng)感染）在不同水生動(dòng)物之間傳播^[10]。A.hydrophila可以引起多種動(dòng)物及野生動(dòng)物感染，急性病例具有發(fā)病比較急、死亡率較迅速等特定，為魚(yú)類常見(jiàn)的急性、敗血性的一類疾病^[4-5]。近年來(lái)，關(guān)于魚(yú)類A.hydrophila的報(bào)道越來(lái)越多，尤其對(duì)人工養(yǎng)殖的魚(yú)類危害較大。該試驗(yàn)從采集青島地區(qū)人工養(yǎng)殖場(chǎng)中病死許氏平鮋的肝臟、腸道等病料組織127份分離到50株致病性A.hydrophila，說(shuō)明A.hydrophila在許氏平鮋養(yǎng)殖中流行嚴(yán)重，可能對(duì)許氏平鮋存在潛在危害性，應(yīng)該引起重視。

臨床中A.hydrophila病主要通過(guò)抗菌藥物進(jìn)行防治，隨著抗菌藥物的不合理使用，對(duì)青霉素、頭孢菌素類、氨基糖苷類等藥物產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性，其耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，同一地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)的耐藥性也存在差異性，降低了治療效果^[11]。該研究表明，50株A.hydrophila對(duì)新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9種藥物耐藥率在52.0%以上，對(duì)其他的藥物耐藥率為4.0%～30%。說(shuō)明從許氏平鮋養(yǎng)殖中分離的A.hydrophila對(duì)臨床中常用的藥物存在不同耐藥性，且耐藥性嚴(yán)重。因此，在臨床中治療該病應(yīng)該進(jìn)行藥物試驗(yàn)，選擇敏感的藥物進(jìn)行交替使用，同時(shí)應(yīng)該配合環(huán)境的消毒，提高治療效果。

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Isolation and identification of Aeromonas hydrophila? of Sebastes schlegelii origin and drug sensitivity test

LI Hui

（Dalian Ocean Development Affairs Service Center， Dalian 116000， Liaoning China）

Abstract：To understand the prevalence and drug resistance of Aeromonas hydrophila， the pathogenic bacterium of Sebastes schlegelii， in captive culture in Qingdao. The pathogenicity and drug resistance of Aeromonas hydrophila isolates were detected by using the conventional bacterial isolation and identification method and PCR method， and the pathogenicity and drug resistance of Aeromonas hydrophila isolates were detected by the artificial infection animal test and K-B drug-sensitive paper test， respectively. The results showed that the pathogenicity and drug resistance of the isolates were determined by the K-B drug-sensitive paper method. The results showed that 68 strains of Aeromonas hydrophila were isolated from 127 samples， and the isolation rate was 53.5% （68/127）. 50 strains of Aeromonas hydrophila could cause the death of Sebastes schlegelii as pathogenic strains. The resistance rate of 50 strains of Sebastes schlegelii to 9 drugs， including neomycin， florfenicol and spectinomycin， was 52.0% and 4.0%-30% for other drugs. This study provides a reference for the rational drug use and prevention and control of Aeromonas hydrophila of Sebastes schlegelii.

Keywords：redfish （Sebastods schlegelii）; Aeromonas hydrophila; Isolation and identification; Pathogenicity; Drug sensitivity test