即食果蔬中致病微生物檢測(cè)技術(shù)及研究進(jìn)展

蔣靜嫻，楊丹妮，張曉金

摘 要：即食果蔬中的致病微生物污染給其食用造成了極大的安全隱患。致病微生物的傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法耗時(shí)、耗力，目前急需一種高效率、高準(zhǔn)確度、低成本且單次實(shí)驗(yàn)可滿足多指標(biāo)篩檢要求的快速檢測(cè)技術(shù)來(lái)對(duì)即食果蔬中的多種致病微生物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。本文闡述了即食果蔬中食源性致病微生物的種類及其主要危害，介紹了目前比較常見的微生物檢測(cè)技術(shù)，并重點(diǎn)介紹了針對(duì)即食果蔬最新開發(fā)出的一種快速、簡(jiǎn)便、高通量的微生物檢測(cè)方法，為研究者開辟其他食源性致病微生物快速檢測(cè)方法提供重要參考。

關(guān)鍵詞：即食果蔬；致病微生物；檢測(cè)技術(shù)；基因膜芯片

Research Progress in Detection of Pathogenic Microorganisms in Ready-To-Eat Fruits and Vegetables

JIANG Jingxian， YANG Danni*， ZHANG Xiaojin

（Changzhou Food and Drug Fiber Quality Supervision and Inspection Center， Changzhou 213000， China）

Abstract： The contamination of pathogenic microorganisms in ready-to-eat fruits and vegetables has caused great potential safety hazard. Traditional inspection methods for pathogenic microorganisms are time-consuming and labour-intensive， at present， a rapid detection technique with high efficiency， high accuracy， low cost and a single test can meet the requirements of multi-index screening is urgently needed to detect multiple pathogenic microorganisms in ready-to-eat fruits and vegetables simultaneously. In this paper， the types and main hazards of food-borne pathogenic microorganisms in ready-to-eat fruits and vegetables were described， a rapid， simple and high-throughput microbial detection method for ready-to-eat fruits and vegetables was introduced， which provided important reference for researchers to develop other rapid detection methods for food-borne pathogenic microorganisms.

Keywords： ready-to-eat fruits and vegetables; pathogenic microorganisms; detection technology; gene membrane chip

隨著人們物質(zhì)生活水平的日益提升和媒體對(duì)食品安全問(wèn)題的頻頻曝光，消費(fèi)者對(duì)“舌尖上的安全”越來(lái)越關(guān)注，對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、感官品質(zhì)及安全衛(wèi)生等需求也不斷提高。即食果蔬由于具有方便、新鮮、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，鮮切果蔬產(chǎn)業(yè)也因此得到了快速發(fā)展[1]。

即食果蔬是以新鮮水果或新鮮蔬菜的一種或多種為原料，經(jīng)過(guò)預(yù)處理、清洗、去皮或不去皮、切分或不切分以及消毒等加工處理，密封包裝后銷售，是可直接食用的產(chǎn)品。但即食果蔬未經(jīng)高溫殺菌處理，在去皮、去核、切分等加工過(guò)程中以及在運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中，極易受到微生物污染。

1 即食果蔬中致病微生物的危害

即食果蔬中的致病微生物主要分為細(xì)菌和病毒兩類。病毒中較為典型的是諾如病毒和輪狀病毒，這兩種病毒可以引起腹瀉、嘔吐、頭痛和發(fā)熱等癥狀[2-3]，主要通過(guò)糞-口傳播、昆蟲移動(dòng)傳播、病毒攜帶者傳播等方式污染即食果蔬。

據(jù)美國(guó)疾控防控中心2015年的一項(xiàng)調(diào)查研究[4]顯示，美國(guó)沙門氏菌的感染致病事件呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而且在美國(guó)食物中毒致死的案例中，由沙門氏菌感染引發(fā)的案例占比較高。我國(guó)也有相關(guān)報(bào)道[5]表明，沙門氏菌是引發(fā)食源性疾病的“罪魁禍?zhǔn)住?。沙門氏菌屬于腸桿菌科，感染后會(huì)導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒等疾病，主要臨床表現(xiàn)是腹瀉、嘔吐、發(fā)燒和腹痛等[4]，還會(huì)引起關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心肌炎等并發(fā)癥。現(xiàn)已有調(diào)查研究[6]表明，沙門氏菌的生存能力極強(qiáng)，可在蔬菜、水果、各種肉制品上長(zhǎng)期存活。但實(shí)際上，在即食果蔬上易存活的致病微生物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止沙門氏菌一種，還包括金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、諾如病毒以及輪狀病毒等。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌已被證實(shí)可以在鮮切哈密瓜、鮮切火龍果、鮮切木瓜等多種即食果蔬上繁殖生存[7]。近20年來(lái)，美國(guó)發(fā)生的性質(zhì)最惡劣的食物中毒事件就是由單核細(xì)胞增生李斯特氏菌感染引起的，在2011年7月末至10月初出現(xiàn)了110例相關(guān)病例報(bào)告[8]。金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致局部化膿性感染，如腸胃炎、肺炎、心包炎等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)膿毒癥、敗血癥等全身性感染[9]。

雖然在正常情況下，大腸埃希氏菌是與人體互利共生的腸道菌群之一，但在機(jī)體免疫力低下等特殊情況下，其危害不容小覷。有調(diào)查顯示[10]，大腸桿菌O157∶H7引起的食物中毒事件占食源性疾病事件的34.3%。

2 致病微生物的常見檢測(cè)技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)分離鑒定法

傳統(tǒng)分離鑒定法是通過(guò)觀察微生物的形態(tài)特征和生理/生化反應(yīng)等對(duì)其進(jìn)行微生物學(xué)分類鑒定，具體過(guò)程包括增菌、分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生理/生化鑒別以及血清學(xué)鑒別5個(gè)步驟[11]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離鑒定法有較高的鑒定準(zhǔn)確度，較低的設(shè)備要求，常作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌等常見致病菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)，我國(guó)現(xiàn)行有效的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均采用的是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定法。

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)法

免疫學(xué)檢測(cè)法是一種根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)建立的檢驗(yàn)與分析方法。酶聯(lián)免疫吸附法是目前發(fā)展較成熟、應(yīng)用較廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)法，具有選擇性高、準(zhǔn)確高效、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。該方法將抗原-抗體的特異性反應(yīng)與酶的催化作用相結(jié)合，用酶標(biāo)記抗原或抗體，在固相載體表面發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)洗滌后通過(guò)特定的酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)來(lái)判定結(jié)果。但常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法的檢測(cè)靈敏度容易受前處理方法和采樣時(shí)間等因素的影響，可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，而且對(duì)儀器設(shè)備和操作人員的要求也比較高[12]。

2.3 生物傳感器法

生物傳感器法是通過(guò)將某種生物活性物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)來(lái)識(shí)別待測(cè)物質(zhì)的一種檢測(cè)方法。生物傳感器一般由生物感應(yīng)元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換器兩部分組成。生物感應(yīng)元件是指酶、微生物、抗原/抗體、激素、細(xì)胞和組織等固定化的生物活性物質(zhì)。信號(hào)轉(zhuǎn)換器包括氧電極、場(chǎng)效應(yīng)管、光敏管和壓電晶體等[13]。根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器的不同，生物傳感器可分為光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器和壓電生物傳感器。生物傳感器具有信號(hào)反應(yīng)快、設(shè)備成本低、樣品用量少等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

2.4 核酸檢測(cè)方法

基于核酸的檢測(cè)方法是利用分子生物學(xué)方法對(duì)微生物中特定的基因序列進(jìn)行檢測(cè)的方法。應(yīng)用于食源性微生物中最常用的核酸檢測(cè)方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）。PCR技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種食源性致病菌的檢測(cè)，但由于常規(guī)PCR方法檢測(cè)通量較低，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量，所以近年來(lái)在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上衍生出了基因膜芯片技術(shù)、多重PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP技術(shù)）等[14]。

3 即食果蔬中致病微生物檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

目前，我國(guó)對(duì)食源性致病菌的檢驗(yàn)檢測(cè)最常采用的是傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離鑒定法。但這種方法耗費(fèi)太多的人力、時(shí)間、物資等，不僅不適用于食源性致病微生物的快速檢測(cè)，也不利于對(duì)食品安全潛在風(fēng)險(xiǎn)的即時(shí)排查與控制。所以，目前迫切需要一種高效率、高準(zhǔn)確度、低成本且單次實(shí)驗(yàn)可滿足多指標(biāo)篩檢要求的快速檢測(cè)技術(shù)來(lái)對(duì)即食果蔬中的多種致病微生物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

基因膜芯片法利用“反向斑點(diǎn)雜交”將基因中的特異性基因序列（DNA探針）固定在尼龍膜等載體上，然后待測(cè)靶標(biāo)基因與芯片上的探針特異性結(jié)合，最后通過(guò)酶-底物顯色判讀結(jié)果。基于膜芯片技術(shù)，常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心聯(lián)合四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司開發(fā)了一種可以同時(shí)檢測(cè)即食果蔬中6種食源性致病微生物（4種細(xì)菌和2種病毒）的膜芯片檢測(cè)體系，即可用一種方法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)致病微生物。

該方法采用獨(dú)特的多重PCR技術(shù)與反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)體系，同時(shí)提取細(xì)菌和病毒中的DNA和RNA，并且同時(shí)擴(kuò)增其中的特異性基因片段，最終以大腸埃希氏菌O157、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌、諾如病毒和輪狀病毒中的特異性保守序列為檢測(cè)靶標(biāo)，在如圖1所示的膜芯片上形成肉眼可見的檢測(cè)靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)所有檢測(cè)靶標(biāo)的共同檢測(cè)。該方法大大降低了相關(guān)檢測(cè)工作的技術(shù)門檻，顯著提高了檢測(cè)人員的工作效率，兼具高通量、高效率、高靈敏度等多重技術(shù)優(yōu)勢(shì)，達(dá)到了省時(shí)、省力又省成本的目的。與分離鑒定法等傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，該方法具有極大的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，如果廣泛應(yīng)用將會(huì)對(duì)食品質(zhì)量安全管理、食品市場(chǎng)秩序維護(hù)、區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展等領(lǐng)域都具有重要意義。

4 結(jié)語(yǔ)

食品安全是當(dāng)前最大的民生問(wèn)題。對(duì)食品中致病微生物的快速檢測(cè)是有效控制食品安全事件發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著微生物檢測(cè)技術(shù)研究的不斷深入，對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)從傳統(tǒng)的分離鑒定法發(fā)展到現(xiàn)在的酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感器法和分子生物學(xué)技術(shù)等。但傳統(tǒng)分離鑒定法操作煩瑣、耗時(shí)耗力；酶聯(lián)免疫吸附法的特異性和靈敏度有待提高；生物傳感器法檢測(cè)費(fèi)用高，不利于推廣。未來(lái)我國(guó)微生物檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)方向應(yīng)該是操作更加簡(jiǎn)便快捷、特異性和靈敏度更高、對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)性要求更低的檢測(cè)技術(shù)及儀器產(chǎn)品，努力形成現(xiàn)代化的食源性致病菌快速檢測(cè)體系，最大限度地防止及控制食品安全突發(fā)事件的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

[1]李超，馮志宏，陳會(huì)燕，等.鮮切果蔬保鮮技術(shù)的研究進(jìn)展[J].保鮮與加工，2010，10（1）：3-6.

[2]DE GRAAF M，VAN BEEK J，KOOPMANS M.Human norovirus transmission and evolution in a changing world[J].Nat Rev Microbiol，2016，14（7）：421?433．

[3]CRAWFORD S E，RAMANI S，TATE J E，et al．Rotavirus infection[J].Nat Rev Dis Primers，2017，3（1）：17083．

[4]FOODNET.Foodborne disease active surveillance network：2015 surveillance report：centers for disease control and prevention （final data）[EB/OL].（2017-02-01）[2021-08-01].https：//www.cdc.govfoodnet/pdfs/FoodNet-Annual-Report-2015-508c.pdf.

[5]LIU J K，BAI L，LI W W，et al.Trends of foodborne diseases in China：Lessons from laboratory-based surveillance since 2011[J].Frontiers of medicine，2018，12：48-57．

[6]GRUZDEV N，PINTO R，SELA S.Persistence of Salmonella enterica during dehydration and subsequent cold storage[J].Food Microbiol，2012，32（2）：415-422．

[7]FENG K，HU W Z，JIANG A L，et al.Growth potential of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus on fresh-cut tropical fruits[J].Journal of Food Science，2015，80（11）：2548-2554．

[8]王琳，趙建梅，趙格，等.國(guó)內(nèi)外食源性致病微生物風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警開展現(xiàn)狀與啟示[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2020，37（4）：65-71．

[9]SHANDORDIZADEH M，TAGHDISI S M，ANSARI N，et al.Aptamer based biosensors for detection of Staphylococcus aureus[J].Sens Actuator B-Chem，2017，241：619?635．

[10]NUESCH-INDERBINEN M，STEPHAN R.Fresh fruit and vegetables as vehicles of bacterial foodborne disease：a review and analysis of outbreaks registered by proMED-mail associated with fresh produce[J].Journal of Food Safety and Food Quality-Archiv fur Lebensmittelhygiene，2016，67（2）：32-39.

[11]武俠均.食品與飼料中致病微生物檢測(cè)技術(shù)及展望[J].中國(guó)飼料，2022，1（19）：2-3．

[12]錢佳婕，黃迪，徐穎華，等.食源性致病微生物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（12）：4776-4777.

[13]LAZCKA O，CAMPO F J D， MU?OZ F X.Pathogen detection：A perspective of traditional methods and biosensor[J].Biosensor Bioelectron，2007，22（7）：1205-1217.

[14]崔榮飛，楊潔，甄理，等.動(dòng)物源性食品中致病微生物的快速PCR檢測(cè)[J].今日畜牧獸醫(yī)，2020（36）：1-3.