復(fù)合酶法提取馬尾藻中海藻酸的工藝研究

朱雯琪, 王俊凱, 孫建安, 毛相朝

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266100)

馬尾藻(Sargassum)是馬尾藻科、馬尾藻屬一類的褐藻總稱,現(xiàn)有大約250種[1],廣泛分布于暖水和溫水海域,中國沿海各地均有分布。馬尾藻是非直接食用的經(jīng)濟藻類,具有較高的加工價值[2]。目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了60余種的馬尾藻被廣泛報道應(yīng)用在食品、醫(yī)藥[3]、紡織和化工等領(lǐng)域[4]。作為提取海藻酸(Alginate)原料是馬尾藻重要商業(yè)用途之一[5],因季節(jié)氣候等環(huán)境因素,不同種類馬尾藻的海藻酸含量為12.4%～26.2%[1]。

海藻酸又名藻酸、褐藻酸或海藻素,化學(xué)式為(C6H8O6)n,相對摩爾質(zhì)量約為10 kDa～600 kDa,分子結(jié)構(gòu)如圖1所示[6]。海藻酸是從褐藻中提取的一種廣泛使用的天然有機多糖[7],純品通常為白色或棕黃色的纖維、顆?；蚍勰?。海藻酸在自然狀態(tài)下存在于細胞壁和細胞間質(zhì)中,在強化細胞壁中起著重要作用[3]。海藻酸及海藻酸鹽由于其特殊的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),在醫(yī)藥、食品、材料和固定化細胞中有應(yīng)用價值。

圖1 海藻酸分子示意圖

海藻酸和海藻酸鹽在醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。海藻酸是制藥工業(yè)中常見的賦形劑。海藻酸-抗酸劑也可以改善食道反流病,研究發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉具有抗反流屏障的作用[9]。海藻酸水凝膠可用作蛋白質(zhì)和藥物輸送系統(tǒng),也可用作支架材料。海藻酸納米顆粒已經(jīng)用于藥物遞送[9]。在食品領(lǐng)域,海藻酸及海藻酸鹽通常作為一種天然食品添加劑,通過其固有的理化性質(zhì)來改善不同食品的特性、結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)價值[10-11]。海藻酸鹽是一種天然多糖,無任何毒副作用,大分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)容易膨脹且柔韌性高[12]。由于其較低的成本、豐富的原材料來源和良好的可塑性等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于天然材料可降解包裝膜材料[13]。在組織工程領(lǐng)域中,海藻酸鹽作為支架材料的優(yōu)勢在于其柔韌性可以完全適應(yīng)組織缺損,并且可以同時加載生物活性分子[14]。在農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域,已開發(fā)出海藻酸鈉混合磷酸鹽及谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶等制取的新型鲅魚糜保水劑[15]。海藻酸及海藻酸鹽作為海洋中存在的一種可再生資源,基于其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的特殊性,在食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護和包裝領(lǐng)域具有極其廣泛的應(yīng)用價值和開發(fā)前景[16]。為了更好實現(xiàn)海藻酸及海藻酸鹽的應(yīng)用,對海藻酸及海藻酸鹽的生產(chǎn)工藝和開發(fā)利用研究顯得尤為重要。

目前,國內(nèi)外提取海藻酸主要采用的是酸凝-酸化法、鈣凝-酸化法、鈣凝-離子交換法等傳統(tǒng)化學(xué)工藝提取海藻酸,鈣凝-酸化法和酸凝-酸化法均采用酸洗脫鹽法。兩種工藝都使用了大量的鹽酸使得體系環(huán)境總體呈酸性,而海藻酸在酸性條件下不穩(wěn)定,最終導(dǎo)致了產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量下降,此外還存在工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高的問題。鈣凝-離子交換法與鈣凝-酸化法相比,鈣析速度快,沉淀易分離,減少了鹽酸、碳酸鈉等無機試劑的使用,進一步避免了反應(yīng)過程中海藻酸的降解。由于鈉離子交換生成海藻酸鈉是可逆反應(yīng),因此提高氯化鈉的濃度和用量可以提高海藻酸鈉的產(chǎn)量,同時也要避免過多的鹽對海藻酸鈉造成污染[17-18]。近年來出現(xiàn)了采用膜超濾的物理法[19]、采用超聲-復(fù)合酶降解的生物法[20-21]等新工藝。其中,經(jīng)過膜分離后的海藻酸和海藻酸鹽具有純度高、色澤好以及粘稠度高的特點。但由于其高粘稠度在進行膜分離的時候極易與膜結(jié)合對超濾膜造成污染,使得超濾膜的膜通量和分離效果衰減[20]。酶解法生產(chǎn)海藻酸通常采用纖維素酶代替有機溶液體系浸泡,通過酶解原料的細胞壁從而促進海藻膠的析出,進而提高海藻酸的提取率,缺點是纖維素酶成本較高,酶解效果不佳,無法實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)[22]。復(fù)合酶法作為生物技術(shù)在海洋資源轉(zhuǎn)化中應(yīng)用廣泛[23],現(xiàn)有復(fù)合酶法生產(chǎn)海藻酸,是在添加纖維素酶的基礎(chǔ)上引入其他的多糖酶及蛋白酶,效果上優(yōu)于單一纖維素酶,同時降低纖維素酶的添加量、減少成本,但提取效率仍有待提高[24]。根據(jù)Sun等[25]研究表明海藻酸裂解酶為專一性水解海藻酸的酶,可以高效水解海藻,利用其作為輔助提取海藻酸的工具酶可以有效提升海藻酸的提取效率。

本研究主要目的是在纖維素酶和果膠酶這兩種傳統(tǒng)多糖酶的基礎(chǔ)上引入海藻酸裂解酶,在減少其他酶用量的同時,利用海藻酸裂解酶水解海藻酸的高效水解特性提升海藻酸的提取效率,為海藻酸的綠色提取提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

馬尾藻干品:青島洛安生物科技有限公司;纖維素酶:Solaribo公司,酶活力50 000 U/g;果膠酶:河北潤贏生物科技有限公司,酶活力30 000 U/g;海藻酸裂解酶:安徽中弘生物工程有限公司,酶活力100 000 U/g;市售海藻酸復(fù)合酶:青島蔚藍生物股份有限公司;NaH2PO4、Na2HPO4、CaCl2、Na2CO3、NaOH、HCl,上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HK-08B流水式中藥粉碎機,旭朗公司;5904-R高速離心機,Sigma公司;WD-9405B型水平搖床,北京市六一儀器廠;PHS-3C pH 計:上海精科儀器有限公司;JY2002電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 馬尾藻海藻酸的提取方法

對干燥且藻體完整的馬尾藻進行前處理,粉碎機粉碎后過40目篩。馬尾藻藻粉與磷酸鹽緩沖液按照料液比1∶20(m/v)混合均勻進行酶解,用2% NaOH溶液或者10% HCl溶液調(diào)節(jié)pH,50 ℃酶解2 h。加入10%的Na2CO3溶液,55 ℃堿消化1 h。8 000 r/min離心5 min后收集上清液,用2% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6～7,加入10% CaCl2溶液進行鈣析,靜置30 min后8 000 r/min離心5 min收集沉淀。沉淀中加入10% HCl溶液酸化2～4 h,形成海藻酸,離心收集沉淀。沉淀中加入蒸餾水進行水洗,8 000 r/min離心5 min重新收集沉淀,放入70 ℃烘箱中烘干24 h,得到白色固體即為海藻酸。提取海藻酸的工藝流程如圖2所示,計算公式如式1。

圖2 提取海藻酸的工藝流程

(式1)

1.3.2 復(fù)合酶法提取海藻酸單因素實驗

1.3.2.1 不同酶及酶添加量對海藻酸提取的影響

稱量2.00 g前處理后的馬尾藻干品粉末,分別加入馬尾藻干重1%、2%、4%、6%的纖維素酶,1%、2%、3%、4%的果膠酶,1%、2%、3%、4%的海藻酸裂解酶。按照1∶20的料液比,加入磷酸鹽緩沖液,用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH至5.0,50 ℃酶解2 h后按照1.3.1方法制備海藻酸,計算海藻酸提取率。

1.3.2.2 酶解時間對海藻酸提取的影響

確定纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶的添加量為纖維素酶2%、果膠酶3%、海藻酸裂解酶2%。稱量2.00 g前處理后的馬尾藻干品粉末,按照1∶20的料液比,加入磷酸鹽緩沖液,用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH至 5.0,50 ℃酶解30、60、90、120和150 min后按照1.3.1方法制備海藻酸,計算海藻酸提取率。

1.3.2.3 酶解溫度對海藻酸提取的影響

確定纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶的添加量為纖維素酶2%、果膠酶3%、海藻酸裂解酶2%。稱量2.00 g前處理后的馬尾藻干品粉末,按照1∶20的料液比,加入磷酸鹽緩沖液,用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH至 5.0,分別在45、50、55和60 ℃溫度條件下酶解2 h后按照1.3.1方法制備海藻酸,計算海藻酸提取率。

1.3.2.4 酶解pH對海藻酸提取的影響

固定纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶的添加量,依次為纖維素酶2%、果膠酶3%、海藻酸裂解酶2%,稱量2.00 g前處理后的馬尾藻干品粉末,按照1∶20的料液比,加入磷酸鹽緩沖液,用NaOH和HCl溶液分別將pH調(diào)節(jié)至3.5、4.5、5.5、6.5的條件下酶解2 h后按照1.3.1方法制備海藻酸,計算海藻酸提取率。

1.3.3 正交實驗

通過單因素實驗,確定酶添加量、酶提取時間、酶提取溫度、pH為影響提取率的4個主要因素,選用纖維素酶∶果膠酶∶海藻酸裂解酶的加酶比(A)、時間(B)、溫度(C)、pH(D)4個因素做L9(43)正交表(表1)進行條件優(yōu)化,確立最優(yōu)工藝條件。

表1 正交實驗因素與水平

1.3.4 3種海藻酸提取方法的對比實驗

進行傳統(tǒng)化學(xué)法海藻酸提取工藝、現(xiàn)有海藻酸提取復(fù)合酶產(chǎn)品提取海藻酸和優(yōu)化復(fù)合酶法提取海藻酸的對比實驗。

傳統(tǒng)工藝稱量2.00 g前處理后的馬尾藻干品粉末,按照1∶20的料液比,加入磷酸鹽緩沖液,用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH至4.5,55 ℃處理90 min后按照1.3.1方法制備海藻酸,計算海藻酸提取率。

現(xiàn)有復(fù)合酶工藝在傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上加入海藻酸提取復(fù)合酶進行酶解。

優(yōu)化復(fù)合酶工藝在傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上按照1.3.3中正交試驗確定的最優(yōu)工藝進行酶解。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個處理重復(fù)3次,取平均值。實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)分析,Origin Pro 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶種類及其添加量對海藻酸提取率的影響

海藻酸提取率隨著纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶添加量的變化曲線如圖3所示。由圖3分析可得,當(dāng)纖維素酶的添加量為2%時海藻酸提取率最高,之后呈下降趨勢;隨著果膠酶添加量提高,海藻酸提取率呈升高趨勢,在果膠酶添加量為 3%之后上升趨勢平緩;當(dāng)海藻酸裂解酶的添加量為2%時海藻酸提取率最高,之后呈下降趨勢。

圖3 不同酶種類及添加量對海藻酸提取率的影響

纖維酶和果膠酶的酶用量過低時,馬尾藻不能完全降解;酶用量過高則會抑制纖維素酶和果膠酶自身對于馬尾藻降解反應(yīng)的進行[25]。對海藻酸裂解酶來說,除上述原因以外,過多的海藻酸裂解酶會降解大分子的海藻酸使得海藻酸損耗率提升,提取率下降。由此根據(jù)試驗結(jié)果,本試驗條件下纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶的適宜添加量分別為2%、3%和2%。綜合考慮,正交試驗選擇纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶3種酶的比例為2∶2∶2、2∶3∶2和3∶3∶2三個水平進行。

2.1.2 酶解時間對海藻酸提取的影響

海藻酸提取率隨著酶處理時間變化趨勢如圖4所示。由圖4分析可得,使用纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶時,海藻酸提取率都隨著時間的延長呈上升趨勢。使用纖維素酶提取時,在酶提取時間到達120 min以后,馬尾藻的海藻酸提取率無顯著變化;使用果膠酶提取時,在經(jīng)過90 min的酶處理以后,馬尾藻中海藻酸的提取率無明顯提高,120 min與150 min海藻酸提取率相差不大;使用海藻酸裂解酶提取時,經(jīng)過90 min的酶處理后,海藻酸提取率提高趨勢平穩(wěn),在150 min開始略微出現(xiàn)下降趨勢。

圖4 不同酶種類及時間對海藻酸提取率的影響

同大多數(shù)植物細胞一樣,纖維素和果膠是組成馬尾藻細胞壁的兩種主要結(jié)構(gòu)成分,因此,纖維素酶和果膠酶針對纖維素和果膠的降解在酶解馬尾藻中起著主要作用[26]。如果酶提取時間太短,酶活力效果沒有得到充分發(fā)揮;而時間過長又會導(dǎo)致部分酶失去活性,同時,部分大分子的海藻酸也會被海藻酸裂解酶水解導(dǎo)致海藻酸提取率下降。綜合考慮經(jīng)濟效益和提取率等各種因素,酶處理時間選擇120 min,正交試驗時間因素選擇90、120和150 min三個水平進行。

2.1.3 不同酶提取溫度對海藻酸提取率的影響

酶提取溫度對海藻酸提取率的影響變化曲線如圖5所示。由圖5分析可得,對于纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶3種酶,海藻酸提取率都隨著溫度變化呈現(xiàn)波動趨勢。纖維素酶處理的海藻酸提取率隨提取溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,在溫度條件為55 ℃時提取率最高;海藻酸裂解酶處理的海藻酸提取率隨提取溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,溫度條件為55 ℃時海藻酸提取率增長幅度逐漸趨于穩(wěn)定;果膠酶處理的海藻酸提取率隨提取溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,在溫度條件為55 ℃時提取率最高。

圖5 不同酶種類及溫度對海藻酸提取率的影響

酶提取溫度過低,酶活力得不到充分的發(fā)揮,酶反應(yīng)不能充分進行就起不到降解馬尾藻細胞壁的作用;酶提取溫度過高,會導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變形,酶活性減弱或喪失活性,但適當(dāng)?shù)母邷乜梢云鸬狡茐鸟R尾藻細胞壁的作用[27]。綜合考慮經(jīng)濟效益、反應(yīng)過程和海藻酸提取率等各種因素,正交試驗溫度因素選擇50、55和60 ℃三個水平進行。

2.1.4 pH對海藻酸提取率的影響

pH對海藻酸提取率的影響變化曲線如圖6所示。由圖6分析可得,對于纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶3種酶,海藻酸提取率都隨著pH變化呈現(xiàn)波動趨勢。纖維素酶處理的海藻酸提取率隨著pH變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, pH為4.5時海藻酸提取率最高;果膠酶處理的海藻酸提取率隨著pH變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, pH為4.5時海藻酸提取率最高;對于海藻酸裂解酶處理的海藻酸提取率隨著pH變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, pH為5.5時海藻酸提取率最高,隨后趨于穩(wěn)定。

圖6 不同酶種類及pH對海藻酸提取率的影響

改變酶解pH 會影響酶的穩(wěn)定性、酶分子與底物的結(jié)合狀況以及基團的解離狀況等[28],同時適當(dāng)?shù)乃嵝原h(huán)境有助于馬尾藻細胞壁的降解,提高海藻酸的釋放率,從而影響酶解反應(yīng)。綜合考慮經(jīng)濟效益、反應(yīng)過程和海藻酸提取率等各種因素,正交試驗選擇pH 4.5、5.0和5.5三個水平進行。

2.2 正交實驗結(jié)果分析及條件優(yōu)化

正交實驗結(jié)果見表2。由表中數(shù)據(jù)可得,A:加酶比、B:時間、C:溫度和D:pH四個因素對海藻酸提取率的影響由大到小分別為:B>A>D>C,即提取時間對海藻酸提取率影響最大,其次是加酶比例、pH和酶提取溫度,較優(yōu)水平組合為B1A1C2D1,即2%的纖維素酶(馬尾藻干重)、2%的果膠酶(馬尾藻干重)、2%的海藻酸裂解酶(馬尾藻干重)、酶提取時間為90 min、酶提取溫度為55 ℃、pH 4.5,海藻酸提取率最高。

表2 正交實驗及結(jié)果L9(43)

2.3 驗證結(jié)果

根據(jù)正交試驗結(jié)果對最優(yōu)條件經(jīng)行驗證。2%的纖維素酶(馬尾藻干重)、2%的果膠酶(馬尾藻干重)、2%的海藻酸裂解酶(馬尾藻干重)、酶提取時間為90 min、酶提取溫度為55 ℃、pH 4.5,重復(fù)3次,測得條件下馬尾藻中海藻酸的平均提取率為25.44%,該優(yōu)化條件為最優(yōu)條件。

2.4 傳統(tǒng)提取工藝、市售海藻酸復(fù)合酶與優(yōu)化復(fù)合酶提取對比實驗

傳統(tǒng)工藝、市售復(fù)合酶產(chǎn)品和優(yōu)化復(fù)合酶法工藝產(chǎn)海藻酸提取率如圖7所示。其中傳統(tǒng)工藝海藻酸提取率為9.67%,現(xiàn)有復(fù)合酶產(chǎn)品海藻酸提取率在21.33%,優(yōu)化復(fù)合酶工藝海藻酸提取率在25.44%。由此看見,由纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶組成的復(fù)合酶體系,在酶提取溫度55 ℃、pH 4.5和酶提取時間90 min的條件下可以對海藻酸實現(xiàn)有效的提取。

圖7 不同提取方式的海藻酸提取率

3 結(jié)論

本研究著重探討了纖維素酶、果膠酶和海藻酸裂解酶組成的復(fù)合酶體系提取海藻酸及其工藝優(yōu)化,最終確定了2%的纖維素酶、2%的果膠酶和2%的海藻酸裂解酶,按照1∶20的料液比,pH 4.5,55 ℃酶解90 min的酶解體系及工藝條件,在此工藝條件下,海藻酸提取率達(25.43±0.28)%。本研究在傳統(tǒng)工藝與單一酶工藝和簡單復(fù)合酶工藝應(yīng)用傳統(tǒng)多糖酶的基礎(chǔ)上,引入海藻酸裂解酶,海藻酸提取效果得到明顯的改善,海藻酸提取率高于比單一酶提取法,除此之外,復(fù)合酶降解法相對于傳統(tǒng)化學(xué)法提高了163%,提高酶解效率的同時節(jié)省化學(xué)法中試劑的用量,改善海藻酸產(chǎn)品的品質(zhì),是環(huán)境友好型的理想手段,為開展新的復(fù)合酶體系拓寬了思路,也為早日實現(xiàn)酶法工業(yè)化生產(chǎn)海藻酸奠定了基礎(chǔ)。