TGF-β1、MTA 聯(lián)合應用對人牙髓干細胞增殖和分化的影響

柴文宇，李珍珍，殷亮亮，李春年

牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是一類存在于牙髓組織中具有較高自我分化能力及多向分化潛能的干細胞[1]，在牙齒發(fā)育過程中，DPSCs 分化為成牙本質細胞后，不斷分泌形成牙本質,保護牙髓免受有害刺激和細菌入侵[2]，在活髓保存、牙髓再生和骨組織缺損修復等方面發(fā)揮重要作用。

活髓保存治療常用的蓋髓材料有氫氧化鈣、MTA、iRoot BP 等。三氧化礦物凝聚體(mineral trioxide aggregate,MTA)因其具有優(yōu)越的生物相容性、抗菌性、抗炎性、封閉性及誘導牙源性干細胞成牙/成骨分化的能力逐漸應用于活髓保存治療[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，MTA 蓋髓成功率為80.5%，顯著高于氫氧化鈣[4]，且MTA 誘導牙髓組織形成牙本質橋的頻率更高，形成的牙本質更均勻、孔隙少[3,5]。MTA 較多的應用于直接蓋髓術、牙髓切斷術、穿孔修補和根尖屏障等治療過程中[6]，對于活髓保存的治療效果顯著。

轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)是牙本質中含量最豐富的生長因子之一，參與了牙齒生長發(fā)育過程，同時在創(chuàng)傷愈合、血管生成、細胞外基質生成、促進骨髓干細胞增殖和分化以及礦化組織修復等方面發(fā)揮著重要作用[7]。TGF-β1 是牙胚上皮-間充質相互作用過程中的一種信號分子，對成牙本質細胞分化和牙本質基質的分泌有促進作用，能夠誘導DPSCs 向成牙本質細胞分化和修復性牙本質形成[8]，在牙齒發(fā)生病變后，TGF-β1 從脫礦牙本質中釋放出來參與抗炎反應。本研究將TGF-β1 與MTA 聯(lián)合后，處理體外培養(yǎng)的DPSCs，探討對DPSCs 增殖和分化的影響，通過研究TGF-β1、MTA 促進體外培養(yǎng)人牙髓干細胞的分化，為活髓保存時促進人牙髓細胞分化提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（德國ZEISS 公司）；Synergy-TH 酶標儀（美國Biotech 公司）；低溫高速離心機（美國Thermo 公司）；6 孔培養(yǎng)板（美國Thermo Fisher 公司）；96 孔培養(yǎng)板（美國Thermo Fisher 公司）；α-MEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；MTA（美國Pro Root Dentsply 公司）；胎牛血清（以色列BI公司）；PBS（以色列BI公司）；重組人轉化生長因子β1（蘇州近岸蛋白質公司）；茜素紅染色液（北京索萊寶公司）；油紅O 染色液（北京索萊寶公司）

1.2 hDPSCs 的分離、培養(yǎng)和提純

1.2.1 分離培養(yǎng) 選自河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院，收集年齡為15-25 歲患者因正畸或阻生需拔除的前磨牙或第三磨牙。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：2020-027）。將離體牙迅速轉移至超凈工作臺內，取出牙髓組織，剪碎后加入0.5ml的I 型膠原酶(3g/L)和中性蛋白酶(4g/L),消化約40min，終止消化，離心，加入培養(yǎng)基重懸細胞，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)細胞。

1.2.2 細胞提純 取對數(shù)生長期的hDPSCs，有限稀釋法克隆提純細胞，將小于10 個/ml 的細胞懸液接種于96 孔板中，每孔加100μl 細胞懸液。24h 后，挑選只含1 個細胞的孔，做標記，在標記孔內加100μl 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。待單克隆細胞面積擴大至孔底面積的50%以上時，將多個標記孔內的單克隆細胞混合擴大培養(yǎng)，獲得純化后的hDPSCs。

1.3 hDPSCs 的鑒定

1.3.1 表面標記物鑒定 將P3 代細胞消化、離心、重懸后，調整濃度為1×106個/ml；并轉移1ml 至EP 管內，每個EP 管內加入5μl CD34、CD90、CD44、CD45 抗體和同型對照，混勻，室溫下避光孵育20min，清洗并離心，用500μl PBS 重懸細胞，轉移至流式管內，用流式細胞儀鑒定細胞的表面標志物。

1.3.2 多潛能分化鑒定 取生長狀況良好的P3 代hDPSCs 按照2×104個/ 孔的密度接種在包含2ml 完全培養(yǎng)基的6 孔板中。當細胞融合度達到70%～80%時，分別加入成骨誘導液（10%FBS+10nmol/L 地塞米松+50mg/L 維生素C+10μmol/L β-甘油磷酸鈉+100U/ml 青霉素+100μg/ml 鏈霉素+α-MEM），進行成骨分化鑒定；加入成脂誘導液(10%FBS+10μmol/L 地塞米松+200μmol/L 吲哚美辛+10mg/L 胰島素+0.5mmol/L IBMX+100U/ml 青霉素+100μg/ml 鏈霉素+α-MEM)，進行成脂分化鑒定。誘導14d 后，分別用茜素紅染液和油紅O 染色，在顯微鏡下觀察與拍照保存資料。

1.4 實驗分組 取P3 代hDPSCs，隨機分組，設置3個實驗組，包括加入0.2mg/ml MTA的MTA組、加入5μg/L TGF-β1 的TGF-β1 組、同時加入0.2mg/ml MTA 和5μg/L TGF-β1 的MTA+TGF-β1 組。對照組加入完全培養(yǎng)液。

1.5 CCK-8 法檢測細胞增殖 取生長狀況良好的P3 代hDPSCs，以3～5×103個/孔的細胞密度接種于96 孔板。設置MTA 組、TGF-β1 組、MTA+TGF-β1 組和對照組，另設置1 個調零組只加培養(yǎng)液用于檢測結果校正，每組設置5 個復孔。分別連續(xù)培養(yǎng)1d、3d、5d、7d 后，用酶標儀測定各個孔在450nm 處的吸光度值。

1.6 ALP 活性檢測取生長良好的P3 代hDPSCs，以1×105個/ml 的密度接種于6孔板內，待細胞融合達80%后，分組，并設置成骨誘導液組，3 個實驗組和成骨誘導液組的細胞培養(yǎng)液均為成骨誘導液。分別培養(yǎng)7d 和14d 后，每孔加入200μl RIPA 裂解液，離心，取上清備用。根據(jù)堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書（碧云天，中國）進行加樣，用酶標儀檢測各孔405nm 波長處的吸光度值。根據(jù)ALP 活性單位的定義，計算出ALP 的活性。

1.7 實時熒光定量反轉錄PCR（qRT-PCR）選取生長良好的P3 代hDPSCs，以3×105個/孔的細胞密度接種于6 孔板，待細胞生長良好貼壁后，分組，分別連續(xù)培養(yǎng)7d、14d。提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，根據(jù)上海生工生物公司設計引物擴增DSPP、OC、Runx-2 基因。PCR 引物序列表參照表1，以GAPDH 為內參。

表1 引物序列表

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，檢測結果以平均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，顯著性檢驗水準為α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hDPSCs 的分離培養(yǎng)與鑒定 采用改良組織塊酶消化法成功培養(yǎng)出hDPSCs，大多呈長梭形或多角形，有細胞突起，體積較小，核呈卵圓形，核仁大而明顯，傳代后細胞多呈長梭形，細胞生長速度更快，細胞形態(tài)更為一致（圖1）。

圖1 人牙髓干細胞的培養(yǎng)(A.原代細胞培養(yǎng)7 天,×200；B.原代細胞傳代后1 天,×200)

圖2 流式細胞儀檢測細胞表面標志物

2.2 hDPSCs 的鑒定結果

2.2.1 流式細胞儀鑒定結果 CD44(92.80%)、CD90(85.49%) 表達呈陽性，CD34(0.25%)、CD45(0.12%) 表達呈陰性，符合牙髓干細胞的特征。

2.2.2 hDPSCs 經(jīng)過體外成骨誘導液的誘導，茜素紅染色液染色可以看到有明顯的礦化結節(jié)生成（圖3），提示hDPSCs 能夠成骨向分化。經(jīng)過體外成脂誘導液的誘導，hDPSCs 能夠成脂向分化，油紅O 染色液染色后可以觀察到脂滴形成（見圖4）。

圖3 牙髓干細胞成骨誘導14 天(A.對照組，×200；B.成骨誘導組，×100)

圖4 人牙髓干細胞成脂誘導14 天(A.對照組，×200；B.成脂誘導組，×200)

2.3 TGF-β1、MTA 對hDPSCs 增殖的影響 CCK-8 檢測結果顯示，在第1 天，各組對hDPSCs 的增殖作用無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；在第3、5、7 天，各實驗組的OD 值均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；自第3 天開始，各組OD 值不斷升高，相比于第1、3、5 天的實驗結果，第7 天OD 值最高(P＜0.05)；在第3、5、7 天，MTA+TGF-β1 組OD 值高于MTA 組和TGF-β1 組(P＜0.05)；在 第5、7 天時，TGF-β1組OD 值高于MTA 組(P＜0.05)（見圖5）。

圖5 不同組別的細胞培養(yǎng)液作用于牙髓干細胞1、3、5、7 天后細胞增殖活性的比較(****:P ＜0.001)

2.4 TGF-β1、MTA 對hDPSCs 的ALP 活性的影響 在培養(yǎng)的第7 天和14 天，各實驗組的ALP 活性比礦化組和對照組高(P＜0.05)；隨著培養(yǎng)時間的延長，各組第14 天的ALP 活性較第7 天增高(P＜0.05)；MTA+TGF-β1 組的ALP 活性高于MTA組和TGF-β1 組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；在培養(yǎng)的第14 天,與MTA 組相比，TGF-β1 組的hDPSCs 具有較高ALP 活性(P＜0.05)（見圖6）。

圖6 不同組別的細胞培養(yǎng)液作用于牙髓干細胞7、14 天后ALP 表達量的比較(**:P ＜0.01；****:P ＜0.0001)

圖7 不同組別的細胞培養(yǎng)液作用于牙髓干細胞7、14 天后DSPP 相對表達量的比較(****:P ＜0.0001)

圖8 不同組別的細胞培養(yǎng)液作用于牙髓干細胞7、14 天后OC 相對表達量的比較(****:P ＜0.0001)

圖9 不同組別的細胞培養(yǎng)液作用于牙髓干細胞7、14 天后Runx-2 相對表達量的比較(****:P ＜0.0001)

2.5 TGF-β1、MTA 對hDPSCs 中DSPP、OC、Runx-2 的mRNA 相對表達量的影響 實驗結果（圖7-9）所示：細胞培養(yǎng)7、14 天后，與對照組相比，各實驗組的DSPP、OC、Runx-2 等成骨/ 成牙本質相關基因的相對表達量均上調(P＜0.05)；培養(yǎng)至14 天，各組的DSPP、OC、Runx-2 的相對表達量較第7天增高(P＜0.05)；MTA+TGF-β1 組細胞中DSPP、OC、Runx-2 的mRNA 相對表達量均高于MTA 組和TGF-β1 組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

人牙髓干細胞是從人恒牙或乳牙的牙髓組織中分離出來的間充質干細胞[9]，通常位于牙髓組織中的小血管和毛細血管周圍。本研究采取改良組織塊酶消化法[10]應用于細胞培養(yǎng)，hDPSCs 易于從牙髓組織中分離出來，進行原代培養(yǎng)。

MTA 能夠促進軟硬組織的再生，在活髓保存治療中，MTA 誘導牙本質橋形成的頻率較高[11]。Aeinehchi 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，將MTA 和Ca(OH)2同時應用于恒牙直接蓋隨術后，MTA 組牙髓炎癥反應比Ca(OH)2組輕微且6 個月后形成較厚的的牙本質橋，MTA 展現(xiàn)出良好的生物相容性、抗炎性和成骨性[13]。本實驗致力于將TGF-β1 與MTA 聯(lián)合應用于人牙髓組織的活髓保存，有望為臨床治療提供重要參考。

TGF-β1 是一種多功能細胞因子，對牙齒發(fā)育和對外界刺激的反應有調節(jié)作用，并參與牙齒的器官發(fā)生/形態(tài)發(fā)生過程[14，15]。TGF-β1 能夠參與并維持牙髓組織內的生態(tài)平衡，同時可以調節(jié)hDPSCs 的增殖和成骨/成牙本質分化[16]。已有研究表明，TGF-β1 過表達可促進DPSCs 的增殖及成骨分化[17，18，19]。Farea 等[20]發(fā) 現(xiàn)，TGF-β1 可使人脫落乳牙來源的多能干細胞堿性磷酸酶，骨涎蛋白和骨鈣素蛋白表達上調，礦物質沉積。有實驗研究將小鼠體內的TGF-β1 基因敲除，小鼠DPSCs 中牙本質涎磷蛋白的表達水平下降，表現(xiàn)為牙本質發(fā)育缺陷、牙本質礦化不良等[21]。有學者將TGF-β1 和支架材料作為蓋髓材料用于犬的牙齒露髓孔后，牙髓表面有修復性牙本質的形成[22]。綜上，TGF-β1 有望用于臨床活髓保存治療，研究價值重大。

ALP 是礦化組織(骨、牙本質、牙骨質等)產生、再生和代謝等環(huán)節(jié)中的重要成分，在牙齒發(fā)育過程中，成牙本質細胞中ALP 活性逐漸升高，ALP 也是hDPSCs 向成牙本質細胞分化、細胞外基質沉積和牙本質逐漸形成的早期標志[23]。本研究中，在第7、14 天，MTA+TGF-β1 組的堿性磷酸酶活性始終高于其它組，MTA 和TGF-β1 之間可能存在協(xié)同作用。

本實驗中選擇DSPP、OC、Runx-2 作為hDPSCs 成骨/成牙本質分化的標志基因。DSPP主要由成牙本質細胞合成，是hDPSCs 成牙本質細胞分化走向成熟的標志性產物[24]。OC 有調節(jié)礦化和膠原合成的作用，在牙本質礦化過程中起重要作用[25]。Runx-2 在骨形成過程中調節(jié)軟骨、成骨細胞和成牙本質細胞的分化以及多種細胞外基質蛋白的表達[26]。研究結果表明，TGF-β1 與MTA聯(lián)合應用上調了hDPSCs 中DSPP、OC、Runx-2的mRNA 相對表達水平，優(yōu)于單獨應用。

有研究表明，胞外信號調節(jié)激酶/分裂原激活蛋白激酶信號通路(Extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase,ERK/MAPK)在MTA 誘導hDPSCs 向成牙本質樣細胞分化過程中發(fā)揮了作用。細胞內TGF-β 信號主要通過Smad依賴的信號通路傳遞，Smad4 基因突變會導致TGF-β 信號傳導受阻，最終表現(xiàn)為牙根形成短、成牙本質細胞分化和牙本質形成的缺陷等情況[27]。如果敲除大鼠的TβR Ⅱ基因，大鼠牙齒的結構形態(tài)也會受到影響，出現(xiàn)牙本質發(fā)育不良，牙本質明顯變薄，并在成牙本質細胞層下面形成了一層異位的纖維基質，最終導致牙髓閉塞[28]。除了經(jīng)典的TGF-β/Smad 信號通路，ERK/MAPK、Rho 樣GTPase 信號通路和PI3K/Akt 信號通路等非Smad信號途徑也可能在TGF-β 激活過程中起著關鍵作用[29]。ERK/MAPK 能夠介導多種細胞的增殖和遷移等生理過程，有研究證明，TGF-β1 促進牙髓細胞的增殖和分化的作用機制可能與ERK/MAPK信號通路相關，且具有時間和濃度依賴性[30]。TGF-β/Smad 信號通路和其他信號途徑之間存在串擾已被證實，TGF-β1 通過Smad2/3 和MEK/ERK信號傳導,影響尖端乳頭干細胞的增殖、膠原代謝和分化[31]。Chang 等[32]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 可通過ALK5/Smad(2/3)、TAK1、p38 和MEK/ERK 信號通路調節(jié)人脫落乳牙干細胞的增殖、膠原代謝和分化等脫落行為?？赡苁怯捎贛TA 和TGF-β1 存在相近的信號通路調節(jié)機制，使得MTA、TGF-β1聯(lián)合應用的效果優(yōu)于單獨使用。

綜上，TGF-β1 與MTA 聯(lián)合應用促進人牙髓干細胞的增殖、分化的能力優(yōu)于單獨使用MTA 和TGF-β1，分子調控機制有待于進一步研究。