一種快速測定稻瘟病菌群體毒性的簡便方法

吳晗霖 朱紫薇 楊德斌 唐乙冰 姬紅麗 尹勇 彭云良

摘要 選育和布局抗病品種是控制稻瘟病最經(jīng)濟有效的方法，但病菌群體的毒性類型頻率逐步上升導(dǎo)致品種抗性喪失已成為抗性品種選育和推廣的瓶頸問題。為尋找一種能夠為基層單位所掌握且快速、準確的稻瘟病菌群體毒性監(jiān)測方法，本文將不同來源的穗頸瘟標樣分別接種于一套抗稻瘟病單基因系、雜交稻主栽品種及親本和抗源上，30 d后調(diào)查最高病害級別和株發(fā)病率。結(jié)果表明，‘麗江新團黑谷、標樣來源品種及其所含抗瘟基因的單基因系均能穩(wěn)定發(fā)病。4個來自四川盆地的病菌群體對四川主栽品種的毒性明顯強于來自云南楚雄的群體，且這4個病菌群體均具備對Pi-2及‘宜香優(yōu)2115的毒性。來自萬州甘寧鎮(zhèn)‘F優(yōu)498的病菌群體對主栽品種的毒性譜比崇州‘宜香優(yōu)2115來源的病菌更廣。該方法操作簡單，能快速準確地監(jiān)測稻瘟病菌群體毒性狀態(tài)，有助于基層單位更有效地開展稻瘟病防控布局工作。

關(guān)鍵詞 稻瘟病菌;?群體毒性;?快速測定;?雜交稻

中圖分類號： S 435.111

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021675

Abstract Breeding and deploying resistant rice varieties are the most economical and efficient way to control rice blast disease. However， the increase in the frequency of virulent types leads to the breakdown of host resistance， which has been the bottleneck problem in the breeding and deployment of rice blast resistant varieties. To find a simple method for monitoring the population virulence of rice blast fungus which can be mastered by farmers and front technicians， the panicle blast specimens from different sources were inoculated on a set of rice lines and varieties， major hybrid rice varieties used in Sichuan and their parents as well as resistant donors. The highest disease grade rates were investigated after 30 days of incubation. The results showed that ‘Lijiangxintuanheigu， source varieties of the specimens， and the monogenic lines of corresponding resistance genes were stably infected. The virulence of rice blast fungus of four populations from the Sichuan Basin to the main hybrid rice varieties in Sichuan province was obviously stronger than a population from Chuxiong in Yunnan province. The four pathogen populations from the Sichuan Basin was also virulent to Pi-2 and ‘Yixiangyou 2115. The population of rice blast fungus collected from ‘F you 498 at Ganning in Wanzhou was virulent to more hybrid rice varieties than the population from ‘Yixiangyou 2115. This method is simple and can quickly and accurately monitor the population toxicity of Magnaporthe oryzae， which is helpful for farmers and front technicians to carry out more effective prevention and control measures against rice blast disease.

Key words Magnaporthe oryzae;?population virulence;?quick determination;?hybrid rice

由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是危害我國和世界水稻生產(chǎn)的最重要病害之一［1］。在我國，近年來稻瘟病發(fā)生面積在400萬hm2左右，引起糧食損失30萬～60萬t［2-3］。除處理種子和病稻草、施用殺菌劑外，選育和推廣抗稻瘟病品種被廣泛認為是最經(jīng)濟、有效和對環(huán)境友好的方法并取得了大面積成功。但是，由于稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、易變，抗性品種大面積推廣后，病菌群體中能夠克服寄主抗性的毒性類型頻率逐步上升進而導(dǎo)致品種抗性喪失，已經(jīng)是稻瘟病抗性品種選育和推廣所面臨的瓶頸問題［4-6］。在四川，雜交稻大面積推廣以后已經(jīng)歷了3次因為水稻主栽品種抗性作用喪失而導(dǎo)致的稻瘟病流行高峰［7-8］。對稻瘟病菌毒性變異及時加以監(jiān)測，是合理布局水稻抗性品種的前提，為此各地普遍設(shè)置田間病圃，或?qū)μ镩g采集、分離稻瘟病菌單孢菌株進行室內(nèi)接種鑒定，根據(jù)一套統(tǒng)一品種的抗感表現(xiàn)來鑒定病菌毒性［9］。前者易受病圃所在環(huán)境條件的影響，病圃發(fā)病往往不充分而影響鑒定結(jié)果。而稻瘟病菌分離、培養(yǎng)和接種各個環(huán)節(jié)需要熟練的操作技術(shù)而難以為基層部門所掌握，因此有必要尋找一種能夠為基層單位所掌握且快速、準確的稻瘟病菌群體毒性監(jiān)測方法，以利于指導(dǎo)本地的抗性品種合理布局并及時發(fā)現(xiàn)病菌新的毒性變異類型。

1?材料與方法

1.1?水稻種子

抗稻瘟病單基因系24個品種由美國俄亥俄州立大學(xué)王國梁教授提供，在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所保存并繁殖;四川雜交骨干親本‘IR24‘明恢63‘多恢1號‘成恢448‘內(nèi)恢99-14‘谷梅4號‘地谷B‘華占‘五山絲苗以及普感品種‘麗江新團黑谷（LTH）由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所向育種部門征集并保存、繁殖;四川省雜交水稻主栽品種（表2）由四川省各地、市植保站自當(dāng)?shù)胤N子市場采樣并送至四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所保存于4℃冷庫備用。

1.2?稻瘟病穗頸瘟樣本采集

2021年7月-9月在四川省崇州市街子鎮(zhèn)水稻品種‘宜香優(yōu)2115、綿竹縣新市鎮(zhèn)農(nóng)民種植雜交稻未知品種、廣元市昭化區(qū)衛(wèi)子鎮(zhèn)常規(guī)稻未知品種、重慶市萬州區(qū)甘寧鎮(zhèn)水稻品種‘F優(yōu)498以及云南省楚雄州蒼嶺鎮(zhèn)育種基地稻瘟病發(fā)生田塊，每塊田沿病田四周以對角線五點采樣法采集稻瘟病穗頸瘟樣本120～150穗，去除谷粒后曬干，剪取以病斑為中心12～15 cm長的病稻草保存于帶藍色硅膠的密閉容器內(nèi)備用。

1.3?接種試驗方法

試驗于2021年8月在位于四川省成都市郫都區(qū)四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地網(wǎng)室2 m×8 m水泥池進行。

1）田塊整理及劃線：播種前除去水泥池內(nèi)雜草，按10 kg/666.7 m2用量施用1次復(fù)合肥，翻耕后泡水。1 d后將田塊整理成約寬0.5 m、高0.2 m的廂塊，抹平過夜，四周留淺水溝通至水泥池排水口;播種當(dāng)天將廂面再次抹平，去除廂面積水，掏深廂溝，然后用秧繩按5 cm×6 cm劃線。

2）播種：每個小區(qū)播種材料為抗稻瘟病單基因系24個品種、雜交稻主栽品種及其親本和抗源，選取發(fā)芽一致的種子，待測品種穴播于橫向與豎向兩條線交叉的位置，每個品種播種8～10粒，覆蓋約0.5 cm厚的干細土。廂四周設(shè)保護行，保護行采用普感品種‘麗江新團黑谷（LTH）。共播種5個小區(qū)，各品種及對照重復(fù)1次。

3）播種后管理：a.播種結(jié)束后，每一廂覆蓋薄膜，并在薄膜上打孔通氣降溫。b.預(yù)防立枯?。核境鲅亢?，在芽長至1.5 cm以前，用75%百菌清可濕性粉劑（山東華陽農(nóng)藥化工集團有限公司）600倍稀釋液噴霧一次，水稻第一片真葉抽出后，及時灌1 cm左右水，以防立枯病。

4）穗頸瘟標樣接種：水稻第3片真葉出齊后，準備5個保鮮盒裝滿清水，將來自不同地方的病稻草各選取60根分別浸泡于保鮮盒清水中，并壓重物致使病稻草完全淹沒。室溫下保持4 h后，將病稻草從水中撈出，輕輕甩去多余水分，于傍晚時間均勻地撒在水稻幼苗上。每兩個小區(qū)接種一個地區(qū)的病稻草標樣60根。

5）接種后管理：接種后用常規(guī)噴霧器噴霧至各葉片濕潤有水珠后，覆蓋無孔新薄膜，四周覆蓋過篩細土以確保密封防止病菌孢子外逸。次日起每天8：00-17：00用溫室微噴系統(tǒng)噴霧降溫和保濕。

6）病害調(diào)查：接種后30 d按國際水稻研究所（IRRI）分級標準［10］調(diào)查葉瘟發(fā)病級別。其中0級：全葉片無??；1級：葉片上有針尖大小的褐色壞死斑；2級：葉片上有較大的褐色壞死斑，但無典型的病斑；3級：葉片上有小而圓以至稍長的褐色壞死斑，中央部分灰白色（直徑1～2 mm）；4級：有典型的稻瘟病病斑或橢圓形，長1～2 cm，常限于兩條葉脈間，病斑面積占葉片總面積比≤5%；5級：有典型的稻瘟病病斑，5%＜病斑面積占葉片總面積比≤10%；6級：有典型的稻瘟病病斑，10%＜病斑面積占葉片總面積比≤25%；7級：有典型的稻瘟病病斑，25%＜病斑面積占葉片總面積比≤50%；8級：有典型的稻瘟病病斑，50%＜病斑面積占葉片總面積比≤75%；9級：有典型的稻瘟病病斑，75%＜病斑面積占葉片總面積比≤100%。其中0級、1級、2級為抗病，3級及以上的病級為感病，此外，記錄各品種感病株數(shù)以及調(diào)查總株數(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同抗稻瘟病單基因系對不同來源穗瘟標樣接種的反應(yīng)

接種保濕30 d以后，24個抗稻瘟病單基因系和普感品種‘LTH的最高反應(yīng)型和株發(fā)病率結(jié)果見表1。普感品種‘LTH接種5個不同地點來源穗頸瘟樣品后均表現(xiàn)感病，此外來自含有Pi-2（Pi-z5）基因的‘宜香優(yōu)2115的穗頸瘟樣品可引起單基因系‘IRBLz5-CA（含Pi-2基因）發(fā)病，來自‘F優(yōu)498（含Pi-zt基因）的穗頸瘟樣品可引起單基因系‘IRBLzt-T（含Pi-zt基因）發(fā)病。在24個單基因系中，僅有含Pi-19（t）的‘IRBL19-M對各個稻瘟病群體均表現(xiàn)抗病，在對來自四川盆地的4個稻瘟病穗頸瘟標樣的反應(yīng)中，含Pi-km的‘IRBLkm-Ts均表現(xiàn)抗病。含Pi-sh、Pi-11基因的單基因系則對5個不同來源的穗瘟標樣均表現(xiàn)感病。從引發(fā)感病的單基因系數(shù)目看，來自崇州市街子鎮(zhèn)‘宜香優(yōu)2115病田的稻瘟病菌毒性明顯強于其他來源的病菌，而其他來源的病菌對各個基因的毒性又各不相同。除了‘宜香優(yōu)2115來源外，來自昭化區(qū)衛(wèi)子鎮(zhèn)未知品種的育種材料和萬州區(qū)甘寧鎮(zhèn)‘F優(yōu)498的穗頸瘟標樣保濕接種后，也能引起含Pi-2基因的單基因系產(chǎn)生感病反應(yīng)，反應(yīng)型分別為3級和4級，株發(fā)病率分別為5%和21%。

2.2?雜交稻主栽生產(chǎn)品種及其親本或抗源對不同來源穗瘟標樣接種后的反應(yīng)

‘宜香優(yōu)2115和‘F優(yōu)498穗頸瘟標樣回接30 d后，兩品種的最高病級分別為7級和5級，株發(fā)病率分別為67%和29%（表2）。來自萬州區(qū)甘寧鎮(zhèn)‘F優(yōu)498和綿竹市新市鎮(zhèn)未知品種的穗頸瘟標樣也能引起‘宜香優(yōu)2115發(fā)病，最高病害級別分別是4級和3級，株發(fā)病率分別為29%和14%（表2）。4個四川雜交稻主栽品種都至少能抵抗1個地點穗頸瘟標樣上的稻瘟病菌，其中‘天優(yōu)華占等15個品種對5個地點的穗頸瘟標樣均抗病，而‘F優(yōu)498和‘崗優(yōu)99對來自四川盆地4個地點的穗頸瘟標樣均感病?！ㄘS2號‘豐大優(yōu)2590‘岡優(yōu)825‘隆兩優(yōu)1206‘正優(yōu)808以及‘宜香優(yōu)2115對3個來自四川盆地的穗瘟標樣感病。用來自萬州區(qū)甘寧鎮(zhèn)‘F優(yōu)498、綿竹市新市鎮(zhèn)未知品種的穗頸瘟標樣接種后則分別引起34個生產(chǎn)品種中的17個和15個發(fā)病，來自崇州市街子鎮(zhèn)‘宜香優(yōu)2115和昭化區(qū)衛(wèi)子鎮(zhèn)未知育種材料的穗頸瘟標樣分別引起4個和6個四川生產(chǎn)品種發(fā)病，而來自云南省楚雄縣蒼嶺鎮(zhèn)的穗頸瘟標樣僅能引起1個四川主栽品種發(fā)病。

在四川歷史上曾經(jīng)大面積推廣的雜交稻骨干親本和抗源材料中，僅‘內(nèi)恢99-14‘華占和‘谷梅4號接種5個不同來源的穗頸瘟標樣后仍表現(xiàn)抗病，‘宜香優(yōu)2115穗頸瘟標樣能夠引起‘IR24和‘五山絲苗感病，而來自綿竹市新市鎮(zhèn)未知品種和萬州甘寧鎮(zhèn)‘F優(yōu)498的穗頸瘟標樣能引發(fā)‘地谷B感病反應(yīng)。代表性供試水稻品種接種穗頸瘟標樣后發(fā)病情況如圖1所示。

3?結(jié)論與討論

目前，分析各地稻瘟病菌群體毒性的方法主要依靠在田間設(shè)置病圃種植統(tǒng)一的水稻品種或采集、分離稻瘟病菌單孢菌株接種統(tǒng)一的水稻品種，再根據(jù)品種的發(fā)病情況進行分析。病圃發(fā)病受到光照、溫濕度和病菌數(shù)量等條件影響，往往播種后數(shù)月發(fā)病還不充分。單孢菌株接種則需要專用設(shè)備、設(shè)施和技術(shù)熟練的人員，需時24～30 d。張姝等［5］報道帶菌病稻草或稻節(jié)可直接接種于水稻幼苗進行抗性鑒定。本試驗結(jié)果表明，接種稻瘟病穗頸瘟標樣保濕30 d后，‘麗江新團黑谷、標樣來源品種及其與標樣來源品種含有相同基因的單基因系均能夠發(fā)病，表明接種成功。而同期采用35個分離自“宜香優(yōu)2115”的單孢菌株噴霧接種1次后，35個菌株均能引起‘麗江新團黑谷發(fā)病，但12個菌株未能引起‘宜香優(yōu)2115的父本‘雅恢2115發(fā)病，其確切毒性仍須重復(fù)測定。因此，苗期接種保濕穗頸瘟標樣的群體毒性測定方法具有簡單、易操作的特點，用時和單孢分離菌株接種相當(dāng)，易為基層單位和農(nóng)戶掌握。在早春和秋季不燒苗條件下，可以不需要噴霧降溫，在露地搭拱蓋薄膜即可進行。如病害樣品足夠，則可以同時開展重復(fù)測定而獲得更可靠數(shù)據(jù)。

本試驗結(jié)果中，來自綿竹市新市鎮(zhèn)的穗頸瘟標樣能夠引起4株‘成恢448和7株‘宜香優(yōu)2115中的1株產(chǎn)生3級病斑，但未能引起含Pi-km和Pi-2的單基因系發(fā)病，這可能與病菌群體中對這兩個基因的毒性菌株頻率和適合度有關(guān)，進一步進行分菌株測定和連續(xù)監(jiān)測將有助于了解病菌群體毒性演化進程。

試驗結(jié)果表明，四川盆地幾個群體的病菌對四川雜交稻主栽品種的毒性顯著強于來自云南楚雄的群體，楚雄病菌群體所引發(fā)稻瘟病的單基因系數(shù)目也較少，進一步在田間印證這種差異，分析四川品種所含抗性基因，將有助于當(dāng)?shù)氐目剐云贩N選育和布局。

含有Pi-2等抗稻瘟病基因的‘宜香優(yōu)2115自2012年通過審定以來，目前已成為長江上游推廣面積最大的水稻生產(chǎn)品種［11-12］。根據(jù)筆者調(diào)查，該品種目前已在貴州興義市表現(xiàn)發(fā)病，2021年在四川崇州市田間發(fā)生葉瘟和穗頸瘟，回接結(jié)果表明能夠完成科赫氏法則。除了‘宜香優(yōu)2115田間發(fā)病標樣外，其他3個四川盆地病菌群體也具備了對Pi-2乃至‘宜香優(yōu)2115的毒性，甚至來自萬州甘寧的‘F優(yōu)498的稻瘟病菌群體對其他雜交稻主栽品種的毒性較‘宜香優(yōu)2115來源病菌更強。因此，加強病菌群體對Pi-2和‘宜香優(yōu)2115毒性的監(jiān)測，及時篩選對當(dāng)前流行和潛在流行菌系兼具抗性的水稻品種和抗性基因，對于病害控制和糧食安全具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：田?喆）