百香果果皮主要有效成分連續(xù)提取工藝

陳雪梅　劉夏蕾　林標(biāo)聲　陳小紅　黎英

關(guān)鍵詞：百香果皮；果膠；花色苷；膳食纖維；連續(xù)提取

中圖分類號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

百香果（Passiflora edulis Sims.）為一種多年生常綠草質(zhì)或半木質(zhì)藤本攀緣植物，屬于西番蓮科，主產(chǎn)于我國(guó)福建、廣東、海南、臺(tái)灣等亞熱帶及熱帶地區(qū)，因其獨(dú)特濃郁的風(fēng)味與香氣而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。其果實(shí)不僅富含果膠、多酚類、膳食纖維、維生素、微量元素等160 多種有益成份，還含有具有生津止咳、養(yǎng)顏抗衰、抑菌抗炎、安神抗焦慮作用的活性成分，因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、餐飲和保健領(lǐng)域[1-5]。

龍巖市由于特殊的土壤、氣候條件，逐漸成為中國(guó)最大、最優(yōu)的百香果基地，目前全市百香果種植面積約0.14 萬(wàn)hm²，年產(chǎn)值過(guò)億元。由于百香果一年陸續(xù)掛果、多次成熟，采收期長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月，單產(chǎn)收益高，且當(dāng)年種植當(dāng)年受益，是一項(xiàng)投資少、見(jiàn)效快、效益高的扶貧攻堅(jiān)項(xiàng)目。百香果產(chǎn)業(yè)已成為福建省的新興特色產(chǎn)業(yè)。

由于百香果栽培面積已迅速擴(kuò)增，而市場(chǎng)上還主要以百香果鮮果進(jìn)行流通銷售，百香果果皮水分含量高，導(dǎo)致其易腐爛變質(zhì)，貯藏困難。目前，百香果產(chǎn)品存在品種類型較為單一，開(kāi)發(fā)利用不足，加工技術(shù)含量低，附加值不高的情況，如對(duì)于百香果果肉的開(kāi)發(fā)主要集中在果汁飲料加工，百香果果皮主要生產(chǎn)果脯、果醬及蜜餞類等初加工產(chǎn)品[6-7]。近年來(lái)，有關(guān)百香果果皮中有效成分提取工藝方面的相關(guān)研究已有不少報(bào)道，但是眾多提取方法均存在一些不足，例如，用石油醚、無(wú)水乙醇等有機(jī)溶劑分別浸提油溶性色素、水溶性色素的工藝存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作工藝繁雜、部分溶劑不能回收循環(huán)利用、能耗大等問(wèn)題[8-10]。而有關(guān)果膠提取工業(yè)化生產(chǎn)大部分采用酸解沉淀法，在強(qiáng)酸高溫或長(zhǎng)時(shí)間加熱過(guò)程中，原料中的果膠不可避免地發(fā)生分解或變性，其粘度、凝膠性等理化性能下降；且經(jīng)酸法處理后果皮中的多價(jià)金屬離子、低分子物質(zhì)等雜質(zhì)仍會(huì)殘留于果膠中，造成提取的果膠數(shù)量和質(zhì)量也不理想[11-14]。而從百香果果皮中提取膳食纖維一般采用浸泡或熱提取法，浸提率均不理想，存在生產(chǎn)率低和產(chǎn)品純度不高等問(wèn)題[15-18]。此外，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)百香果果皮中有效成分的研究大多是單提研究，成本較高，往往是提取出了產(chǎn)品得不到效益，鮮有2 種或2 種以上提取物產(chǎn)品的聯(lián)產(chǎn)研究，更未見(jiàn)一次性連續(xù)提取百香果果皮中果膠、花色苷和膳食纖維3 種有效成分的文獻(xiàn)報(bào)道。

因此，本研究將建立一次性連續(xù)從百香果果皮中提取果膠、花色苷和膳食纖維3 種有效成分的聯(lián)產(chǎn)工藝，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)果膠、花色苷和膳食纖維的提取工藝關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，使工藝更加接近實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。以減少資源浪費(fèi)、環(huán)境污染、提取劑消耗及降低生產(chǎn)成本，同時(shí)為百香果果皮的精深加工和高值化利用提供示范。

1 材料與方法

1.1 材料

百香果果皮由龍巖道心農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，果皮為紫紅色，清洗、干燥、烘干、粉碎過(guò)篩后備用；咔唑（P），D-（+）-半乳糖醛酸：北京博奧拓科技有限公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷：成都曼斯特生物科技有限公司；MRS 培養(yǎng)基：北京奧博星；嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）、保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus）：中國(guó)微生物菌種保藏中心。

真空冷凍干燥機(jī)（FD-1-50 型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；真空干燥箱（DZF-6050 型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；實(shí)驗(yàn)室微波爐（JOYN-HIC1 型上海喬躍電子有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA N-1300，日本東京理化公司）。

1.2 方法

1.2.1 聯(lián)產(chǎn)工藝技術(shù)路線圖設(shè)計(jì) 連續(xù)從百香果果皮中提取果膠、花色苷和膳食纖維3 種有效成分的聯(lián)產(chǎn)工藝流程圖見(jiàn)圖1。該工藝流程圖主要包括三部分：（1）將百香果果皮粉碎，過(guò)100 目篩，取10.0 g 粉末，加入蒸餾水，50℃水浴60 min后調(diào)節(jié)pH，采用微波處理，真空抽濾，濾渣重復(fù)操作2 次，合并3 次濾液，濃縮，加入4 倍95%乙醇靜置過(guò)夜，離心，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥得百香果皮果膠；（2）用蒸餾水反復(fù)沖洗提取果膠后的料渣，按比例加入50%濃度的乙醇，調(diào)節(jié)pH，超聲波處理，分離，料渣重復(fù)提取2 次，合并3 次提取液，濃縮，冷凍干燥，即得百香果皮花色苷；（3）將多次提取花色苷后的料渣，加入適量的水和脫脂奶粉混勻后滅菌，冷卻、接種、發(fā)酵，過(guò)濾洗滌2 次，均質(zhì)，真空干燥后即得膳食纖維。

1.2.2 百香果皮果膠提取 采用微波輔助提取，按1.2.1 步驟操作，采用硫酸咔唑法測(cè)定其半乳糖醛酸含量[19]，測(cè)528 nm 處吸光度。果膠得率=[（C×V×N）/10⁶×W]×100%，式中，C 為半乳糖醛酸濃度，μg/mL；Ⅴ為果膠原液體積，mL；N 為果膠提取液稀釋倍數(shù)；W 為百香果皮粉質(zhì)量，g。

（1）單因素試驗(yàn)。稱取10.0 g 百香果皮粉末，60℃水浴1.0 h 后，預(yù)設(shè)液料比50∶1（mL/g），pH 2.0，微波時(shí)間5.0 min，微波功率450 W 為提取工藝參數(shù)中的常規(guī)量，以百香果皮果膠得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別選取液料比為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1（mL/g），pH 為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5，微波功率為200、300、400、500、600、700 W，微波時(shí)間為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 min，這4 個(gè)因素中的6 個(gè)單因素變量替換工藝參數(shù)中相應(yīng)的常規(guī)量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

（2）響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。依據(jù)上述單因素試驗(yàn)優(yōu)化果膠得率的測(cè)定結(jié)果，借助Design Expert8.0.6 軟件，選用Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，以百香果皮果膠得率（Y）為響應(yīng)值，采用A：液料比50∶1、60∶1、70∶1（mL/g），B：pH 為2.0、2.5、3.0，C：微波功率400、500、600 W，D：微波時(shí)間4.0、6.0、8.0 min，進(jìn)行4 因素3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.3 百香果皮花色苷提取 對(duì)微波提取果膠后的百香果果皮料渣采用超聲輔助乙醇法提取花色苷，按1.2.1 步驟操作。利用矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密稱取1.00 mg 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，50%乙醇定容，稀釋成濃度為0.0～80.0 μg/mL，測(cè)510 nm 處吸光度， 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.0106C+0.0062（R²=0.9993）?；ㄉ盏寐?[（C×V×N）/10⁶×W]×100%，式中，C 為花色苷濃度，μg/mL；V 為花色苷原液體積，mL；N 為花色苷提取液稀釋倍數(shù)；W 為百香果皮粉質(zhì)量，g。

（1）單因素試驗(yàn)。在乙醇質(zhì)量濃度為50%條件下，預(yù)設(shè)提取工藝參數(shù)中的常規(guī)量為液料比60∶1（mL/g），pH 3.0，超聲功率500 W，超聲時(shí)間30 min，分別考察液料比為40∶1～80∶1（mL/g），pH 為2.0～4.0，超聲功率為400～600 W，超聲時(shí)間為20～60 min，這4 個(gè)因素中5 個(gè)單因素變量對(duì)百香果皮花色苷得率的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。依據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化花色苷得率的測(cè)定結(jié)果，選取A：液料比50∶1、60∶1、70∶1（mL/g），B：pH 為3.0、3.5、4.0，C：超聲功率500、550、600 W，D：超聲時(shí)間20、30、40 min 為自變量，以測(cè)得的百香果皮花色苷得率（Y）為參考指標(biāo)，在響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析中采用4 因素3 水平進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.2.4 百香果皮膳食纖維提取 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按1∶1 體積混合，經(jīng)乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）平板活化、液體搖床150 r/min 培養(yǎng)，擴(kuò)培20 h，待用。將多次超聲提取花色苷后的料渣按1.2.1 步驟進(jìn)行接種發(fā)酵。其中膳食纖維得率=（m/W）×100%，式中，m 為膳食纖維質(zhì)量（g）；W 為百香果皮粉質(zhì)量（g）。

（1）單因素試驗(yàn)。把料渣置于250 mL 錐形瓶中，加入8.0%的脫脂奶粉后，預(yù)設(shè)液料比15∶1（mL/g），接種量8.0%，發(fā)酵溫度36℃，發(fā)酵時(shí)間25 h 為工藝參數(shù)中的常規(guī)量，以膳食纖維得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察液料比5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1（mL/g），接種量2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，發(fā)酵溫度28、32、36、40、44℃，發(fā)酵時(shí)間15、20、25、30、35 h，這4 個(gè)因素中5個(gè)單因素對(duì)百香果皮膳食纖維提取效果的影響。

（2）優(yōu)化試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，選取液料比10∶1、12.5∶1、15∶1（mL/g），接種量4.0%、6.0%、8.0%，發(fā)酵溫度32、36、40℃，發(fā)酵時(shí)間15、20、25 h，這4 個(gè)因子進(jìn)行響應(yīng)面法分析。

1.2.5 聯(lián)產(chǎn)提取與單獨(dú)提取效果比較試驗(yàn) 采用本聯(lián)產(chǎn)工藝研究中各階段得到的優(yōu)化參數(shù)，與單獨(dú)微波輔助提取果膠、超聲波輔助提取花色苷和發(fā)酵法提取膳食纖維進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，比較連續(xù)提取和單提間的提取效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Design Expert 8.0.6、Origin 8.6和SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 聯(lián)產(chǎn)提取工藝中百香果皮果膠制備條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析 由圖2 可知，液料比小于60∶1（mL/g）時(shí)百香果皮果膠得率隨液料比的增加而上升，之后得率增減幅度不大?？赡苁且毫媳冗^(guò)小時(shí)不利于百香果皮充分浸制導(dǎo)致果膠未能完全溶出， 而浸提濃度大于60 ∶ 1（mL/g）后溶劑會(huì)加大對(duì)微波能量消耗，不利溶質(zhì)對(duì)微波能量的吸收導(dǎo)致得率下降。綜合考慮濃縮時(shí)能耗、時(shí)長(zhǎng)、浸提效果和成本等因素，故料液比選擇50∶1～70∶1（mL/g）為宜。

pH 不同，對(duì)果皮組織結(jié)構(gòu)的破壞力和原果膠分解程度也不同。因此，只有在一定酸度條件下，才可以加快原果膠水解成果膠，得率才能達(dá)到最大值，若低于或高于該值，會(huì)造成其破壞力減弱或果膠側(cè)鏈部分分解。故pH 選擇2.0～3.0 為宜。

果膠得率在微波功率500 W 達(dá)最大值，可能開(kāi)始時(shí)微波的穿透力和熱效應(yīng)隨功率的增大而增強(qiáng)，有助于水介質(zhì)摩擦撕裂植物細(xì)胞壁，加速細(xì)胞內(nèi)原果膠的水解，促進(jìn)果膠的溶出和擴(kuò)散；接著得率下降是因果膠在酸性條件下耐熱性較差，過(guò)大功率會(huì)增大體系壓力使細(xì)胞及溶劑局部升溫過(guò)高，引起部分果膠裂解為多糖分子[19-20]，且功率過(guò)高提取液容易溢出引起實(shí)驗(yàn)誤差。故微波功率為400～600 W 較適宜。

隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)，果膠得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)微波時(shí)間為6.0 min 時(shí)得率達(dá)到最大值，之后得率急劇下降，可能是因?yàn)樘幚頃r(shí)間過(guò)短時(shí)提取液內(nèi)部壓力值和溫度較小，果膠浸提不完全，而后部分果膠在長(zhǎng)時(shí)間微波作用下被熱裂解導(dǎo)致得率下降[21-22]。故微波時(shí)間選擇4.0～8.0 min 較合理。

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 按1.2.2（2）中方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性處理，得到29 組不同因素組合試驗(yàn)，其中包括5 個(gè)中心點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)表1 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸設(shè)計(jì)及分析，獲得百香果果膠得率對(duì)4 個(gè)編碼自變量的相關(guān)回歸系數(shù)，其二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=?122.95308+0.54447×A+16.16833×B+0.40307×C+2.55867×D?0.03600×A×B?4.50000×10^?5×A?6.37500×10^?3×A×D+1.80000×10^?3×B×C+0.08000×B×D?3.07500×10^?3×C×D?3.45250×10^?3×A²?3.05100×B²?4.34100×10^?4×C²?0.095062×D²，進(jìn)一步對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2 方差分析數(shù)據(jù)顯示，決定系數(shù)R²=0.9024，校正系數(shù)R²_adj=0.8047，其回歸模型達(dá)到極顯著水平P<0.0001，失擬項(xiàng)P=0.0864>0.05，表明該模型與實(shí)際情況擬合程度良好。其次其置信度較高，變異系數(shù)CV=2.68%，因此可以用此回歸模型對(duì)百香果皮果膠得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。自變量B 和交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、BD、CD均不顯著（P>0.05），自變量D 及二次項(xiàng)中的B²、C² 、D²對(duì)百香果皮果膠得率有極顯著影響（P<0.01），自變量A、C 和二次項(xiàng)中的A²對(duì)百香果皮果膠得率有顯著影響（P<0.05）。因素間對(duì)百香果皮果膠得率的影響程度順序?yàn)椋篋（微波時(shí)間）＞A（液料比）＞C（微波功率）＞B（pH）。

圖3 直觀反映了各因素和因素間交互作用對(duì)百香果皮果膠得率的影響，從變化速率來(lái)看，主效應(yīng)大小為：微波時(shí)間＞液料比＞微波功率＞pH，在各因素中微波時(shí)間對(duì)百香果皮果膠得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而料液比和微波功率次之，表現(xiàn)為曲線較為平緩，pH 和其他兩兩因素之間對(duì)果膠得率的交互作用不明顯，這和表2 中數(shù)據(jù)的差異顯著性相吻合。

2.1.3 提取工藝條件優(yōu)化和驗(yàn)證 模型預(yù)測(cè)獲得最佳條件為：液料比64.36∶1（mL/g），pH 2.47，微波功率455.10 W，微波時(shí)間4.98 min，百香果皮果膠得率最大理論值為12.61%?？紤]實(shí)際操作可行性，優(yōu)化為液料比65∶1（mL/g）、pH 2.5、微波功率450 W、微波時(shí)間5.0 min，并進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，百香果皮果膠得率平均值為（12.45±0.06）%。與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.27%，表明所建立的模型能夠預(yù)測(cè)實(shí)際百香果皮果膠提取，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.2 聯(lián)產(chǎn)工藝中百香果皮花色苷制備條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析 由圖4 可知，隨著液料比的增加，百香果皮花色苷得率也不斷增加，當(dāng)液料比在60∶1～80∶1（mL/g）時(shí)，得率趨于平穩(wěn)?？赡芤蚰繕?biāo)成分的溶出和擴(kuò)散主要受傳質(zhì)動(dòng)力影響，增加溶劑量會(huì)加大對(duì)超聲波能量消耗，導(dǎo)致溶質(zhì)所吸收的超聲能量下降?？紤]到溶劑成本和后續(xù)濃縮操作，故選取液料比50∶1～70∶1（mL/g）為佳。

隨著pH 的增大先增后降，在pH 3.5 左右花色苷得率達(dá)最大值?？赡苡捎诎傧愎ㄉ战Y(jié)構(gòu)中含酚羥基在適宜溫和的酸性條件下容易與水分子形成分子間氫鍵，從而增加花色苷的溶解性和穩(wěn)定性[8， 23-24]。當(dāng)pH 為2.0 時(shí)酸性較強(qiáng)容易造成氫鍵斷裂，pH 為4.0 時(shí)酸性較弱不易形成氫鍵，故得率都較低。因此，最佳pH 選擇3.5 左右比較適宜。

在超聲功率為550 W 時(shí)花色苷得率達(dá)到最大值，而后呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)槌暡üβ瘦^小時(shí)空化效應(yīng)較弱，不利于花色苷的滲出和擴(kuò)散，當(dāng)功率過(guò)高時(shí)超聲產(chǎn)生的空化作用過(guò)于激烈引起局部升溫過(guò)快，進(jìn)而斷裂部分百香果花色苷分子結(jié)構(gòu)，使得率降低[25]。故超聲功率選500～600 W 為佳。

隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)花色苷得率先升后降?？赡荛_(kāi)始料渣中的花色苷因溶液內(nèi)部溫度和壓力較小浸提不徹底，超聲30 min 后即可達(dá)完全滲透，而后在長(zhǎng)時(shí)間的超聲波機(jī)械剪切力作用下部分百香果花色苷被降解而損失[25]?？紤]到能耗提取時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng)，因此，以20～40 min 超聲時(shí)間較適宜。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 按1.2.2（2）中方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，方案和花色苷得率結(jié)果見(jiàn)表3。

使用響應(yīng)面分析法對(duì)表3 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得到相關(guān)回歸系數(shù)，其回歸方程為：Y=?16.97017+0.15090×A+1.43100×B+0.03963×C+0.01278×D+2.50000×10^?3×A×B?1.65000×10^?4×A×C+1.75000×10^?4×A×D+6.00000×10^?4×B×C+0.00000×B×D?1.00000×10^?5×C×D?6.11667×10^?4×A²?0.27467×B²?2.84667×10^?5×C²?2.61667×10^?4×D²，進(jìn)一步對(duì)回歸方程進(jìn)行分析（表4）。

由表4 可知，模型P<0.0001 達(dá)到極顯著水平，表明不同處理組之間差異顯著； 模型失擬項(xiàng)P=0.0870>0.05 不顯著，證明所選模型適宜；并且決定系數(shù)R2=0.9864，說(shuō)明誤差對(duì)模型的影響小擬合程度良好；校正系數(shù)R2adj=0.9728，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性，較好反映液料比、pH、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)百香果皮花色苷得率的關(guān)系；再次變異系數(shù)CV=0.95%，也表明真實(shí)試驗(yàn)值能由模型方程來(lái)反映置信度較高，綜合表明此回歸模型可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)百香果皮花色苷得率與自變量A、B、C 和D 之間的關(guān)系。其中自變量C、D 和二次項(xiàng)中的A2、B2、C2、D2 及交互項(xiàng)AC、AD、BC 都屬于影響極顯著的因素（P<0.01），自變量A 及交互項(xiàng)AB 屬于影響顯著因素（P<0.05），自變量B和交互項(xiàng)BD、CD 不顯著（P>0.05）。

由圖5 可知，D（超聲時(shí)間）的曲面在AD、BD 和CD 中均最為陡峭，等高線密度均高于另外3個(gè)因子，表明超聲時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響高于C、A、B。其次是超聲功率其曲線也較陡，而料液比和pH 次之，其曲線較為平緩。且料液比與超聲功率、料液比與超聲時(shí)間、pH 與超聲功率兩兩因素的交互作用極顯著，其他2 個(gè)兩兩因素（pH 與超聲時(shí)間、超聲功率與超聲時(shí)間）之間對(duì)花色苷得率的交互作用不明顯，這和表4 中數(shù)據(jù)的差異顯著性相吻合。4 個(gè)因素對(duì)花色苷得率的影響程度為：D（超聲時(shí)間）>C（超聲功率）>A（液料比）>B（pH）。

2.2.3 最佳工藝參數(shù)的選取和驗(yàn)證 通過(guò)擬合分析，確定提取百香果皮花色苷的最佳參數(shù)為液料比61.27∶1（mL/g），pH 為3.48，超聲功率548.89 W，超聲時(shí)間34.47 min，在此參數(shù)下預(yù)測(cè)花色苷得率1.249%。綜合提取可操作性，將參數(shù)調(diào)整為液料比60∶1（mL/g），pH 3.5，超聲功率550 W，超聲時(shí)間35 min，并進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，最終花色苷得率平均為1.21%±0.03%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.29%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化分析獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 聯(lián)產(chǎn)工藝中百香果皮膳食纖維制備條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析 由圖6 可知，在同一發(fā)酵條件下，液料比為12.5∶1（mL/g）時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中膳食纖維高達(dá)55.01%±0.78%，顯著高于其他混合比例（P<0.05）?？紤]到過(guò)多或過(guò)少的加水量都不利于菌體生長(zhǎng)，影響乳酸等代謝產(chǎn)物生成，進(jìn)而影響百香果皮膳食纖維的含量，故試驗(yàn)選擇液料比為12.5∶1（mL/g），并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化接種量、發(fā)酵溫度和時(shí)間等條件。

在同一發(fā)酵條件下，隨著接種量的增加，得率也隨之增加，當(dāng)接種量為5.0%時(shí)得率達(dá)最大，而后影響不明顯。接種量過(guò)少時(shí)，會(huì)造成料渣中的菌體數(shù)不足影響乳酸等代謝產(chǎn)物的積累，進(jìn)而導(dǎo)致得率低。故選擇5.0%作為發(fā)酵培養(yǎng)基接種量。

發(fā)酵溫度在28～36℃范圍內(nèi)，料渣中的膳食纖維得率隨著溫度的升高顯著升高（P<0.05），到36℃時(shí)得率達(dá)到最大值55.23%±0.52%，大于36℃后得率降低。可能當(dāng)溫度達(dá)到36℃時(shí)，復(fù)合菌種產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物達(dá)到了最大的富集；而后隨溫度進(jìn)一步升高致使培養(yǎng)基溫度升高過(guò)快，代謝熱一時(shí)難以散發(fā)，不但影響到菌株正常代謝，還導(dǎo)致百香果皮中膳食纖維的纖維素和半纖維素之間作用力較強(qiáng)的氫鍵遭到破壞，使得半纖維素溶解加強(qiáng)，百香果皮膳食纖維得率下降[20， 26]。故發(fā)酵溫度選擇32～40℃為宜。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，得率先升高而后又顯著降低，20 h 時(shí)得率達(dá)到最大?？赡苁且?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間過(guò)短，菌絲體生長(zhǎng)不完全，從而產(chǎn)生的百香果皮膳食纖維就少；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，不但使發(fā)酵溶液體系中的pH 下降，導(dǎo)致產(chǎn)生的菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象活菌數(shù)減少或抑制復(fù)合菌種的生長(zhǎng)[27-28]，得率下降；還增大生產(chǎn)成本。故發(fā)酵時(shí)間選12～16 h 為宜。

2.3.2 百香果皮膳食纖維得率的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果按1.2.2（2）中方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，運(yùn)用Design-Expert8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表5。

對(duì)表5 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到相關(guān)回歸系數(shù)及方程：

Y=?135.18492+2.72867×A+6.29525×B+4.80787×C+3.19647×D+0.03900×A×B+0.02100×A×C?8.60000×10^?3×A×D?0.05781×B×C?0.10900×B×D?0.03125×C×D?0.14308×A²?0.23606×B²?0.05855×C²?0.03427×D²。進(jìn)一步對(duì)回歸方程進(jìn)行分析（表6）。

由表6 方差分析可知，該回歸模型的F 值為9.81，模型影響極顯著（P<0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.558>0.05），表明模型有效。決定系數(shù)R²=0.9075，校正系數(shù)R2adj=0.8150，表明該模型能較好反映液料比、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間與百香果皮膳食纖維得率的關(guān)系，且實(shí)測(cè)值將與預(yù)測(cè)值具有高度相關(guān)性；再次回歸模型置信度較高（變異系數(shù)CV=3.34%），因此可用此模型對(duì)百香果皮膳食纖維得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。在發(fā)酵影響因素中，除因素B、C、BD、A²、B²、C²、D²影響極顯著（P<0.01），D、CD 影響顯著因素（P<0.05），其他因素影響不顯著（P>0.05）。

圖7 直觀反映了百香果皮膳食纖維得率與因素間及兩兩交互作用的關(guān)系，交互作用的等高線的形狀越接近橢圓形，曲面弧度越陡，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件改變的敏感程度越大，因素間交互作用越顯著，反之則交互作用不顯著?？梢钥闯觯绊懓傧愎ど攀忱w維得率的主次因素為：B（接種量）>C（發(fā)酵溫度）>D（發(fā)酵時(shí)間）>A（液料比），這和表6 中數(shù)據(jù)的差異顯著性相吻合。

2.3.3 最佳工藝參數(shù)的選取 經(jīng)擬合分析，獲得的最佳條件為：液料比12.21∶1（mL/g），接種量5.05%，發(fā)酵溫度35.12℃，發(fā)酵時(shí)間20.73 h，在此條件下預(yù)測(cè)得率為55.59%。為綜合考慮料渣中膳食纖維的得率和實(shí)際操作，將提取工藝參數(shù)適當(dāng)調(diào)整為液料比12.5∶1（mL/g），接種量5.0%，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間21 h，在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，平均得率為55.56%±0.05%，與預(yù)測(cè)值非常接近，相對(duì)偏差為0.19%，故所建立的回歸模型能夠預(yù)測(cè)實(shí)際百香果皮膳食纖維發(fā)酵，獲得的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.4 聯(lián)產(chǎn)和單提效果的試驗(yàn)結(jié)果比較與分析

由表7 可以得出，采用微波輔助、超聲波輔助和微生物發(fā)酵技術(shù)，連續(xù)從百香果皮中提取果膠、花色苷和膳食纖維，與單獨(dú)采用微波輔助提取果膠、超聲波輔助提取花色苷和微生物發(fā)酵技術(shù)提取膳食纖維相比，聯(lián)產(chǎn)工藝中花色苷、膳食纖維產(chǎn)品的得率與單產(chǎn)相比分別減少了15.39%、11.43%。但從總的效益來(lái)看，若以每100 kg 百香果皮和渣原料計(jì)算， 聯(lián)產(chǎn)工藝可得到果膠12.45 kg，花色苷1.21 kg，膳食纖維55.56 kg；而單提工藝得到的果膠、花色苷和膳食纖維分別為12.45、1.43、62.73 kg。參照目前市場(chǎng)同類產(chǎn)品的市售價(jià)（3 種粗提產(chǎn)品分別預(yù)估果膠90 元/kg，花色苷180 元/kg，膳食纖維50 元/kg）計(jì)算，一次聯(lián)產(chǎn)工藝分別是單產(chǎn)果膠工藝效益的2.67 倍，單產(chǎn)花色苷工藝效益的14.99 倍，單產(chǎn)膳食纖維的0.31 倍，而原料僅為單產(chǎn)的1/3，且具有節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

3 討論

微波較強(qiáng)非離子電磁輻射穿透力，使水介質(zhì)摩擦撕裂產(chǎn)生高效內(nèi)熱和電介質(zhì)熱快速傳遞能量，能縮短細(xì)胞中有效成分的溶出及擴(kuò)散時(shí)間[19]；超聲空化效應(yīng)形成高強(qiáng)度的沖擊力和剪切穿透細(xì)胞壁，能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分溶出[19， 21]；發(fā)酵法既能避免強(qiáng)酸強(qiáng)堿的影響，又能減少浸泡及沖洗過(guò)程中水溶性膳食纖維的流失，是一種理想的膳食纖維制備方式[20]。因此本研究工藝路線選擇將微波、超聲波輔助提取和微生物發(fā)酵技術(shù)集成運(yùn)用于百香果果皮有效成分果膠、花色苷和膳食纖維的聯(lián)產(chǎn)提取，即設(shè)計(jì)了一條連續(xù)提取百香果皮中果膠、花色苷和膳食纖維的工藝流程，考慮到果膠提取和醇析過(guò)程中會(huì)浸出部分花色苷，通過(guò)濾液回收可直接合并到第二階段花色苷提取中，故本研究提出了一種先提取百香果皮中果膠，后連續(xù)提取花色苷和膳食纖維的新的聯(lián)產(chǎn)工藝路線，大大提高了百香果皮的利用率和附加值。該聯(lián)產(chǎn)工藝尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)也表明該研究工藝路線合理、可行。

設(shè)計(jì)的聯(lián)產(chǎn)提取過(guò)程中大多數(shù)溶劑可循環(huán)利用，除廢水排放外，無(wú)廢氣、毒液排放，節(jié)能，環(huán)保。且各階段采用RSM 法（響應(yīng)面）擬合各函數(shù)之間非線性關(guān)系高精度的，并通過(guò)多元二次回歸方程合理求得各階段最佳工藝條件，所得3 種產(chǎn)品得率較高，因此本方法既可為百香果皮高值化全利用提供理論依據(jù)，也可為對(duì)其他動(dòng)植物皮（殼）中成分聯(lián)產(chǎn)提取提供一定的參考。

此外，本研究雖完成了一項(xiàng)百香果皮的增值研究工作，但由于研究的內(nèi)容較多及試驗(yàn)條件限制，只初步完成了總體流程，還局限于提取的初級(jí)階段，對(duì)采用哪種高新技術(shù)提取果膠、花色苷和膳食纖維，提高產(chǎn)品得率，及采用哪種分離純化技術(shù)提高產(chǎn)品的純度、穩(wěn)定性，以及聯(lián)產(chǎn)工藝對(duì)3 種產(chǎn)品的生物活性是否存在影響等問(wèn)題均有待進(jìn)一步深入探究。今后可以考慮采用液質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等設(shè)備對(duì)百香果皮提取物（果膠、花色苷和膳食纖維）的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析，探討提取物活性的構(gòu)效關(guān)系。也可進(jìn)一步嘗試將百香果皮提取物應(yīng)用在果凍、面包及餅干等食品中，研究其對(duì)食品風(fēng)味、感官和質(zhì)構(gòu)的影響。

4 結(jié)論

（1）微波輔助酸提果膠中各因素影響主次順序?yàn)椋何⒉〞r(shí)間>液料比>微波功率>pH，其最佳條件為液料比65∶1（mL/g）、pH 2.5、微波功率450 W、微波時(shí)間5.0 min，此條件下百香果皮果膠得率為12.45%±0.06%。

（2）超聲波輔助從提取果膠后的濾渣中提取花色苷中各因素影響主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞超聲功率＞液料比＞pH，在乙醇質(zhì)量濃度為50%條件下，其最佳條件為液料比60∶1（mL/g），pH 3.5，超聲功率550 W，超聲時(shí)間35 min，百香果皮花色苷得率為1.21%±0.03%。

（3）發(fā)酵法從提取果膠和花色苷后的百香果皮渣中提取膳食纖維中各因素影響主次順序?yàn)椋航臃N量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>液料比，其最佳條件為液料比12.5∶1（mL/g），接種量5.0%，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間20 h，此條件下百香果皮膳食纖維得率為55.56%±0.05%。

（4）對(duì)聯(lián)產(chǎn)工藝提取所得百香果皮果膠、花色苷和膳食纖維與單獨(dú)提取效果進(jìn)行比較表明，聯(lián)產(chǎn)工藝中花色苷、膳食纖維的得率雖然與單產(chǎn)相比分別減少了15.39%、11.43%，但聯(lián)產(chǎn)工藝節(jié)約了原料消耗，一次流程可獲得3 種產(chǎn)品，且粗略估算聯(lián)產(chǎn)工藝的效益是單產(chǎn)果膠、花色苷和膳食纖維的2.67 倍、14.99 倍、0.31 倍。因此，從總的效益來(lái)看，聯(lián)產(chǎn)工藝更有利于提高百香果皮的產(chǎn)業(yè)效益。