試管苗熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫除蘋果矮化自根砧M9-T337、B9、GM256、M26病毒試驗

李幗英 楊俊霞 周代琴

摘 要： 【目的】蘋果矮化自根砧脫毒苗木的推廣應(yīng)用，對推動蘋果栽培制度的變革和果業(yè)增效、果農(nóng)增收都具有重要的意義。【方法】對蘋果矮化自根砧M9-T337、B9、GM256、M26莖尖和試管苗采用莖尖培養(yǎng)結(jié)合試管苗熱處理脫除病毒方法，開展了脫毒試驗。【結(jié)果】經(jīng)檢測，4個蘋果砧木蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）莖尖脫毒率為7.1%，蘋果莖尖病毒（ASGV）脫毒率為3.6%；二次莖尖熱處理后，4個蘋果砧木蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）脫毒率為51.0%，達(dá)到了預(yù)期的目標(biāo)，對蘋果矮化自根砧脫毒苗木的生產(chǎn)起到了促進作用?！窘Y(jié)論】對脫毒后的材料送檢，4個樣品中蘋果矮化自根砧M9-T337、TM26不攜帶蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉病毒（ACLSV）、蘋果花葉病毒（APMV）、蘋果誘果類病毒（ASSVd），病毒的脫毒率達(dá)到100%；B9攜帶蘋果莖痘病毒（ASPV），GM256攜帶蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV），這兩種砧木病毒的脫毒率達(dá)到80%，脫毒效果較好，該方法可在苗木繁育中推廣應(yīng)用，以促進蘋果矮化自根砧脫毒苗木的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 蘋果矮化自根砧；莖尖培養(yǎng)；莖尖；熱處理；脫毒

文章編號：2096-8108（2023）02-0012-03 ?中圖分類號：S661.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Experiment on the Removal of M9-T337，B9， GM256， M26 Virus from Apple Dwarf

Self Rootstock by Heat Treatment of Test Tube Seedlings Combined with Stem Tip Culture

LI Guoying， YANG Junxia *，ZHOU Daiqin

（Gansu Tianshui Fruit Research Institute，Tianshui 741002，China）

Abstract： 【Objective】 The popularization and application of virus-free seedlings of apple dwarf rootstock is of great significance to promote the reform of apple cultivation system， increase the efficiency of fruit industry and increase the income of fruit growers. 【Methods】 M9-T337， B9， GM256， M26 shoot tips and test-tube seedlings of apple dwarf rootstocks M9-T337， B9， GM256， M26 were virus-free by shoot tip culture combined with heat treatment of test-tube seedlings. 【Results】The results showed that the virus-free rates of ACLSV and ASGV were 7.1% and 3.6%， respectively.After secondary shoot tip heat treatment， the detoxification rate of apple chlorotic leafhopper virus （ ACLSV ） in four apple rootstocks was 51.0%， which achieved the expected goal and promoted the production of virus-free seedlings of apple dwarf rootstocks. 【Conclusion】 After virus-free material inspection， apple dwarf rootstock M9-T337 and TM26 in the four samples did not carry apple stem pox virus （ ASPV ）， apple stem groove virus （ ASGV ）， apple chlorotic leaf virus （ ACLSV ）， apple mosaic virus （ APMV ） and apple fruit-inducing virus （ ASSVd ）. The virus-free rate reached 100%. B9 carried apple stem pitting virus （ ASPV ）， and GM256 carried apple chlorotic leaf spot virus （ ACLSV ）. The detoxification rate of the two rootstock viruses reached 80%， and the detoxification effect was better. This method can be popularized and applied in seedling breeding to promote the production of virus-free seedlings of apple dwarf rootstocks.

Keywords： apple dwarf self rootstock; stem tip culture; stem tip; heat treatment; detoxification

莖尖培養(yǎng)、熱處理脫毒是目前獲得植物脫毒材料的重要途徑。本試驗采用莖尖、試管苗熱處理結(jié)合二次莖尖培養(yǎng)的方法，開展了蘋果品種矮化自根砧木的脫毒試驗研究，現(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為天水市果樹研究所園內(nèi)的M9-T337、M26、B9、GM256蘋果矮化砧木苗。

1.2 脫毒方法

1.2.1 單純莖尖培養(yǎng)

在新梢生長最快時期（5月中下旬），選擇大田生長健壯的M9-T337、M26、B9、GM256 4個蘋果矮化砧木母樹，采集生長旺盛、長約2～3 cm頂梢新芽，剪去葉片，放入盛有無菌水的密閉培養(yǎng)瓶內(nèi)，備用。

1.2.2 材料的清洗和殺菌

將帶芽莖段在2‰的84消毒液中浸泡5～ 10 min 后在流水下沖洗2～5 min，放入洗潔精稀釋液中清洗5～10 min，后放入脫脂紗布在流水中沖洗1.5～2 h，控干水分后裝入干凈的燒杯，在超凈工作臺上用75%酒精浸泡20～30 s，后無菌水沖洗2～3次，然后在0.1%的升汞溶液中處理2～ 6 min ，處理時不斷攪動使藥液均勻浸到處理材料表面，處理完成后，移到無菌水中沖洗4～5次，用滅菌濾紙吸干材料表面的水分，在解剖鏡下迅速剝?nèi)?0.4～ 0.5 mm的莖尖進行分離培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為MS+BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+維生素C100 mg/L，培養(yǎng)基添加物為：蔗糖30 g/L、瓊脂 5 g/L ，pH=5.8。接種完成后分別標(biāo)記歸類，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室培養(yǎng)，移入培養(yǎng)室的初代培養(yǎng)瓶苗先進行暗培養(yǎng)，用遮光布遮光，溫度21～23 ℃，濕度70％～75％，暗培養(yǎng)5～7 d后去掉遮光布，在1 800～2 500 Lx的光照下培養(yǎng)，溫度22～24 ℃。

1.2.3 試管瓶苗熱處理脫毒

初代培養(yǎng)新芽在20 d左右萌發(fā)長到0.5～ 0.8 cm ，此時剪取新芽0.4～0.6 cm轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接到MS+6-BA 0.5 mg/L+0.5 mg/L擴繁培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d左右時，剪取2～3 cm的芽轉(zhuǎn)接，每品種接10瓶，每瓶4株。先在室溫（24 ℃）條件下培養(yǎng) 15 d ，然后轉(zhuǎn)移到人工氣候箱中，光照14 h，黑暗 10 h ，從25 ℃開始每天升高1 ℃，逐漸升溫至 32 ℃ ，之后光照38 ℃、黑暗 32 ℃ ，處理20 d。熱處理結(jié)束后從獲得材料嫩梢上剝?nèi)?.4～0.5 mm莖尖進行培養(yǎng)。

1.3 病毒檢測

1.3.1 初檢

對熱處理后的瓶苗剪取0.4～0.5 mm頂芽繼續(xù)轉(zhuǎn)接在擴繁培養(yǎng)基中，以單株為系進行擴繁，苗數(shù)達(dá)150～200株時，各品種隨機抽取5個樣本，每個樣本10～15株，采用酶聯(lián)免疫分析法進行蘋果莖溝病毒（ASGV）和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）檢測。檢測各板設(shè)陰性、陽性及空白對照，反應(yīng)結(jié)束時用肉眼來觀色，陽性樣本的顏色應(yīng)深于陰性對照物，陰性樣本的顏色則與陰性對照物相當(dāng)或淺于陰性對照物。

1.3.2 送檢

為了確保獲得材料的無毒，將初檢獲得的材料送中國農(nóng)科院果樹研究所中國落葉果樹脫毒中心，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測方法，檢測“蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）、蘋果花葉病毒（ApMV）、蘋果銹果類病毒（ASSVd）五病毒”，最終達(dá)到獲得蘋果脫毒試管苗材料的目的。

2 結(jié)果與分析

2.1 單純莖尖培養(yǎng)

從田間采集4個樣品共127個莖尖進行分離培養(yǎng)，成活28個，成活率為22%。采用酶聯(lián)免疫分析法檢測結(jié)果顯示，直接莖尖培養(yǎng)法脫毒效果很差，僅有2個莖尖脫除了蘋果褪綠葉斑病毒，1個莖尖脫除了蘋果莖溝病毒，ACLSV脫除率僅為7.1%（見表1）。

2.2 試管苗熱處理

由表2可知，將蘋果矮化自根砧木M9-T337、M26、B9、GM256莖尖培養(yǎng)的試管苗材料共85芽進行熱處理、二次莖尖培養(yǎng)后，成活47個，成活率為 ?55.2%，經(jīng)酶聯(lián)免疫分析法檢測，脫毒莖尖24個，ACLSV脫毒率達(dá)到51.0%。

2.3 脫毒材料送檢及結(jié)果

將蘋果矮化自根砧木M9-T337、M26、B9、GM256材料各4瓶，送到中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所進行病毒檢測。檢測報告一式兩份，一份交送檢單位，一份交由檢測單位存檔。（檢測由結(jié)果中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供）

2.3.1 檢測方法

檢測方法采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

2.3.2 檢測結(jié)果

由表3檢測結(jié)果看出，送檢樣品中蘋果矮化砧M9-T337、M26不攜帶“蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）、蘋果花葉病毒（ApMV）、蘋果銹果類病毒（ASSVd）”所檢的4種蘋果病毒和1種蘋果類病毒；B9攜帶蘋果莖痘病毒（ASPV）、GM256攜帶蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）。

3 結(jié)論

在莖尖脫毒技術(shù)中，因外植體大小不同，成活率和脫毒率相互制約，從脫毒這一目標(biāo)來看，要求莖尖越小越好，但是莖尖太小，自身營養(yǎng)就不足，越難分化，加之切分時的機械損傷，污染率和死亡率也就越高。因此應(yīng)該綜合考慮成活率和脫毒率兩個指標(biāo)，來確定莖尖的大小。結(jié)果顯示，同一品種不同大小莖尖的污染率、成活率有明顯差異。本試驗采用莖尖、熱處理、二次莖尖脫毒技術(shù)，兩次切取莖尖為 0.4～ 0.5 mm，降低了切取的操作難度，提高了莖尖的成活率。利用試管瓶苗熱處理剪取莖尖脫毒方法?污染率低、周期短，在短時間內(nèi)即可獲得較多脫毒材料。本試驗單純莖尖脫毒成活率為22.0%，脫除蘋果莖溝病毒（ASGV）脫除率為36%，蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）的脫毒率為7.1%；試管苗熱處理后莖尖培養(yǎng)成活率55.2%，蘋果褪綠班病毒（ACLSV）脫毒率為51.0%。對脫毒后的材料送檢，4個樣品中蘋果矮化自根砧M9-T337、M26不攜帶蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）、蘋果花葉病毒（ApMV）、蘋果銹果類病毒（ASSVd），病毒的脫毒率達(dá)到100%；B9攜帶蘋果莖痘病毒（ASPV），GM256攜帶蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV），這兩種砧木病毒的脫毒率達(dá)到80%，脫毒效果較好，基本上達(dá)到了預(yù)期的目標(biāo)。

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