植物登陸過程中exocyst復(fù)合體的演化

劉文龍,胡鋼,周光磊,李炳君,吳冬杰,劉松奇,鮑依群,譚小云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

化石證據(jù)和分子生物學(xué)證據(jù)表明,在大約4.7億年前,輪藻門雙星藻綱的某種藻類從水生環(huán)境登上陸地,隨后在進(jìn)化中發(fā)生一系列形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及生活方式的演化,逐步適應(yīng)陸地環(huán)境,這個(gè)過程被稱為植物登陸(plant terrestrialization)[1-2]。植物登陸改變了地球大氣環(huán)境和陸地環(huán)境,為海洋動(dòng)物登陸提供了基礎(chǔ),因此是地球生命進(jìn)化史上的關(guān)鍵事件之一。為了適應(yīng)陸地干旱、高鹽、溫度劇烈變化、紫外線強(qiáng)烈照射等逆境條件,植物在登陸過程中發(fā)生了一系列適應(yīng)性進(jìn)化,包括:胚和種子的產(chǎn)生,維管束的形成,根、莖、葉的分化,生活史和繁殖方式的改變等[2-3]。這一系列進(jìn)化的基礎(chǔ)是植物基因組的改變,其方式包括全基因組復(fù)制(whole genome duplication,WGD)、基因復(fù)制(gene duplication)和基因變異(gene mutation)、水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer,HGT)等[4-5]。其中,囊泡運(yùn)輸相關(guān)基因的進(jìn)化,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸機(jī)制的改變,是這種適應(yīng)性進(jìn)化的重要原因之一[2]。

囊泡運(yùn)輸是真核細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)囊环N重要形式,指物質(zhì)包被在囊泡中運(yùn)輸?shù)狡渌麉^(qū)室的過程。它分為4個(gè)基本步驟:囊泡形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、拴系和融合[6]。其中拴系是指囊泡和靶膜之間的識(shí)別和靠近,以確保囊泡精確定位。拴系過程主要由拴系因子介導(dǎo)[7]。exocyst復(fù)合體是真核細(xì)胞中保守的拴系因子,由Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo84和Exo70共8種亞基組成。研究表明酵母中Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15處于exocyst的內(nèi)部,而Exo84和Exo70處于exocyst的外部[8]。在酵母和哺乳動(dòng)物中,exocyst主要介導(dǎo)外泌囊泡的拴系過程,參與細(xì)胞分裂和細(xì)胞外泌等過程[9]。和酵母以及動(dòng)物相比,被子植物exocyst亞基基因的拷貝數(shù)更多[10],因此在結(jié)構(gòu)和功能上具有更加廣泛的多樣性。例如擬南芥exocyst參與細(xì)胞極性生長(zhǎng)、細(xì)胞壁合成、維管束形成、細(xì)胞分裂、細(xì)胞自噬、抗病、抗鹽、抗細(xì)胞凋亡等過程[11-13]。因此,exocyst復(fù)合體在植物適應(yīng)陸地環(huán)境中發(fā)揮了重要作用。然而,在植物登陸過程中,exocyst亞基基因是如何演化以幫助植物適應(yīng)陸地環(huán)境?人們對(duì)這個(gè)問題的了解還很有限。

近20年來,多種藻類(如綠藻門植物和輪藻門植物)[14-15]和低等陸生植物(如苔蘚和蕨類等)物種[16-17]的基因組測(cè)序完成,為研究exocyst復(fù)合體在植物登陸過程中的演化規(guī)律創(chuàng)造了條件。本研究從綠藻門、輪藻門、苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物中選取16種代表性植物,對(duì)其exocyst復(fù)合體亞基的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)、進(jìn)化分析、保守基序分析、高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和比較,進(jìn)而研究它們的進(jìn)化規(guī)律;并以擬南芥為陸生植物代表分析其特有的Exo70G家族蛋白的亞細(xì)胞定位及其在干旱脅迫和鹽脅迫中的表達(dá)。在植物登陸過程中,exocyst內(nèi)部亞基并沒有發(fā)生顯著變化,而表面亞基的數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變,特別是Exo70亞基,其基因大量復(fù)制、分化產(chǎn)生多個(gè)類群,包括陸生植物特有的類群GroupⅢ(Exo70G),其基因在干旱脅迫和鹽脅迫下高表達(dá),可能對(duì)于植物抗干旱脅迫和鹽脅迫具有重要的價(jià)值。本研究不僅有助于了解植物登陸的分子機(jī)制,也有助于了解植物對(duì)于干旱高鹽環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制,為提高農(nóng)作物抗旱抗鹽能力的基因改造工作奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 代表性植物物種exocyst亞基鑒定

選取16種具有代表性的藻類和陸生植物物種。藻類為:綠藻門植物金牛鴕球藻(Ostreococcustauri,Ota)、小球藻(Chlorellavariabilis,Cva)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,Cre),輪藻門植物中斑藻(Mesostigmaviride,Mvi)、克里藻(Klebsormidiumnitens,Kni)、輪藻(Charabraunii,Cbr)、雙星藻(Spirogloeamuscicola,Smu);陸生植物為:苔蘚植物角苔(Anthocerosangustus,Aan)、小立碗蘚(Physcomitrellapatens,Ppa)、地錢(Marchantiapolymorpha,Mpo),蕨類植物卷柏(Selaginellamoellendorffii,Smo)、細(xì)葉滿江紅(Azollafiliculoides,Afi),裸子植物銀杏(Gingkobiloba,Gbi)、買麻藤(Gnetummontanum,Gmo),被子植物無油樟(Amborellatrichopoda,Atr)和擬南芥(Arabidopsisthalinana,Ath)。通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載這些物種的基因組、蛋白及cDNA 序列。利用Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.sanger.ac.uk/)獲得不同exocyt亞基的保守序列與不同物種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTp搜索,篩選這些物種中exocyst亞基蛋白序列。

1.2 蛋白質(zhì)序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建

不同物種exocyst不同亞基序列分別運(yùn)用Clustal W 工具進(jìn)行多序列比對(duì),然后利用MEGA 7.0 軟件對(duì)完成比對(duì)的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,構(gòu)建方法采用最大似然法(Maximum-likelihood method),Bootstrap值設(shè)為1 000,分析16個(gè)物種exocyst不同亞基蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1.3 蛋白質(zhì)保守基序分析

采用在線基序分析工具M(jìn)EME(multiple expectation maximization for motif elicitation)(http://meme.sdsc. edu/meme4_3_0/intro.html)對(duì)16個(gè)物種exocyst不同亞基蛋白進(jìn)行保守基序分析。

1.4 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用在線基序分析工具Robetta Fold(https://robetta.bakerlab.org/)[18]對(duì)感興趣的蛋白進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)結(jié)果利用PyMol軟件進(jìn)行可視化。

1.5 鹽脅迫、干旱脅迫處理以及基因表達(dá)分析

利用100 mmol·L-1NaCl模擬鹽脅迫,以100 g·L-1的PEG6000模擬干旱脅迫,對(duì)擬南芥幼苗處理24 h后利用TaKaRa RNAiso Plus(Cat# 9109)試劑提取RNA,采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat# RR047A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀進(jìn)行Real-time PCR,以TUA2基因?yàn)閮?nèi)參。

1.6 蛋白定位分析

構(gòu)建Exo70G1-GFP克隆,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,混合紅色熒光蛋白(RFP)或高爾基體定位蛋白甘露糖苷酶(Man1)接RFP(Man1-RFP)、反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)(TGN)定位蛋白(VTI112)接RFP(VTI12-RFP)同時(shí)注射至煙草表皮細(xì)胞,48 h后利用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 代表性的藻類和陸生植物物種中exocyst復(fù)合體亞基的序列鑒定

選擇7種代表性的藻類,包括:綠藻門植物金牛鴕球藻、小球藻和萊茵衣藻,均為單細(xì)胞綠藻,其中小球藻代表低等的早期綠藻;輪藻門植物中斑藻、克里藻、輪藻和雙星藻,其中中斑藻為低等單細(xì)胞輪藻,克里藻為纖維狀不分枝多細(xì)胞輪藻,輪藻是具備類似根莖葉器官分化的多細(xì)胞藻類,雙星藻是被認(rèn)為最接近陸生植物的輪藻[3]。9種代表性的陸生植物,包括:苔蘚類植物小立碗蘚、地錢和角苔,它們開始具有胚的結(jié)構(gòu),但沒有維管組織,沒有根莖葉分化,只能在潮濕的陸地環(huán)境生活;蕨類植物卷柏和滿江紅,這類植物開始具有維管組織,具備根莖葉的分化,可以從土壤中汲取水分和無機(jī)鹽,呈孢子繁殖,受精過程依賴水;裸子植物銀杏和買麻藤,這類植物開始以種子繁殖,更加適應(yīng)陸地環(huán)境,但沒有花的結(jié)構(gòu),受精過程部分依賴水;原始被子植物無油樟和模式植物擬南芥,它們具備了花的結(jié)構(gòu),具有更加先進(jìn)的繁殖方式。總體而言,這些物種代表具有從低等到高等,從依賴水環(huán)境到逐步擺脫水生環(huán)境的演化規(guī)律。

通過BLAST鑒定16個(gè)物種中exocyst復(fù)合體不同亞基的氨基酸序列(圖1)。發(fā)現(xiàn)3種單細(xì)胞綠藻和1個(gè)低等單細(xì)胞輪藻中斑藻并不具備完整的exocyst,如金牛鴕球藻缺失4個(gè)亞基(Sec8、Sec15、Exo84和Exo70),而中斑藻缺少3個(gè)亞基(Sec10、Sec15和Exo84),而從克里藻之后多細(xì)胞輪藻和陸生植物均具備完整的exocyst,說明完整的exocyst對(duì)于輪藻多細(xì)胞化以及植物登陸是必需的。

隨著進(jìn)化等級(jí)的提高,exocyst復(fù)合體表面亞基(Exo84和Exo70)拷貝數(shù)呈現(xiàn)增多的趨勢(shì),尤其是Exo70亞基拷貝數(shù)顯著增加,例如克里藻只有1個(gè)Exo70亞基,而擬南芥擁有23個(gè)(圖1)。暗示exocyst復(fù)合體表面亞基的多樣化可能使其功能多樣化,從而使高等植物細(xì)胞囊泡運(yùn)輸更加復(fù)雜化,以適應(yīng)更加復(fù)雜的生存環(huán)境。

2.2 藻類和陸生植物中exocyst內(nèi)部亞基的進(jìn)化分析和比較

對(duì)酵母的研究顯示,exocyst復(fù)合體8個(gè)亞基的組裝具有高度層次性,首先是Sec3-Sec5、Sec6-Sec8和Sec10-Sec15兩兩結(jié)合,然后這3對(duì)再組裝,形成exocyst復(fù)合體內(nèi)部,因此這6個(gè)亞基被稱為exocyst內(nèi)部亞基,最后Exo84和Exo70再結(jié)合,占據(jù)exocyst復(fù)合體的表面,因此這2個(gè)亞基也被稱為exocyst的表面亞基[8]。表面亞基除了和內(nèi)部亞基結(jié)合外,還通過部分序列與膜脂如磷脂酰肌醇等結(jié)合,以實(shí)現(xiàn)囊泡拴系功能[19-20]。

16個(gè)代表性植物中,exocyst復(fù)合體每個(gè)內(nèi)部亞基基因拷貝數(shù)都不超過3個(gè)。序列比對(duì)顯示,藻類和被子植物的序列相似性均在60%以上,進(jìn)化分析顯示這些亞基的分子進(jìn)化基本與物種進(jìn)化同步。通過保守基序分析發(fā)現(xiàn),從克里藻開始的多細(xì)胞輪藻和陸生植物,exocyst內(nèi)部亞基都高度保守,含有相同的保守基序(圖2)。高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,它們大多數(shù)的高級(jí)結(jié)構(gòu)都類似于酵母的同源蛋白?？傮w而言,在植物登陸過程中,這些內(nèi)部亞基的數(shù)量和結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生顯著變化。因此,推測(cè)這些亞基的進(jìn)化并不是陸生植物exocyst功能多樣化的主要原因。

圖1 代表性植物物種的exocyst亞基數(shù)量Fig.1 Number of exocyst subunits in representative plant species

圖2 植物登陸過程中exocyst內(nèi)部亞基的進(jìn)化Fig.2 Evolution of exocyst internal subunits during plant terrestrializationA、B、C、D、E和F分別代表藻類和陸生植物中Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10和Sec15的進(jìn)化分析以及保守基序分析。A,B,C,D,E and F represent the evolutionary analysis and conserved motif analysis of Sec3,Sec5,Sec6,Sec8,Sec10 and Sec15 in algae and land plants,respectively.

2.3 藻類和陸生植物Exo84亞基進(jìn)化分析和比較

大多數(shù)植物Exo84亞基基因的拷貝數(shù)為1～3,雙星藻(Spirogloeamuscicola)中擁有3個(gè)Exo84亞基,早期陸生植物小立碗蘚中則具有7個(gè)Exo84亞基(圖3-A),說明在植物從水中到陸地生活的轉(zhuǎn)換時(shí)期,Exo84亞基基因經(jīng)歷頻繁的復(fù)制并保留了多個(gè)拷貝。

通過保守基序分析將植物Exo84亞基分為15個(gè)基序,其中最原始的克里藻和輪藻Exo84亞基具有13個(gè)保守基序。在輪藻向雙星藻進(jìn)化的過程中,在C末端增加了一個(gè)基序14,該基序富含絲氨酸,容易形成氫鍵,可能有利于Exo84和其他蛋白互作。在雙星藻向苔蘚進(jìn)化的過程中,在N末端增加了基序15,該基序富含堿性氨基酸和絲氨酸,前者一般帶正電荷(圖3-B、C)。這2個(gè)基序大大增加Exo84的極性,有利于與其他分子互作。然而,在某些蕨類植物和種子植物中,多個(gè)物種Exo84亞基的基序15丟失,說明該基序?qū)τ诰S管植物的后續(xù)進(jìn)化也并非必需。

圖3 植物登陸過程中Exo84亞基的進(jìn)化Fig.3 Evolution of Exo84 subunit during plant terrestrializationA.16種代表性植物的Exo84亞基進(jìn)化分析和保守基序分析,紅框代表藻類向陸生植物演化時(shí)增加的2個(gè)保守基序(基序14和基序15);B. 基序14和基序15的氨基酸序列;C. 輪藻、雙星藻和角苔Exo84亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及基序14、15的位置和結(jié)構(gòu)比較。A. Exo84 subunit evolutionary analysis and conserved motif analysis of 16 representative plant species. Red boxes represent two conserved motifs(motif 14 and motif 15)added during the evolution of algae to land plants. B. Amino acid sequences of motif 14 and 15;C. Spatial structure of Exo84 subunit and comparison of the location of motif 14 and 15 in Chara braunii,Spirogloea muscicola and Anthoceros angustus.

2.4 藻類和陸生植物Exo70亞基的分類

植物Exo70亞基顯示了高度多樣性,如擬南芥含有23個(gè)Exo70亞基基因,說明在植物進(jìn)化過程中,Exo70基因進(jìn)行多次復(fù)制,并保留多個(gè)拷貝。在克里藻及前期的藻類中,Exo70基因的數(shù)量不超過1個(gè),從輪藻開始增加為2個(gè)。雙星藻擁有6個(gè)Exo70亞基,這種增加可能是為了適應(yīng)半水生的環(huán)境。在苔蘚植物角苔中,Exo70基因的數(shù)量減至3個(gè),可能是在適應(yīng)陸地環(huán)境后,丟失了一部分多余的Exo70基因。在大多數(shù)維管植物中,Exo70基因的數(shù)量維持在10個(gè)左右,但是在晚生的被子植物中,Exo70基因的數(shù)量呈現(xiàn)快速增長(zhǎng),尤其在擬南芥中增加至23個(gè)。

16個(gè)藻類和陸生植物物種的Exo70氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖4)表明,它們分為4個(gè)類群(GroupⅠ—Ⅳ),其中GroupⅠ為早期單細(xì)胞綠藻和輪藻的Exo70亞基,它們代表綠色植物Exo70亞基的基部類群,只在原始單細(xì)胞藻類(如單細(xì)胞綠藻和中斑藻)中存在。在進(jìn)化形成多細(xì)胞絲狀輪藻克里藻的過程中(約7～8億年前),編碼Exo70亞基的基因分化為2支,一支進(jìn)化成GroupⅡ&Ⅲ,另一支進(jìn)化成GroupⅣ。在克里藻之后,陸生植物形成前(約5～7億年前),GroupⅡ&Ⅲ類群Exo70亞基中分化出一個(gè)陸生植物特有類群GroupⅢ,自此和GroupⅡ分開。另外,GroupⅣ最初在雙星藻中形成,然后進(jìn)化成綠色植物其他的Exo70亞基類群,是多樣性最為豐富的一個(gè)類群。?rsky等[21]對(duì)擬南芥Exo70進(jìn)行8個(gè)亞家族(Exo70A—Exo70H)的分類,GroupⅡ也可稱為Exo70A類群,因?yàn)槠渲话瑪M南芥Exo70A亞家族在內(nèi)的單系類群;GroupⅢ也可以稱之為Exo70G類群,因?yàn)樗侵话瑪M南芥Exo70G亞家族在內(nèi)的單系類群;GroupⅣ包含擬南芥其他6個(gè)Exo70亞家族成員及其祖先。GroupⅠ只存在于早期單細(xì)胞輪藻和單細(xì)胞綠藻中;GroupⅢ只存在于陸生植物中;GroupⅡ 存在于克里藻及其后的綠色植物中;GroupⅣ存在于雙星藻及其后的綠色植物中。

圖4 代表性物種中Exo70亞基的進(jìn)化和聚類分析Fig.4 Evolution and cluster analysis of Exo70 subunits in representative speciesA.代表性植物的Exo70亞基進(jìn)化聚類總概圖,Exo70亞基可以分為4個(gè)類群(Group)。B. 代表性植物的Exo70亞基進(jìn)化和聚類詳圖。GroupⅡ也可稱之為Exo70A類群;GroupⅢ也可稱之為Exo70G類群;GroupⅣ包含其他6個(gè)Exo70亞家族。A. Phylogenetic clustering diagram of Exo70 subunit of representative plants. The Exo70 subunit can be divided into four groups. B. Detailed map of Exo70 subunit evolution and clustering of representative species. GroupⅡ is also called Exo70A group;GroupⅢ is also called Exo70G group;GroupⅣ contains six other Exo70 subfamilies.

2.5 藻類和陸生植物Exo70亞基的比較

由于Exo70亞基數(shù)量眾多,選擇其中具有代表性的序列來分析和比較早期陸生植物和藻類Exo70的一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu),以探究其在登陸中的分子演化過程。保守基序分析顯示,小球藻中Exo70亞基含有7個(gè)基序,除了基序3,均存在于所有綠色植物Exo70亞基中,因此基序1、2、4、5、6、7可以看成綠色植物Exo70的基本基序(圖5-A)。陸生植物GroupⅡ的Exo70亞基特征是在輪藻的基礎(chǔ)上增加N端的基序9和C端的基序11。在GroupⅣ類群中,陸生植物的Exo70亞基比藻類的多出一段基序13(圖5-A),也就是說,這2個(gè)類群在登陸過程中,均在N端增加一段保守基序,N端一般是Exo70亞基和脂質(zhì)互作的部位,因此這種改變可能影響Exo70與某些脂質(zhì)的互作。

通過保守基序分析比較陸生植物特有的GroupⅢ類群Exo70亞基和其他類群Exo70,發(fā)現(xiàn)該類群Exo70的第3個(gè)α-螺旋束上存在一段特有的基序(基序15),取代其他類群Exo70相似位置的基序3,因此基序15是GroupⅢ類群Exo70的特有基序(圖5-B)。高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,基序3和基序15都是由2個(gè)相鄰的α-螺旋組成,但是基序3形成的2個(gè)α-螺旋夾角非常小,接近于0度,而基序15形成的2個(gè)α-螺旋夾角接近于直角(圖5-C),使得α-螺旋束更加松散,可能有利于其構(gòu)象改變或與互作蛋白結(jié)合。

圖5 代表性物種中Exo70亞基的保守基序分析以及高級(jí)結(jié)構(gòu)比較Fig.5 Conserved motif analysis and spatial structures comparison of Exo70 subunits in representative speciesA.代表性Exo70亞基保守基序分析;B. 各種特異性基序的氨基酸序列;C. GroupⅢ Exo70(MpoExo70.3)亞基中基序15和其他亞基(CvaExo70)基序3的高級(jí)結(jié)構(gòu)比較。方框表示陸生植物所特有的基序。A. Conserved motif analysis of representative Exo70 subunit;B. Amino acid sequences of various specific motifs;C. Comparison of the spatial structures of motif 15 in GroupⅢ Exo70(MpoExo70.3)subunit and motif 3 in other subunits(CvaExo70). The boxes represent motifs that are unique to land plants.

2.6 GroupⅢ(Exo70G亞家族)Exo70的表達(dá)和定位分析

Exo70G類群是陸生植物特有的Exo70亞基類群,暗示它們?cè)谥参镞m應(yīng)陸地環(huán)境中發(fā)揮重要功能。為驗(yàn)證這個(gè)假設(shè),首先模擬干旱或高鹽的條件處理擬南芥植株,然后利用RT-qPCR方法,檢測(cè)Exo70G基因(AthExo70G1和AthExo70G2)的表達(dá)。研究結(jié)果顯示這2個(gè)基因的表達(dá)量在脅迫條件下與對(duì)照相比均顯著上升(圖6-A、B),說明Exo70G基因的表達(dá)受干旱脅迫或鹽脅迫的誘導(dǎo),暗示其可能在抗旱或抗鹽中發(fā)揮功能。

進(jìn)一步利用煙草瞬時(shí)表達(dá)研究Exo70G1的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),該亞基定位在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)(trans-Golgi network,TGN)上(圖6-C)。Wu等[22]研究曾發(fā)現(xiàn)Exo70A1定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜附近,Exo70B1定位在自噬體上[23],Exo70E2定位在外泌體上[24],因此Exo70G1的定位和它們相比差異顯著[11]。TGN作為植物細(xì)胞內(nèi)蛋白外泌、內(nèi)吞和分選的中轉(zhuǎn)位點(diǎn),在植物響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用。Exo70G1可能參與TGN物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程,從而在植物抗逆過程中發(fā)揮功能。

3 討論

3.1 exocyst復(fù)合體進(jìn)化對(duì)植物登陸具有重要意義

植物從水生環(huán)境登上陸地,面臨著干旱、高鹽、土壤微生物脅迫、紫外線強(qiáng)烈照射等不利環(huán)境因素,因此,植物體在形態(tài)、生理以及生活方式發(fā)生一系列的改變來適應(yīng),例如產(chǎn)生維管組織輸送水分和礦物質(zhì),產(chǎn)生根系以固定在土壤中。exocyst復(fù)合體的進(jìn)化,是植物細(xì)胞囊泡運(yùn)輸機(jī)制進(jìn)化的一個(gè)重要內(nèi)容,對(duì)于植物適應(yīng)陸地環(huán)境起重要作用。玉米中exocyst復(fù)合體Sec3亞基對(duì)根毛發(fā)育是必需的[25],擬南芥Exo70A亞基在維管組織形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26],Exo70H亞基在植物抗病過程中發(fā)揮作用[27]。

植物細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)有多個(gè)內(nèi)膜區(qū)室,如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)體等。這些區(qū)室的囊泡拴系因子(如COG、DS1等)在登陸過程中并沒有像exocyst一樣變得高度多樣化。exocyst在植物登陸過程中高度復(fù)制和進(jìn)化,其產(chǎn)生多樣化的結(jié)構(gòu)和功能的原因可能:1)exocyst最初是介導(dǎo)外泌囊泡拴系的拴系因子,直接參與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)和信息交流,因此對(duì)胞外環(huán)境的改變最為敏感。2)和動(dòng)物細(xì)胞以及單細(xì)胞藻類相比,陸生植物細(xì)胞是相對(duì)固定的。不同部位細(xì)胞通過不對(duì)稱分裂和極性生長(zhǎng)來形成高度特化的組織和器官,這個(gè)過程需要各種特化的囊泡外泌途徑輸送養(yǎng)分或細(xì)胞壁物質(zhì),這樣才符合exocyst復(fù)合體的多樣化特點(diǎn)。

圖6 擬南芥Exo70G亞基在鹽脅迫和干旱脅迫下表達(dá)分析以及亞細(xì)胞定位分析Fig.6 Expression analysis and subcellular localization analysis of Exo70G subunitin Arabidopsis thaliana under salt and drought stressA. Exo70G1基因的表達(dá)受鹽脅迫和干旱脅迫的誘導(dǎo);B. Exo70G2基因的表達(dá)受鹽脅迫和干旱脅迫的誘導(dǎo);C.Exo70G1定位在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)上。Control:未處理的對(duì)照品;NaCl:100 mmol·L-1 NaCl處理;PEG6000:100 g·L-1的PEG6000處理;Man1:高爾基體標(biāo)記蛋白(甘露糖苷酶);VTI12:反式高爾基網(wǎng)絡(luò)標(biāo)記蛋白。標(biāo)尺為10 μm。A. Exo70G1 expression was induced by salt stress and drought stress;B. Exo70G2 gene expression was induced by salt stress and drought stress;C.Exo70G1 is located on the trans Golgi network.Control:Samples without treatment;NaCl:Samples with 10 mmol·L-1 NaCl treatment;PEG6000:Samples with 100 g·L-1 PEG6000 treatment;Man1:Golgi body marker protein(mannosidase);VTI12:trans-Golgi network marker protein. Bar=10 μm.

3.2 Exo70亞基擴(kuò)張與植物適應(yīng)陸地環(huán)境的關(guān)系

Exocyst復(fù)合體包含8個(gè)亞基,然而在登陸過程中,只有2個(gè)表面亞基在數(shù)量和結(jié)構(gòu)上發(fā)生了顯著改變,特別是Exo70亞基拷貝數(shù)大幅增加,結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生多種改變,是導(dǎo)致陸生植物exocyst復(fù)合體多樣化的主要原因。我們推測(cè)有以下原因:1)Exo70作為表面亞基,一方面結(jié)合內(nèi)部亞基,一方面結(jié)合膜的信號(hào)脂質(zhì)如磷脂酰肌醇來引導(dǎo)拴系過程[20]。在植物細(xì)胞質(zhì)膜的不同部位,或者是不同區(qū)室內(nèi)膜的信號(hào)脂質(zhì)成分和含量不同。通過改變Exo70結(jié)合脂質(zhì)的區(qū)域(N端),可以使它結(jié)合不同部位的信號(hào)脂質(zhì),進(jìn)而使exocyst復(fù)合體參與不同部位的囊泡拴系。2)植物exocyst另外一個(gè)表面亞基Exo84喪失了結(jié)合膜脂的能力,因此exocyst結(jié)合不同部位膜脂的功能全部依賴于Exo70亞基,造成Exo70亞基具有高度多樣化的必要。

植物基因家族擴(kuò)張的方式主要包括全基因組復(fù)制、片段復(fù)制和水平基因轉(zhuǎn)移。小立碗蘚中發(fā)生的全基因組復(fù)制導(dǎo)致其Exo70基因增加至13個(gè)[28]。另外,片段復(fù)制也是Exo70基因增加的一種原因,在接近陸生植物物種雙星藻(Peniummargaritaceum)中,發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)座序列,其Exo70基因增加至30多個(gè)[29],當(dāng)然這些基因很多可能是無效基因,從而在進(jìn)化的過程中被淘汰。目前并沒有發(fā)現(xiàn)土壤微生物Exo70基因轉(zhuǎn)移到植物中的證據(jù)。因此,全基因組復(fù)制和片段復(fù)制是Exo70基因家族擴(kuò)張的主要方式。

在進(jìn)化過程中,復(fù)制產(chǎn)生的基因如果不利于植物適應(yīng)環(huán)境,將很快在自然選擇中被清除掉。Exo70基因家族在登陸過程中擴(kuò)張為3個(gè)類群(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),意味著在適應(yīng)陸地環(huán)境過程中,這3個(gè)類群均發(fā)揮重要且不同于在早期藻類中的新功能。其中GroupⅡ(Exo70A)類群已經(jīng)被證實(shí)在細(xì)胞分裂和維管束形成中發(fā)揮功能。而GroupⅣ包含的某些成員如Exo70H、Exo70B在抗病中發(fā)揮作用,這些都有助于植物適應(yīng)陸地環(huán)境。

3.3 Exo70G亞家族形成與植物適應(yīng)陸地環(huán)境的關(guān)系

Exo70G亞家族(GroupⅢ)Exo70亞基為陸生植物所特有,暗示著該亞基對(duì)于植物適應(yīng)陸地生活發(fā)揮重要功能。和其他類群的Exo70亞基相比,Exo70G亞家族成員在中間的α-螺旋束區(qū)域中以基序15替換了原有的一個(gè)保守基序3,這類替換在其他Exo70亞家族中極為少見。α-螺旋束是多種拴系因子的保守互作區(qū)域,不同蛋白往往通過該區(qū)域和Exo70互作。Exo70G亞家族在該部位序列的改變是否影響其蛋白互作,還有待于進(jìn)一步探討。

本研究中,擬南芥Exo70G基因在鹽脅迫和滲透壓脅迫下高表達(dá),暗示它在抵抗陸地環(huán)境脅迫中發(fā)揮功能。擬南芥Exo70G1亞基定位在TGN上,TGN是植物細(xì)胞囊泡外泌和內(nèi)吞的重要中轉(zhuǎn)站。在抗鹽脅迫和干旱脅迫過程中,TGN參與調(diào)節(jié)Na+/K+離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞定位,從而發(fā)揮重要作用[30]。我們推測(cè)Exo70G也可能在TGN上參與某些物質(zhì)的運(yùn)輸,從而在抗鹽脅迫和干旱脅迫過程中發(fā)揮作用,這可能是植物抗適應(yīng)陸地干旱、高鹽環(huán)境的一種進(jìn)化策略。該假設(shè)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。