陜產(chǎn)附子泡膽工藝的改進(jìn)和優(yōu)化研究

李凡 張景霞 王衛(wèi)鋒 李莎莎 毛阿娟 李雅娟 陳曦 李芳

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,味辛,甘,性大熱,有毒。具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛之功[1]。附子為臨床常用中藥之一,陜西漢中是附子的原產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)之一,種植歷史悠久,產(chǎn)量大,并于 2009年獲得國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。

附子作為毒性藥材的代表,其炮制研究引起了廣泛關(guān)注。自1963年起,附子在每版藥典均有收載,多以炮制品入藥,現(xiàn)代附子飲片市場主流為黑順片等,現(xiàn)代部頒及藥典標(biāo)準(zhǔn)方中運(yùn)用的也有黑順片等規(guī)格。法定標(biāo)準(zhǔn)中雖然對附子的炮制方法進(jìn)行了規(guī)定,以黑順片為例,炮制過程需經(jīng)過泡膽、煮、浸漂、染色、蒸、曬(烘干)等環(huán)節(jié),但其炮制工藝仍停留在傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)控制水平,沒有明確的工藝參數(shù),不同的操作者甚至同一操作者不同批次的加工,都無法保障黑順片炮制加工工藝的穩(wěn)定性及均一性,從而影響飲片的質(zhì)量[2-3]。

泡膽是黑順片產(chǎn)地加工炮制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,膽巴的主要目的是為了防止附子腐爛,利于貯存。膽巴稱鹵水,是制鹽工業(yè)的副產(chǎn)物,是老膽水經(jīng)蒸發(fā)濃縮而凝固成型,其主要成分以氯化鈣、氯化鎂為主,能凝固蛋白質(zhì)而具有防腐作用,對胃、皮膚、食管也具有腐蝕作用,而鎂離子被吸收后能抑制心血管和神經(jīng)系統(tǒng),對人具有毒性[4],且膽巴無法定標(biāo)準(zhǔn)。

本團(tuán)隊前期曾去陜西漢中實(shí)地考察,當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶和企業(yè)有用氯化鈣進(jìn)行泡膽的操作。課題組采集了產(chǎn)自漢中4個縣(區(qū))的15批泥附子樣品,采用超高效液相色譜法同時對樣品中6種酯型生物堿的含量進(jìn)行測定[5]。

故本文在前期研究基礎(chǔ)上擬對有藥典標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣代替?zhèn)鹘y(tǒng)膽巴作為附子防腐、加工和炮制的輔料的可能性和科學(xué)性進(jìn)行探討,并在單因素的基礎(chǔ)上,以效/毒為指標(biāo),以三因素(浸泡時間、氯化鈣濃度、料液比)三水平,采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計對陜產(chǎn)附子的浸泡工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

附子(采于陜西漢中),樣品經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院王衛(wèi)鋒教授鑒定均為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的子根; 膽巴(四川省蓬萊鹽化有限公司生產(chǎn)),氯化鈣(食品級,山東?；煞萦邢薰韭然}廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

對照品:苯甲酰新烏頭原堿,批號:CHB180310,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%;苯甲酰烏頭原堿,批號:CHB180309,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%;苯甲酰次烏頭原堿,批號:CHB180307質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%;烏頭堿,批號:CHB180408,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%;新烏頭堿,批號:CHB180311質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%;次烏頭堿,批號:CHB180524質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,均購自克洛瑪科技有限公司。

試劑:乙腈為HPLC 級試劑(美國賽默飛公司),色譜用水(娃哈哈純凈水);其它試劑均為分析純(國藥集團(tuán))。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

Waters Acquity H-CLASS型超高效液相色譜儀(UPLC EmpowerTM3 色譜工作站、PDA 檢測器)、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)、電子分析天平(型號:BP211D型,德國賽多利斯)、超聲波清洗機(jī)(型號:KH-300DE,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、紅外快速干燥箱(型號:WS70-1,上海市吳淞五金廠制造)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號:RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠)、循環(huán)水式多用真空泵(型號:SHB-III,鄭州長城科工貿(mào))、臺式離心機(jī)(型號:TGL-16G,上海安亭科學(xué))、電子調(diào)溫電熱套(型號:98-1-B,天津泰斯特)

1.4附子生物堿類成分的含量測定

1.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱為Waters ACQYITYC18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);乙腈為流動相A,0.04 mol/L乙酸銨溶液(氨水調(diào)pH=10)為流動相B,(A∶B,V∶V)0～5分鐘,26% A;5～15分鐘,26%～39% A;15～20分鐘,39%～45% A;20～25分鐘,45%～39% A;25～30分鐘,39%-26% A;流速:0.3 mL/分鐘;柱溫:25 ℃;對照品進(jìn)樣量:2 μL;供試品進(jìn)樣體積:1 μL;檢測波長為235 nm[6]。

1.4.2 溶液的制備 (1)對照品溶液的制備:取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品適量,精密稱量,加異丙醇—二氯甲烷(1∶1)混合溶液,各質(zhì)量濃度為:苯甲酰新烏頭原堿46.36 μg/mL、苯甲酰烏頭原堿16.77 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿32.105 mg/mL、新烏頭堿138.23 μg/mL、烏頭堿92.4 μg/mL和次烏頭堿130.82 μg/mL。(2)供試品溶液的制備:取各個泡膽炮制環(huán)節(jié)的附子樣品,洗凈、切片后干燥,粉碎制備成粉末。取取各樣品粉末(過三號篩)約2 g,精密稱定,置于錐形瓶中,加入氨試液3 mL,精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL,稱重,超聲處理(功率300 W,頻率40 HZ,水溫在25 ℃以下)30分鐘,放冷,再稱重,用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足重量,搖勻,濾過,精密量取濾液25 mL,40 ℃以下減壓回收溶劑至干,精密加入0.05 %鹽酸甲醇溶液3 mL復(fù)溶解殘渣,過 0.22 μm濾膜,取濾液,即得[7]。

1.5泡膽工藝的改進(jìn)

1.5.1 膽巴溶液的配制 取膽巴加水配制成濃度為20%的膽巴溶液[8]。

1.5.2 氯化鈣溶液的配制 取氯化鈣加水配制成濃度為20%的氯化鈣溶液。

1.5.3 不同浸泡時間考察 取附子約4 kg,除去須根,洗凈。分別取2 kg,以1∶4的料液比浸入配制好的膽巴水溶液和氯化鈣溶液中。浸泡時間均設(shè)定為:0天、1天、3天、5天、7天、9天、11天、13天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、22天、25天、30天,分別浸泡不同時間后取出,縱切成厚約0.2～0.5 cm的切片,在60°C下烘干,測定不同浸泡時間附子生物堿含量差別。

2 結(jié)果

2.1附子生物堿類成分的含量測定

超高效液相色譜法(UPLC)分別測定膽巴浸泡與氯化鈣浸泡后雙酯型(以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿總量計)與單酯型(以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿計)生物堿總量,測定結(jié)果見表1。附子經(jīng)不同時間膽巴溶液與氯化鈣溶液浸泡,雙酯型生物堿總含量呈下降趨勢。單酯型生物堿總量在浸泡第7天左右總量升高,在浸泡20天左右單酯型生物堿總量下降,處于平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,附子經(jīng)過膽巴溶液與氯化鈣溶液浸泡生物堿含量變化大體一致,產(chǎn)地加工可用氯化鈣溶液浸泡附子代替膽巴溶液浸泡。結(jié)果見圖1～2。

圖1 不同浸泡時間附子中雙酯型生物堿總量變化趨勢圖

圖2 不同浸泡時間附子中單酯型生物堿總量變化趨勢圖

2.2改進(jìn)后的泡膽工藝參數(shù)的優(yōu)選

2.2.1 單因素試驗(yàn)對泡膽初加工的考察 參考文獻(xiàn)[8-10],在單因素試驗(yàn)中以效/毒值(苯甲酰新烏頭原堿含量/雙酯型生物堿總含量)為指標(biāo),可較為全面的反映附子在氯化鈣水溶液中的浸泡過程,選取浸泡時間、氯化鈣濃度、料液比為因素進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.2 浸泡時間對效/毒的影響 取附子,除須根,洗凈,稱取5份,每份約150 g,按1∶4的料液比加入25%的氯化鈣溶液,分別浸泡6、12、18、24、30天,切片,60°C下烘干。按本章“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品,考察不同浸泡時間對效/毒的影響?？芍?效/毒隨著浸泡時間的增加,在18天時含量出現(xiàn)微下降。故選擇浸泡時間為18天,結(jié)果見表2。

表2 浸泡時間對附子效/毒的影響

2.2.3 料液比對效/毒的影響 取附子,除須根,洗凈,稱取5份,每份約150 g,分別按料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6加入25 %的氯化鈣溶液,浸泡18天,切片,60°C烘干。按本章“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品,考察料液比對效/毒的影響?？芍?效/毒隨料液比的增加趨勢趨于平緩,故選擇料液比為1∶4,結(jié)果見表3。

表3 料液比對附子效/毒的影響

2.2.4 氯化鈣濃度對效/毒的影響 取附子,除須根,洗凈,稱取5份,每份約150 g,按料液比1∶4分別加入濃度為10 %、15 %、20 %、25 %、30 %的氯化鈣溶液,浸泡18天,切片、60°C下烘干。按本章“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品,考察氯化鈣用量對效/毒的影響?？芍?隨著氯化鈣濃度的增加,效/毒在25 %時最高。因此,選用25%的氯化鈣溶液,結(jié)果見表4。

表4 氯化鈣濃度對附子效/毒的影響

2.2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選初加工工藝條件 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用中心組合設(shè)計,設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn),根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理,用浸泡時間(X1)、料液比(X2)、氯化鈣濃度(X3)為因素,以效/毒為響應(yīng)值,結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 通過浸泡時間(X1)、料液比(X2)、氯化鈣濃度(X3)進(jìn)行綜合響應(yīng)面分析,考察效/毒,結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

2.3.2 二次響應(yīng)面回歸模型建立 利用Design-Expert 10.0.4 軟件,設(shè)計出不同的炮制工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以綜合評分Y為響應(yīng)值,分析得到回歸方程為:

Y=0.077+5.975E-003X1+1.382E-003X2-2.156

-003X3+1.692E-003X1X2+8.962E-003X1X3

+5.960E-003X2X3-0.017X12-7.192E-003X22

-3.846E-003X32,相關(guān)系數(shù)R2=0.9077。

2.3.3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析 從表7可以看出,模型的F=7.65,P=0.0069<0.01,表明此模型具有顯著性,構(gòu)建有效。失擬項(xiàng)P=7.78>0.05,是不顯著的,即試驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型預(yù)測值相符合,模型構(gòu)建合理。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?數(shù)據(jù)R2=0.9077,AdjR2=0.78915,并且自變量和響應(yīng)值之間有相互的對應(yīng)關(guān)系,說明回歸方程能夠真實(shí)的模擬響應(yīng)曲面的情況,響應(yīng)值的變化有78.9%的概率與本實(shí)驗(yàn)考察的三因素變化有關(guān)。R2-AdjR2=0.2,說明實(shí)驗(yàn)中存在的誤差對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。Adeq precisior=8.349,說明實(shí)驗(yàn)中存在的誤差對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響也很小,信噪比很大,同時根據(jù)圖4可以看出,預(yù)測值與實(shí)際值較近,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的模型能夠預(yù)測效/毒值,由實(shí)驗(yàn)P 值可知,本實(shí)驗(yàn)三個因素對效/毒的影響大小不同,順序?yàn)閄1>X3>X2,交互影響大小順序?yàn)閄1X3>X2X3>X1X2。其中X1、X1X3、X12、X22對綜合評分較大(P<0.05),X2、X3、X1X2、X2X3、X32影響較小(P>0.05)。

圖4 二次響應(yīng)面回歸構(gòu)建的模型預(yù)測效/毒值與實(shí)際效/毒值比較

表7 響應(yīng)面方差分析

2.3.4 響應(yīng)面曲面分析 響應(yīng)面坡度越陡,表示兩因素交互作用越明顯。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,越密集,效應(yīng)越強(qiáng)。橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則相反。由圖5、6、7可看出,AC和BC的等高線形成的橢圓形長軸和短軸之比較大,說明AC和BC之間交互影響比AB之間交互影響顯著。由圖8可知,隨著浸泡時間的增加,效/毒值也在增加,曲面變得陡峭,而料液比曲面相對平緩,說明浸泡時間影響較大。由圖9可知,隨著浸泡時間的增加,效/毒值先升高再降低,曲面坡度較陡,而氯化鈣濃度的增加,效/毒值曲面較平坦,相比來說浸泡時間的影響較大。由圖10可知,在氯化鈣濃度和料液比的增加,曲面走向變的平緩,根據(jù)3D曲面圖,得出浸泡時間和料液比,浸泡時間和氯化鈣濃度的交互作用大于料液比和氯化鈣的交互作用。經(jīng)軟件數(shù)據(jù)分析,響應(yīng)面最優(yōu)工藝為:X1浸泡時間為19.2天、X2料液比為1∶4.15、X3氯化鈣濃度為25.37%。

圖5 浸泡時間與料液比對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖6 浸泡時間與氯化鈣濃度對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖7 料液比與氯化鈣濃度對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖8 浸泡時間與料液比對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖9 浸泡時間與氯化鈣濃度對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖10 氯化鈣濃度與料液比對附子效/毒的交互作用影響3D圖

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過對圖形數(shù)據(jù)的分析,對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零,優(yōu)化得到最佳的提取工藝為浸泡19.2天、料液比1∶4.15、氯化鈣濃度25.37%?？紤]實(shí)際條件,將浸泡時間、料液比及氯化鈣濃度分別調(diào)整為19天、1∶4、25%。取生附子分為3份,用以上條件進(jìn)行浸泡,得到平均效/毒為(0.069±0.012),在理論值0.071的誤差范圍內(nèi),說明回歸模型建立得準(zhǔn)確可靠。

3 討論

通過二極管陣列檢測器對樣品在190 nm～400 nm進(jìn)行掃描,結(jié)果在235 nm波長處,各色譜峰分離度較好,故選擇235 nm作為檢測波長。本實(shí)驗(yàn)通過查閱文獻(xiàn),分別考察了流動相系統(tǒng):乙腈-0.04 mol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸水及乙腈-0.04 mol/L乙酸銨(調(diào)0.04 mol/L乙酸銨溶液的PH=10),結(jié)果以采用0.04 mol/L 乙酸銨(PH=10)為流動相A,乙腈為流動相B時各色譜峰能實(shí)現(xiàn)良好分離且基線平穩(wěn);考察了柱溫對混合對照品分離效果的影響,結(jié)果得知在25℃、30℃、35℃的柱溫下均比較穩(wěn)定,對色譜峰的分離效果影響不明顯,但考慮高柱溫過高會對儀器和柱子可能造成損耗,最后將柱溫設(shè)為25℃;最后考察了制樣方法,首先考察了在制樣過程中超聲提取時加入氨試液對色譜峰的影響,其次考察了0.05%鹽酸甲醇和異丙醇-二氯甲烷(1∶1復(fù)溶樣品),最終確定的制樣是需要加入氨試液,創(chuàng)造堿性環(huán)境,減壓濃縮的殘渣用0.05%鹽酸甲醇復(fù)溶。

本實(shí)驗(yàn)將附子分別在膽巴溶液和氯化鈣溶液中浸泡20天時,與生附子相比,單酯和雙酯型生物堿在膽巴中的降低率分別達(dá)到62%和51%;在氯化鈣溶液中的降低率分別為60%和48%,之后兩種溶液中含量趨于平緩,說明一定程度上氯化鈣溶液浸泡附子可代替食用膽巴溶液浸泡,也證明了附子“用膽腌足二十日”的記載[14]具有一定的合理性與科學(xué)性。有研究表明附子在膽巴溶液(以氯化鈣計)中浸泡,在第9天到第25天時氯化鈣含量逐漸增加,達(dá)到26%是到飽和狀態(tài),有防腐作用[15],與本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的用25%的氯化鈣溶液進(jìn)行浸泡結(jié)果相符。

本研究運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計效應(yīng)面法對改進(jìn)后的陜產(chǎn)附子泡膽工藝進(jìn)行了優(yōu)選,為后期陜產(chǎn)附子的進(jìn)一步炮制研究及質(zhì)量控制研究等奠定了基礎(chǔ)。