基于高通量測序分析早期新生兒腸道和咽部微生物菌群

王學(xué)娟 邵志英 朱敏蓉 游銘鈺 張宇涵 陳筱青

（1.上海市浦東新區(qū)婦幼保健院新生兒科，上海 201206；

2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京 210029）

近年來，人體微生物群的研究受到越來越多的關(guān)注，尤其是“腸-肺軸”概念的提出，使腸道和肺部微生物群的研究得到了突破性的進(jìn)展。腸-肺軸是一種雙向軸，腸道和肺之間通過微生物群相互串?dāng)_，影響機(jī)體的穩(wěn)態(tài)和疾病的進(jìn)展［1-2］。圍生期作為體內(nèi)微生態(tài)菌群定植及免疫介導(dǎo)效應(yīng)形成的重要時期，也是腸道與肺部共生菌群之間發(fā)生交互作用的重要時期。已有研究表明，咽部微生物與下呼吸道微生物之間存在著大量重疊，咽部微生物可以在一定程度上反映呼吸道微生物的特征［3］。目前對腸道和肺部微生物群間交互調(diào)控的時機(jī)研究較少［4］，且大部分集中在嬰幼兒和年長兒［5-6］。本研究采用16S rRNA測序技術(shù)探討早期新生兒腸道和咽部微生物群的組成和功能，以期進(jìn)一步探索腸-肺軸早期微生物群的特征，為早期預(yù)防和治療疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2021年9月—2022年1月出生于上海市浦東新區(qū)婦幼保健院的混合喂養(yǎng)的足月健康新生兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）37 周≤胎齡＜42 周，順產(chǎn)，單胎；（2）母親無吸煙、酗酒、非法藥物使用史，孕期體健，母親無產(chǎn)前發(fā)熱、羊水污染、胎膜早破，無圍生期抗生素應(yīng)用史；（3）母親產(chǎn)前1 個月內(nèi)和/或新生兒生后均無益生菌制劑使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）新生兒出生時有窒息、顱內(nèi)出血等病史；（2）新生兒有先天性畸形或遺傳代謝性疾病；（3）新生兒在研究期間患有高膽紅素血癥或其他新發(fā)疾?。唬?）成對樣本（糞便和咽拭子樣本）采集不完整或重要臨床資料數(shù)據(jù)不全者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入12例新生兒，平均胎齡為（278±4） d，平均出生體重為（3 516±337）g，生后混合喂養(yǎng)（母乳與配方奶的比例為40%～60%，母乳為親喂，配方奶為無益生菌相關(guān)物質(zhì)添加的整蛋白牛乳配方）。按采樣部位及采樣時間不同分為4組，分別為S1（糞便，出生當(dāng)天）、T1（咽拭子，出生當(dāng)天）、S2（糞便，出生后5～7 d）、T2（咽拭子，出生后5～7 d）。本研究通過上海市浦東新區(qū)婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)（20210615B），新生兒監(jiān)護(hù)人均知情并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

由經(jīng)過培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員于新生兒出生當(dāng)天和出生后5～7 d分別采集糞便和咽拭子樣本。（1）糞便采樣方法：使用一次性無菌糞便采樣管采集新生兒生后首次胎糞及第5～7天自然排出的新鮮糞便3～5 g。（2）咽拭子采樣方法：生后4～6 h內(nèi)及第5～7天晨起沐浴時采樣，采樣前30 min不進(jìn)食，用無菌采樣拭子迅速擦拭其咽后壁及雙側(cè)顎弓后放入無菌凍存管，每次采集3份樣本。采樣完成編號后立即放入-40℃冰箱，1周內(nèi)用干冰運(yùn)送至實驗室，放入-80℃冰箱保存待檢。

1.3 資料收集

通過體格檢查、詢問病史的方式收集新生兒及其母親的相關(guān)臨床資料。

1.4 樣本DNA提取、擴(kuò)增及建庫

采用Omega 的E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit（型號M5635-02），按說明書提取糞便和咽拭子樣本中微生物的總DNA?；?6S rRNA基因的V3—V4可變區(qū)通用引物（341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）進(jìn)行2 次聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后使用熒光定量系統(tǒng)對文庫進(jìn)行定量，再使用Illumina MiseqTM/HiseqTM平臺對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)測序建庫。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用USEARCH軟件，將獲得的有效序列按照97% 相似度進(jìn)行聚類，得到操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），然后利用RDP classifier 與RDP 數(shù) 據(jù) 庫（http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）比對，對物種進(jìn)行注釋，從而獲得每個OTU 對應(yīng)的物種分類信息。樣本檢測及測序服務(wù)由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。利用Mothur 軟件計算生物多樣性指數(shù)：Ace 指數(shù)和Chao1指數(shù)反映生物的豐富度，指數(shù)越大，表明豐富度越高；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映生物的多樣性，Shannon 指數(shù)越大，表明多樣性越高，Simpson指數(shù)則相反。利用R 3.6.0軟件制作稀釋性曲線圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）圖及相對豐度柱狀圖。采用STAMP 2.1.3 軟件對不同生態(tài)位的差異類群進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，組間相似性分析采用相似性分析法（analysis of similarities，ANOSIM）；計數(shù)資料采用構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序情況

所有樣本進(jìn)行16S rRNA 測序后共獲得原始序列3 000 429 條，經(jīng)過濾處理后，20%的序列被去除，最終用于后續(xù)分析的有效序列有2 384 091條，平均堿基長度（422±6）bp，基本覆蓋數(shù)據(jù)庫中V3—V4區(qū)的長度范圍為341～805 bp，平均460 bp。

2.2 稀釋曲線

如圖1所示，隨著測序量的增加，OTU數(shù)目逐漸增加，達(dá)到最大測序量時，只有少數(shù)樣本的曲線未達(dá)到飽和，每個樣本平均測序量均在15 000個讀長以上，結(jié)合各樣本曲線形態(tài)說明本研究測序深度、覆蓋度足夠，適合進(jìn)行下一步分析比較。

圖1 OTU稀釋性曲線圖 橫軸為樣本中隨機(jī)抽取的序列數(shù)，縱軸為該序列數(shù)下對應(yīng)的OTU數(shù)目，每條曲線代表一個樣本。

2.3 生物多樣性指數(shù)分析

2.3.1 α 多樣性 由表1～2 可見，新生兒出生當(dāng)天咽部菌群的多樣性高于腸道、豐富度低于腸道，至出生后5～7 d 咽部菌群的多樣性及豐富度均高于腸道，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 S1與T1組間α多樣性指數(shù)比較 ［M（P25，P75）］

表2 S2與T2組間α多樣性指數(shù)比較 ［M（P25，P75）］

2.3.2 β 多樣性 ANOSIM 分析結(jié)果顯示，各組組間差異大于組內(nèi)差異（R值均＞0），除S1組與T1組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外（P=0.076），其余差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），見表3。為了比較腸道和咽部整體微生物群的組成，基于OTU 水平進(jìn)行了PCA分析。由圖2可見，同一生態(tài)位的不同時間之間菌群明顯分離，組內(nèi)菌群組成差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）；而同一時間的不同生態(tài)位之間菌群組成對比結(jié)果不同：出生當(dāng)天腸道和咽部微生物群的組成差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.076），隨著出生時間的推移，出生后5～7 d腸道和咽部菌群的組成差異逐漸增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。

表3 基于Bray-Curtis距離算法的ANOSIM分析結(jié)果

圖2 OTU 水平PCA 圖 橫軸和縱軸表示兩個選定的主成分軸，百分率表示主成分對樣本組成差異的解釋度值；不同顏色或形狀的點代表不同組別的樣本，兩樣本點越接近，表明兩樣本菌群組成越相似。

2.4 早期新生兒不同生態(tài)位微生物群結(jié)構(gòu)的比較

2.4.1 門水平上腸道和咽部的微生物群組成

由圖3可見，腸道和咽部的主要優(yōu)勢菌門均是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門。與出生當(dāng)天相比，新生兒出生后5～7 d腸道的變形菌門相對豐度下降（P=0.003），厚壁菌門（P=0.001）、放線菌門（P=0.003）及擬桿菌門（P=0.021）相對豐度上升；咽部的變形菌門（P＜0.001）及擬桿菌門（P=0.027）相對豐度下降，厚壁菌門相對豐度上升（P＜0.001），放線菌門相對豐度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.733）。出生當(dāng)天，腸道變形菌門的相對豐度高于咽部（P=0.005）；出生后5～7 d，腸道放線菌門和變形菌門的相對豐度高于咽部（分別P=0.021、0.019），厚壁菌門相對豐度低于咽部（P=0.021）。

圖3 門水平各組菌群相對豐度 圖中橫軸代表分組名，縱軸代表菌群組成相對豐度構(gòu)成比，不同顏色代表不同的菌群。

2.4.2 屬水平上腸道和咽部的微生物群組成

出生當(dāng)天，腸道微生物群主要由未分類腸桿菌科（19.30%）、假單胞菌屬（13.95%）、不動桿菌屬（9.31%）、埃希菌-志賀菌屬（8.46%）、慢生根瘤菌屬（5.42%）等組成；出生后5～7 d，腸道菌群主要由雙歧桿菌屬（24.99%）、埃希菌-志賀菌屬（17.69%）、擬桿菌屬（11.36%）、梭狀芽孢桿菌屬（11.11%）、鏈球菌屬（10.39%）、葡萄球菌屬（6.00%）等組成。

出生當(dāng)天，咽部菌群主要由未分類腸桿菌科（8.85%）、慢生根瘤菌屬（8.02%）、葡萄球菌屬（4.78%）、伯克氏菌屬（2.41%）、不動桿菌屬（1.46%）等組成；出生后5～7 d，咽部微生物群以鏈球菌屬（41.26%）、葡萄球菌屬（22.91%）、孿生菌屬（3.61%）、擬桿菌屬（2.53%）、顆粒鏈菌屬（2.38%）等為主，見圖4。

圖4 屬水平各組菌群相對豐度 圖中橫軸代表分組名，縱軸代表菌群組成相對豐度構(gòu)成比，不同顏色代表不同的菌群（總豐度大于1%的菌）。

2.5 不同生態(tài)位的差異類群分析

使用STAMP 2.1.3 軟件進(jìn)行差異分析，比較不同生態(tài)位菌群的相對豐度差異。由圖5可見，出生當(dāng)天，腸道和咽部優(yōu)勢菌屬組成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。出生后5～7 d，腸道和咽部在某些優(yōu)勢菌屬上出現(xiàn)顯著差異。與腸道相比，咽部的鏈球菌屬（P＜0.001）、葡萄球菌屬（P=0.005）、羅氏菌屬（P=0.029）等相對豐度較高，雙歧桿菌屬（P=0.016）、埃希菌-志賀菌屬（P=0.015）的相對豐度較低。

圖5 屬水平組間差異類群分析結(jié)果 圖A、B中，左側(cè)為兩組樣本中不同菌群分類的豐度；中間為95%置信區(qū)間內(nèi)菌群分類豐度的差異；右側(cè)為P值，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，用紅色標(biāo)識。

2.6 腸道和咽部微生物群的功能預(yù)測差異分析

對出生后5～7 d的腸道與咽部菌群進(jìn)行了功能預(yù)測分析，包括直系同源序列聚類數(shù)據(jù)庫（Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能分析。COG 分析表明，咽部菌群的預(yù)測功能主要集中在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)、細(xì)胞骨架上，腸道菌群則與RNA 加工修飾、能量生成和轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等有關(guān)（P＜0.05，表4）。KEGG分析表明，與咽部細(xì)菌相比，腸道細(xì)菌對細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞進(jìn)程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄功能參數(shù)的預(yù)測程度更高（P＜0.05，表5）。

表4 腸道和咽部顯著差異豐度菌群的COG功能比較 （± s）

表4 腸道和咽部顯著差異豐度菌群的COG功能比較 （± s）

功能[A] RNA加工修飾[B] 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)[C] 能量生成和轉(zhuǎn)換[E] 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝[G] 碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝[H] 輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[K] 轉(zhuǎn)錄[L] 復(fù)制、重組和修復(fù)[M] 細(xì)胞壁/膜/被膜的生物合成[T] 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[U] 胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和小泡運(yùn)輸[Z] 細(xì)胞骨架S2組 (n=12)7 006±1 182 2 801±967 1 260 965±412 022 2 396 333±728 292 2 822 757±967 001 1 018 676±92 586 2 044 700±623 428 1 881 524±662 735 1 757 692±207 164 1 232 951±131 816 496 734±63 943 105±50 T2組 (n=12)1 697±611 3 785±417 868 187±333 120 1 776 860±625 716 1 587 650±614 407 774 108±82 590 1 417 301±515 359 1 273 296±444 621 1 177 955±143 105 788 007±103 993 350 006±39 351 449±161 P值0.010 0.043 0.018 0.036 0.001 0.024 0.013 0.015 0.011 0.004 0.024 0.011

表5 腸道和咽部顯著差異豐度菌群的KEGG功能比較 （± s）

表5 腸道和咽部顯著差異豐度菌群的KEGG功能比較 （± s）

功能心血管疾病細(xì)胞運(yùn)動細(xì)胞進(jìn)程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)分泌系統(tǒng)排泄系統(tǒng)免疫系統(tǒng)代謝性疾病神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成S2組 (n=12)69±36 381 285±87 552 1 053 675±117 977 214±83 83 281±11 667 4 905±1 359 16 509±2 452 35 403±11 258 25 114±2 888 735 598±192 276 284 552±118 604 T2組 (n=12)860±369 143 209±35 513 715 918±76 780 1 609±446 44 826±7 824 2 027±778 6 627±1 747 25 846±9 230 13 584±2 035 548 708±187 131 159 958±70 668 P值0.001 0.004 0.024 0.003 0.006 0.015 0.004 0.033 0.003 0.025 0.005

3 討論

腸道和肺是人體兩大重要的微生物生態(tài)位，有著共同的黏膜起源，其菌群成分和代謝產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)全身和局部免疫的能力。研究表明，腸道菌群和呼吸系統(tǒng)之間存在雙向調(diào)控的腸-肺軸［5］。腸-肺軸解釋了肺和腸之間的相關(guān)性，一方面腸道菌群及其代謝產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的信號通路，影響肺部疾病的發(fā)生發(fā)展；另一方面，肺部疾病尤其是感染性疾病，可造成菌群紊亂并通過免疫調(diào)節(jié)影響腸道［7］。對腸道和咽部微生物群組成和功能的分析可能有助于進(jìn)一步研究腸道和肺部微生物群的動態(tài)和穩(wěn)態(tài)。

本研究表明，早期新生兒咽部微生物群多樣性高于腸道，與Yang等［3］的研究結(jié)果一致；出生當(dāng)天咽部微生物群的豐富度低于腸道，至出生后5～7 d 則高于腸道，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究ANOSIM分析表明，出生當(dāng)天，腸道和咽部的組間差異較小，至出生后5～7 d，組間差異增大；PCA 分析顯示，至出生后5～7 d 腸道和咽部的樣本明顯分開，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與以往的報道［8］相一致。

微生物組成分析表明，早期新生兒腸道和咽部微生物群均以厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門為主，與既往研究［9-10］一致。出生當(dāng)天，腸道和咽部的優(yōu)勢門均為變形菌門；屬水平上的菌群組成亦無顯著差異，這表明出生時腸道和咽部菌群的起源可能是相同的。至出生后5～7 d，腸道和咽部微生物群在門、屬水平上均顯現(xiàn)出差異，咽部以鏈球菌屬（41.26%）和葡萄球菌屬（22.91%）為主，與嬰兒的口腔微生物群相似［11］；腸道以雙歧桿菌屬（24.99%）、埃希菌-志賀菌屬（17.69%）為主，與B?ckhed等［12］的研究一致。這些結(jié)果同樣表明人體腸道和咽部菌群早在出生1周內(nèi)已出現(xiàn)分化?？v向分析可見，門水平上，腸道從最初的變形菌門最豐富演變?yōu)樽冃尉T、厚壁菌門、放線菌門及擬桿菌門共同主導(dǎo)；咽部由厚壁菌門取代最初的變形菌門成為絕對優(yōu)勢門。屬水平上，腸道由最初的需氧或兼性厭氧菌為主演變?yōu)橐噪p歧桿菌、擬桿菌等厭氧菌為主的菌群組成；咽部則持續(xù)以需氧或兼性厭氧菌為主，其中鏈球菌及葡萄球菌顯著增加成為優(yōu)勢菌。這些初步和探索性的結(jié)果表明，新生兒早期微生物定植是一個動態(tài)演變的過程，且與定植部位及時間變量有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，出生1周左右新生兒的腸道菌群主要由厚壁菌門和放線菌門組成，其中放線菌門的雙歧桿菌屬在腸道菌群中起重要作用。咽部菌群主要由厚壁菌門組成，其中的鏈球菌屬為優(yōu)勢屬。雙歧桿菌是健康嬰兒腸道的主要分類群，可產(chǎn)生短鏈脂肪酸防止病原體的定植和腸道致病菌的感染［13-14］。鏈球菌屬是健康人體口咽微生物的最優(yōu)菌屬［15-16］，是一個非常異質(zhì)性的群體，包括共生菌和病原體，共生鏈球菌可以產(chǎn)生過氧化氫抑制病原微生物的生長，包括醫(yī)院內(nèi)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，因此它被認(rèn)為是一種潛在益生菌［17-18］。

本研究表明，腸道菌群在能量生成和轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝及輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝這些新陳代謝相關(guān)功能的預(yù)測上更具優(yōu)勢?？赡艿脑蚴悄c道菌群具有消化功能，富含大量細(xì)胞，需要更多的細(xì)菌富集［19］。腸道菌群產(chǎn)生與能量相關(guān)的代謝物，如葡萄糖和甘露糖［20］。咽部菌群在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)方面更加豐富，它們可能與肺的氣體交換有關(guān)，氣體交換需要免疫防御，并產(chǎn)生大量抗體。因此，咽部菌群的功能更多地集中在免疫防御相關(guān)的代謝產(chǎn)物，如免疫球蛋白A［21］。腸道菌群在細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞進(jìn)程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄，以及內(nèi)分泌、排泄、免疫、代謝和神經(jīng)系統(tǒng)功能方面的預(yù)測功能較咽部菌群更具優(yōu)勢，已被證明是當(dāng)今許多疾病的治療靶點［22-23］。

本研究尚存在一些局限與不足。（1）樣本量較小，為了保留數(shù)據(jù)的真實性，未剔除離群值；（2）由于新生兒臨床樣本采集的困難性及倫理限制，未進(jìn)行下呼吸道樣本的比較跟蹤；（3）受檢測技術(shù)所限，結(jié)果只分析到了屬水平。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示了早期健康新生兒腸道和咽部具有獨特的微生物群組成和功能，并有一些共同的微生物群，這些微生物群在腸-肺軸中的具體作用還有待進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步了解腸道和肺部微生物群之間的初始關(guān)系提供了基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。