啟良重樓內(nèi)生細菌的分離鑒定及其次級代謝產(chǎn)物研究

劉玉 方昕悅 孫慧茹 李偉 李宇 閆加力 羅凱 何美軍

關(guān)鍵詞：啟良重樓；內(nèi)生細菌；抑菌作用；抗氧化；次級代謝產(chǎn)物

近年來，對抗生素產(chǎn)生耐受性的致病菌種類不斷增加且自由基的異常積累會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致多種疾病產(chǎn)生，對人類健康造成極大威協(xié)。植物內(nèi)生細菌是生活在健康植物組織內(nèi)、促進植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物合成和積累的微生物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藥用植物內(nèi)生菌可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性，是各類抗菌與抗氧化劑的重要來源和具有商業(yè)價值的新型生物活性物質(zhì)。

放良重樓（Paris qiliangianaH．Li，J．Yang&Y．H．Wang）為百合科（Liliaceae）重樓屬（Paris）多年生草本植物，是2017年在湖北省竹溪縣境內(nèi)發(fā)現(xiàn)并鑒定的重樓新種。研究表明，重樓屬植物中含有抗菌、抗氧化、抗腫瘤和預(yù)防心血管疾病等活性成分。我國藥用植物內(nèi)生細菌資源豐富，但對于放良重樓內(nèi)生細菌及其代謝產(chǎn)物的研究尚未見報道。本試驗分離和鑒定了藥用植物放良重樓內(nèi)生細菌，評估了其次生代謝產(chǎn)物的抗菌和抗氧化性能，并通過GC-MS分析鑒定了乙酸乙酯提取物的活性成分，以期為今后放良重樓內(nèi)生菌資源的進一步開發(fā)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

放良重樓（Paris qiliangiana）健康植株于2020年10月在恩施市新塘縣的華中藥用植物園采集，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所鑒定。

胰蛋白胨、卡那霉素、酵母提取物、瓊脂，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。無水乙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜、氯化鈉、次氯酸鈉溶液，均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HP-5MS石英毛細管柱（30mm×0.25mm×0.25mm），安捷倫科技有限公司；酶標(biāo)儀（HF4500），北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)箱（CR-80C02），廣州市康恒儀器有限公司；冷凍離心機（3K15），德國西格瑪公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BC-R208），上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；電子天平（FA20048），上海佑科儀器儀表有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（Q5200DE），昆山市超聲儀器有限公司；氣浴恒溫振蕩器（THZ-B），常州杰博森儀器有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD），上海達平儀器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020），上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3啟良重樓內(nèi)生細菌的分離純化

在Li等的方法基礎(chǔ)上進行優(yōu)化。無菌條件下將樣品表面消毒，而后在滅菌研缽中加入2mL無菌水輕柔研磨，懸浮液用無菌水稀釋成不同濃度，分別涂布在Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基上，倒置于37cC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—48h，挑取單菌落進行分離純化培養(yǎng)。

1.4啟良重樓內(nèi)生細菌鑒定

將純化后的單菌落培養(yǎng)48h，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行特征描述。挑取少量菌體制作臨時裝片，用革蘭氏染色法進行初步鑒定。

基于細菌16SrDNA基因序列分析進行分子鑒定。采用CTAB法提取放良重樓內(nèi)生細菌基因組DNA。以27F（5一GAGTTTGATCACTGGCTCAG -3'）和1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGA-3 7）為引物進行細菌16S rDNA序列擴增，PCR反應(yīng)體系（25uL）：上、下游引物各1uL，模板DNA1uL，2×Mix （fastpfu）12.5uL，ddH209.5uL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min; 94℃變性1min，55℃退火40s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)：72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，使用NCBI（https：//blast. nc-bi.nlm. nih. gov/Blast. cgi）進行BLAST比對，確定菌株種類，運用MEGA-X10.2.2軟件（https：／／www. megasoftware. net/）通過鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5放良重樓內(nèi)生細菌代謝產(chǎn)物獲取

將純化后的各菌株接種到1mLLB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24h，得到種子液，而后取0.5mL接種到100mLLB液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)7d得到菌株發(fā)酵液。各菌株發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次，減壓冷凝濃縮得到次級代謝產(chǎn)物濃縮物，在真空干燥箱中烘干。

1.6啟良重樓內(nèi)生細菌代謝產(chǎn)物活性分析

采用濾紙片法測試放良重樓內(nèi)生細菌對10株供試菌的抑菌活性。10株供試病原細菌由中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室提供，均經(jīng)過單孢分離純化備用（表1）。取20培養(yǎng)至OD值為0.6的供試菌菌液，與20mLLB固體培養(yǎng)基混合均勻倒平板。放良重樓內(nèi)生細菌濃縮后的次生代謝產(chǎn)物用二甲基亞砜（dime-thyl sulfoxide，DMSO）溶解，取10L分3次滴加于濾紙片（直徑為8.00mm）上，將濾紙片置于上述培養(yǎng)基上，另設(shè)卡那霉素（25mg/mL）作陽性對照、添加DMSO作陰性對照，37℃培養(yǎng)12h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，取3次重復(fù)測量的平均值為最終值。

采用微量肉湯稀釋法和瓊脂培養(yǎng)基平板法測定放良重樓內(nèi)生細菌代謝產(chǎn)物對供試菌的MIC和MBC值，按美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI）M07-AIO的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行。抗生素藥敏標(biāo)準(zhǔn)：高敏，抑菌圈直徑>20mm;中敏，抑菌圈直徑10～20mm；輕敏或耐藥，抑菌圈直徑<10mm。

采用DPPH法測定3株內(nèi)生細菌的抗氧化活性，以抗壞血酸溶液為對照。將100LDP-PH和100L乙醇混合溶液、100L DPPH溶液和100L不同濃度梯度的放良重樓內(nèi)生細菌代謝物、100L乙醇和100L不同濃度梯度的放良重樓內(nèi)生細菌代謝產(chǎn)物分別加入酶標(biāo)板中，30℃避光孵育30min。在517nm下檢測吸光值，計算樣品清除DPPH自由基的百分率，公式如下：

1.7啟良重樓內(nèi)生細菌提取物GC-MS分析

內(nèi)生細菌發(fā)酵液經(jīng)減壓濃縮干燥后，用乙酸乙酯充分溶解，13000r/min離心10min取上清液，0.22m濾膜過濾，取2L濾液進行GC-MS分析，每組3個重復(fù)。色譜條件：HP-5MS石英毛細管柱（30mm×0.25 mm×0.25mm）；柱溫：起始溫度60℃，程序升溫3℃/min至280℃，保持40min；柱流量為1.0mL/min；進樣口溫度250℃；柱前壓100kPa;分流比2：1；進樣量1.0L；載氣為高純氦氣。質(zhì)譜條件：電離方式E1;電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃：質(zhì)量范圍35～500Da;采用NIST11和wiley7n.1標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索鑒定揮發(fā)性成分，采用面積歸一化法對各成分進行定量分析。

1.8數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)運用Origin9和GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1啟良重樓內(nèi)生細菌鑒定及進化樹構(gòu)建

從放良重樓根莖中分離純化鑒定出3株細菌，CLX1為革蘭氏陽性，桿狀，菌落白色，圓形，不透明，表面光滑且隆起，邊緣整齊且光滑；CLX2、CLX3為革蘭氏陰性，短桿狀。CLX2菌落白色，圓形，不透明，邊緣整齊，表面光滑濕潤；CLX3菌落白色，圓形，表面光滑、濕潤，不透明（圖1）。3株內(nèi)生細菌（CLX1、CLX2、CLX3） 16SrDNA序列的堿基全長分別為1459、1445、1413bp，上傳到GenBank中獲得的登錄號分別為MW321629、MW321628、MW321627。系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，結(jié)合形態(tài)特征與16SrDNA基因鑒定結(jié)果，CLX1、CLX2、CLX3菌株分別為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、Lelliottia aquatilis、居中克呂沃爾氏菌（Kluyvera intermedia）。

2.2啟良重樓內(nèi)生細菌提取物活性研究

由圖3可知，3株內(nèi)生細菌具有不同程度的抑菌活性。B．megaterium（CLX1）代謝產(chǎn)物的抑菌圈范圍在（10.39+0.24） mm～（13.44+0.10）mm，有中度敏感抑制作用；L．a(chǎn)quatilis（CLX2）代謝產(chǎn)物的抑菌圈范圍在（9.52+0.42） mm～（18.20+1.50）mm．對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌和大腸桿菌有中度敏感抑制作用；kintermedia（CLX3）代謝產(chǎn)物的抑菌圈范圍在（9.38+0.42）mm～（16.59+0.41）mm，對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌有中度敏感抑制作用。

由表2可知，B．megaterium（CLX1）的代謝產(chǎn)物對糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的MIC值分別為0.33、2.61、1.31、1.31、2.61mg/mL，MBC值分別為2.61、20.88、10.44、10.44、10.44mg/mL;Laquatilis（CLX2）的代謝產(chǎn)物對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌、大腸桿菌的MIC值分別為18.55、18.55、18.55、4.64、9.27、9.27、74.18mg/mL，對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、多耐銅綠假單胞菌、大腸桿菌的MBC值為74.18mg/mL，對蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的MBC值為37.09mg/mL；Kintermedia（CLX3）的代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌的MIC值分別是2.53、1.27、2.53、5.06、5.06、5.06、1.27mg/mL，MBC值分別為20.25、10.13、20.25、40.50、40.50、20.25、10.13mg/mL。

總體上看，放良重樓3株內(nèi)生細菌代謝產(chǎn)物的抑菌譜較廣，對于抗卡那霉素的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌都有較好的抑菌效果。

在DPPH自由基清除試驗中，ECso值越低代表其抗氧化活性越好。由表3和圖4可知，B．megaterium（ CLXl）、L aquatilis（CLX2）、inter-media（CLX3）的乙酸乙酯提取物的濃度與清除效果的線性回歸方程分別為v= 1.44x+ 19.01（R2=0.9677）、y=17.94x+27.10（R2= 0.9903）、y=19.35x+22.98（R2= 0.9687），均呈正相關(guān)關(guān)系，其ECso值分別為21.471、1.276、1.396 mg/mL，抗氧化能力為L

aquatilis（CLX2）>Kintermedia（CLX3）>B.megaterium（CLX1），但都低于陽性對照（ECso值為0.085mg/mL）。

2.3活性成分GC-MS鑒定

3株內(nèi)生細菌的乙酸乙酯提取物中共檢測到53種揮發(fā)性成分（表4）。在B．megaterz，um（CLX1）的代謝產(chǎn)物中：酸類7種，烴類5種，酰胺類和含硫化合物各3種，醛類、肽類和酚類各2種，雜環(huán)類、酯類、酮類和含氯化合物各1種，其中苯乙酸（16.35%）、六氫-3-（苯基甲基）吡咯并（1，2-A）吡嗪-1，4-二酮（15.91%）和環(huán)（脯氨酸一亮氨酸）二肽（15.39%）含量較高。在L．a(chǎn)quatilis（CLX2）的代謝產(chǎn)物中：酯類5種，酸類3種，醇類和酮類各2種，醛類和酚類各1種，其中丙酸乙酯（0.62%）、十六烷酸（0.38%）和2，5一二叔丁基酚（0.31%）含量較高。在Kintennedia（CLX3）的代謝產(chǎn)物中：酯類6種，酸類6種，醇類4種，酚類和腈類各1種，其中2，3-丁二醇（17.83%）、新癸酸環(huán)氧乙烷基甲酯（1.22%）和十六烷酸（1.22%）含量較高。L．a(chǎn)quatilis（CLX2）和Kintermedia（CLX3）的代謝產(chǎn)物中檢測出的成分較為接近，與B．megaterium（CLX1）的代謝產(chǎn)物檢測出的成分相比，成分種類較少且差異較明顯。

3討論與結(jié)論

從藥用植物中篩選內(nèi)生細菌用于生產(chǎn)具有藥用價值的活性成分，如生物堿、聚酮類、類黃酮和類固醇萜類化合物等，已成為新藥開發(fā)生物活性化合物的重要來源之一。Chen等從越南槐內(nèi)生細菌ETR-B22中測定的三硫化二甲酯、吲哚、鄰氨基苯甲酸甲酯等揮發(fā)性有機化合物表現(xiàn)出廣譜抗真菌活性，是ETR-B22菌株抑制各種真菌病原菌的關(guān)鍵化合物：Duan等從丹參內(nèi)生細菌芽孢桿菌中分離純化的cyclo-（Ala-4-OH-Pro）和cyclo-Leu-4-OH-Pro）對腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌抑制效果明顯，其MIC值分別為100g/mL和50g/mL。

國內(nèi)外學(xué)者已對藥用植物重樓屬內(nèi)生細菌有了一定的研究：程媛媛等從華重樓中分離出一株枯草芽孢桿菌，并從中分離鑒定了對Curvularialunata （Walk.） Boed等真菌和Escherichia coli等細菌有較強抑菌效果的抑菌肽：楊正強等發(fā)現(xiàn)華重樓內(nèi)生細菌芽孢桿菌的發(fā)酵液對Phoma as-paragi Sacc、Rape Sclertiniose、Physalospora piricala等13種作物致病菌有較好的抑制效果，但二者都未測定MIC值：宣群等從滇重樓中分離出的內(nèi)生細菌對金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、普通變形桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及白色念珠菌有抑制效果，但是作者未鑒定該內(nèi)生細菌的種類。本試驗分離的芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、藤黃微球菌、蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和多耐銅綠假單胞菌有中度敏感抑制作用，且對抗卡那霉素的糞鏈球菌有較好的抑菌效果，MIC值為0.33mg/mL，并從中鑒定出二甲基三硫、甲基甲烷硫代磺酸鹽、甲基硫代磺酸甲酯、苯甲酸、環(huán)（脯氨酸一亮氨酸）二肽和正二十一烷等7種抑菌活性成分；L．a(chǎn)quatilis CLX2的次生代謝產(chǎn)物對DPPH自由基清除能力最強，ECso值為1.276mg/mL，并從中鑒定出2，3-二氫-3，5二羥基-6-甲基一4（H）-吡喃-4-酮和十六烷酸（棕櫚酸）兩種抗氧化成分，這與李燾分析的滇重樓與七葉一枝花提取物對DPPH自由基清除能力得出的ECso值分別為3.27mg/mL和1.33mg/mL的結(jié)果相比，放良重樓內(nèi)生細菌具有較好的抗氧化性能，在開發(fā)抗氧化劑方面有較大潛力，可緩解由氧化損傷引起的健康問題。

啟良重樓內(nèi)生細菌的次生代謝產(chǎn)物具有良好的抑菌活性和抗氧化性，在制藥和醫(yī)學(xué)方面有巨大的開發(fā)潛力，為開發(fā)利用放良重樓內(nèi)生細菌資源和篩選活性物質(zhì)提供了依據(jù)。