強筋小麥貯藏蛋白的積累動態(tài)、種類及相對含量分析

房春豪 韓冉 毛鳳鑫 汪曉璐 徐文競 王開 祁廣 曹新有 李豪圣 劉愛峰 劉成

關(guān)鍵詞：強筋小麥；中筋小麥；麥谷蛋白；醇溶蛋白；谷蛋白大聚合體（GMP）

小麥籽粒主要由淀粉、脂類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成。根據(jù)蛋白質(zhì)組分在不同溶劑中的溶解性，將小麥籽粒蛋白分為溶于水的清蛋白、溶于稀鹽的球蛋白、溶于70%乙醇的醇溶蛋白和溶于稀酸或稀堿的麥谷蛋白。麥谷蛋白是一種非均質(zhì)的大分子聚合體，是由多個亞基通過分子間二硫鍵相互交聯(lián)形成的多聚體，按其在SDS-PAGE中的遷移率，又分為高分子量麥谷蛋白（HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白（LMW-GS）。谷蛋白聚合體主要由HMW-GS和LMW-GS通過鏈間二硫鍵鏈接而成，其在非解離狀態(tài)下，由一系列分子量大小不同的聚合體組成。谷蛋白聚合體中，不溶于SDS的谷蛋白聚合體分子量較大，稱之為谷蛋白大聚合體（GMP），其含量反映了谷蛋白聚合體的粒度分布。研究發(fā)現(xiàn)谷蛋白大聚合體含量越高，面筋的強度和彈性越大。

小麥面粉生產(chǎn)及產(chǎn)品加工質(zhì)量的高低與籽粒蛋白質(zhì)含量及其數(shù)量密切相關(guān)。其中，醇溶蛋白和麥谷蛋白的組成、含量和比例影響著小麥面筋的品質(zhì)。麥谷蛋白決定面筋的彈性，醇溶蛋白決定面筋的黏性和延展性。麥谷蛋白和醇溶蛋白共同形成面筋并以一定的比例結(jié)合時，才共同賦予面團特有的性質(zhì)。不同小麥品種麥谷蛋白和醇溶蛋白的含量和比例不同，從而導致面團彈性和延展性的差異。近幾年發(fā)現(xiàn)一種半胱氨酸殘基含量高冗余的新型小麥籽粒蛋白Avenin-like蛋白，該類蛋白以其富含半胱氨酸（cys）殘基之特性被廣泛關(guān)注。由于半胱氨酸（cys）是形成蛋白質(zhì)二硫鍵的基礎(chǔ)，其位置及數(shù)量影響二硫鍵的形成。因此，對Avenin-like蛋白的深入研究將對分子水平小麥品質(zhì)改良具有重要意義。

濟麥229、濟麥44和濟麥22為山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所育成的小麥品種，其中濟麥229和濟麥44為優(yōu)質(zhì)強筋小麥，其高分子量麥谷蛋白亞基組合均為（1，7+8，5+10），在首屆黃淮麥區(qū)優(yōu)質(zhì)小麥鑒評會上均被評為超強筋小麥品種（全國僅4個）。濟麥22為高產(chǎn)、廣適、中筋小麥品種，其高分子量麥谷蛋白亞基組合為（7+8，4+12）。本研究以這3個小麥品種為試材，分析其籽粒發(fā)育期谷蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白聚合體的形成規(guī)律，確定影響小麥面筋品質(zhì)性狀形成的關(guān)鍵時期，了解品質(zhì)性狀形成的分子機制，并通過TMT蛋白組學分析3個小麥品種成熟籽粒貯藏蛋白的量及優(yōu)質(zhì)強筋小麥中貯藏蛋白的差異，為我國小麥品質(zhì)改良和優(yōu)質(zhì)小麥生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種濟麥229、濟麥44以及高產(chǎn)、中筋小麥品種濟麥22，由山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所小麥遺傳育種團隊育成并提供，于2018-2019年種植在山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所小麥育種試驗基地（濟南）。于小麥開花期掛牌標記開花一致的單穗200個，花后每5天取標記穗20個，取籽粒晾曬，保存?zhèn)溆?。籽粒磨制采用FOSS旋風式磨。

1.2測定指標及方法

1.2.1蛋白含量測定利用丹麥福斯1241公司生產(chǎn)的近紅外谷物分析儀測定。

1.2.2籽粒GMP含量測定

稱取250mg面粉置于50 mL離心管中，加入0.5%（W/V） SDS-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.9） 23 mL，渦旋振蕩20s，至完全分散，再用恒溫混勻儀30℃下以1000r/min攪拌5min，恒重后以11600×g離心力、30℃離心30min，棄上清液，所剩沉淀于115℃烘至絕干后稱重。烘干后的沉淀用MM400冷凍研磨儀研磨，采用杜馬斯定氮儀測定籽粒GMP含量。

1.2.3醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取及含量測定

醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取參考楊學舉的方法。取0.1g面粉樣品置人離心管中，加70%乙醇10mL，充分攪拌后振蕩20min，4000r/min離心5min，取上清，同樣方法共連續(xù)提取3次后合并上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中定容，待測醇溶蛋白。麥谷蛋白用0.5%KOH提取，方法過程與提取醇溶蛋白相同。采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4成熟籽粒不同類型貯藏蛋白量的測定3個品種成熟籽粒貯藏蛋白量的測定采用TMT蛋白測定技術(shù)．由杭州景杰生物科技股份有限公司完成。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1強筋小麥籽粒醇溶蛋白的積累動態(tài)

對3個小麥品種醇溶蛋白的含量進行分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，籽粒發(fā)育過程中其醇溶蛋白的積累動態(tài)均呈持續(xù)上升的變化趨勢?；ê?～15天，隨灌漿時間推進，籽粒醇溶蛋白含量增速較快，花后15～25天增速稍平緩，花后25～35天增速又加快。總體來看，整個籽粒灌漿期，強筋小麥濟麥44和濟麥229的醇溶蛋白含量均高于中筋小麥濟麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基類型上看，整個籽粒灌漿期，5+10亞基組合的醇溶蛋白含量均高于4+12亞基組合。

2.2強筋小麥籽粒麥谷蛋白的積累動態(tài)

對3個小麥品種麥谷蛋白的含量進行分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，籽粒發(fā)育過程中麥谷蛋白的積累動態(tài)呈上升趨勢，花后5～10天，濟麥44的麥谷蛋白含量增速較快，花后10～35天增速稍下降，但麥谷蛋白含量持續(xù)增長?；ê?～20天，濟麥229的麥谷蛋白含量增速較20～35天的增速低?？傮w來看，整個籽粒發(fā)育時期，強筋小麥濟麥44和濟麥229的麥谷蛋白含量始終高于中筋小麥濟麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基組成類型看，5+10亞基組合的麥谷蛋白含量在整個籽粒灌漿期均高于4+12亞基組合。

2.3強筋小麥籽粒GMP的積累動態(tài)

對3個小麥品種GMP含量進行分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，籽粒發(fā)育過程中強筋小麥的籽粒GMP含量呈持續(xù)上升趨勢，中筋小麥呈“下降一上升一下降一上升”趨勢。具體看，花后5～15天濟麥44籽粒GMP含量增速較快，花后15～25天增速緩慢，花后25～35天增速上升。濟麥229籽粒GMP含量的增加趨勢與濟麥44相似，但其第二次高速增加期出現(xiàn)在花后30～35天。與強筋小麥不同的是，濟麥22在小麥籽粒發(fā)育過程中，GMP含量出現(xiàn)兩次持續(xù)下降期，分別為花后5～15天和花后25～30天，兩次持續(xù)上升期在花后15～25天和花后30～35天?？傮w來看，在整個籽粒發(fā)育期間，強筋小麥濟麥44、濟麥229的GMP含量持續(xù)增加且高于濟麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基類型上看，5+10亞基組合的GMP含量在整個籽粒灌漿期持續(xù)增加，且灌漿中后期的含量均高于4+12亞基組合。

2.4強筋小麥成熟籽粒中的貯藏蛋白種類及相對含量分析

由結(jié)果（表1）可以看出，3個小麥品種共檢測到53個貯藏蛋白，分為三類，包括醇溶蛋白27個、Avenin-like蛋白16個和麥谷蛋白10個。3個小麥品種的貯藏蛋白相對含量不盡相同。53個貯藏蛋白中有18個在濟麥229中的相對含量高于濟麥22，其中醇溶蛋白P18573和P04726在濟麥229中的相對含量是濟麥22的3.58倍和4.21倍，Avenin-like蛋白AOA34IY3HO和A7XUQ5在濟麥229中的相對含量是濟麥22的9.21倍和3.18倍，麥谷蛋白P10387在濟麥229中的相對含量是濟麥22的3.87倍。53個貯藏蛋白中有33個在濟麥44中的相對含量高于濟麥22，其中Avenin-like蛋白A7XUQ5在濟麥44中的相對含量是濟麥22的3.79倍，麥谷蛋白P10387在濟麥44中的相對含量是濟麥22的4.07倍。

3討論與結(jié)論

小麥食品品質(zhì)受籽粒蛋白與面筋蛋白含量的顯著影響。籽粒貯藏蛋白在灌漿過程中逐漸積累，其積累動態(tài)表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。本研究顯示，籽粒醇溶蛋白含量和麥谷蛋白含量在籽粒灌漿期持續(xù)上升，這與前人研究結(jié)果相同。張容研究指出，5+10與2+12亞基組合的品質(zhì)差異來源從蛋白質(zhì)組分形成上看，主要是醇溶蛋白和麥谷蛋白后期的快速積累不同。本研究發(fā)現(xiàn)，濟麥44和濟麥229（5+10）的醇溶蛋白和麥谷蛋白均在花后20天之后較濟麥22（4+12）快。這與張容的研究結(jié)果相似。

谷蛋白大聚合體（GMP）是麥谷蛋白的重要組成部分，是衡量小麥加工品質(zhì)的指標之一。鄧志英等發(fā)現(xiàn)，不同筋型小麥的GMP積累動態(tài)存在顯著差異，強筋小麥花后10天便處于較高水平，成熟時GMP含量高于其它筋型小麥。本研究發(fā)現(xiàn)，籽粒灌漿過程中，強筋小麥GMP含量整體呈上升趨勢，花后5～25天累積較慢，之后快速增多，花后35天含量達到最高；而濟麥22籽粒GMP積累呈現(xiàn)“下降一上升一下降一上升”的趨勢，即花后5～15天含量逐漸降低，之后逐漸增加，花后25天又降低，花后30天始又增加。總體而言，籽粒灌漿期濟麥22的GMP含量低于2個強筋小麥品種。這與前人的研究結(jié)果相同，說明籽粒灌漿中后期是強筋小麥與濟麥22小麥GMP含量產(chǎn)生差異的關(guān)鍵時期。

鄧志英等指出，不同亞基對GMP的積累有不同影響，含5+10亞基對的品種成熟期GMP含量增幅比前期有很大提高。張容指出，5+10亞基組合的小麥品種籽粒灌漿前期GMP占籽粒蛋白質(zhì)的比例較低，20天后一直維持在較高水平至成熟，說明其GMP主要是在籽粒灌漿中后期形成。本研究發(fā)現(xiàn)，5+10亞基組合的小麥GMP含量在整個籽粒灌漿期保持增加趨勢，但濟麥44在花后25天開始增速加大，而濟麥229在花后30天增速加大。說明含有5+10亞基組合的小麥品種之間其GMP積累動態(tài)也存在少許差異。

利用TMT技術(shù)從3個小麥品種成熟籽粒中共檢測到53個貯藏蛋白，有33個在濟麥44中的相對含量高于濟麥22，有18個在濟麥229中的相對含量高于濟麥22。分析濟麥44比濟麥22含量高的貯藏蛋白發(fā)現(xiàn)，其倍數(shù)介于1.01～4.07之間，倍數(shù)超過2的有2個。濟麥229比濟麥22含量高的貯藏蛋白倍數(shù)介于1.02～9.21之間，有5個倍數(shù)超過2，且AOA34IY3HO的倍數(shù)達到9.21倍。對TMT數(shù)據(jù)和麥谷蛋白、醇溶蛋白、GMP在3個小麥成熟籽粒中的含量進行分析發(fā)現(xiàn)，濟麥44較濟麥22貯藏蛋白含量高的原因是其大多數(shù)的貯藏蛋白表達量高，而濟麥229高蛋白含量的原因是部分貯藏蛋白超高量表達。