氯化兩面針堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

朱長吉,李紅紅,沈忠軍,玄延花,嚴(yán) 莉

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 延邊133000;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科;3.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室;4.長春市中心血站)

膠質(zhì)瘤(glioma)是成人最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的70%。盡管近年采取了多項(xiàng)治療措施,包括手術(shù)治療、聯(lián)合放療和化療及生物治療等,但膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然很差,特別是惡性膠質(zhì)瘤膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma),診斷后的中位生存期僅有14.6個(gè)月[1]。惡性膠質(zhì)瘤具有快速增殖和高度侵襲性的特點(diǎn)、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、預(yù)后不良。氯化兩面針堿(nitidine chloride,NC)是植物中提取的一種生物堿,主要從蕓香科花椒的根中提取而來。有研究表明,NC在乳腺癌和肝癌等多種癌癥中具有抗癌作用,可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻斷細(xì)胞周期、阻礙血管生成及抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等機(jī)制發(fā)揮作用[2-5],然而,NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的作用尚有待闡明。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤LN18細(xì)胞(上海通派生物科技公司)。NC(四川恒誠致遠(yuǎn)生物公司),DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胎牛血清(以色列Bioind公司),二甲基亞砜(DMSO)、青霉素和鏈霉素(上海聯(lián)邁生物公司)、CCK-8試劑盒(上海尚寶生物公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)、酶標(biāo)儀(北京六一儀器廠)、倒置顯微鏡(深圳博視達(dá)光學(xué)儀器公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組LN18細(xì)胞采用含10%胎牛血清、青霉素(100U·mL-1)和鏈霉素(100 mg·L-1)的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為2組:在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入NC為處理組,只加入培養(yǎng)基為對(duì)照組。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率及計(jì)算IC50選擇NC合適濃度準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需試劑,向96孔板里加200 μl培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞密度為每孔8 000個(gè)細(xì)胞左右,待細(xì)胞貼壁后,向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度NC,使96孔板中每孔NC的濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 μM,對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日取出96孔板,每孔加入CCK-8試劑20 μl,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定每個(gè)孔的吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率=處理組A值/對(duì)照組A值×100%。IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)],重復(fù)4次,取平均值。公式中Xm:設(shè)計(jì)的最大濃度的對(duì)數(shù)值;i:各濃度倍比濃度的對(duì)數(shù)值;ΣP:各組生長抑制率之和;0.5:經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移率準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需試劑,預(yù)先在6孔板背面畫出3條距離相同的水平橫線,調(diào)整細(xì)胞密度,每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h。用1 ml的槍尖劃出3條平行線,加入PBS將細(xì)胞碎片清洗干凈后換成無血清培養(yǎng)基,用NC處理細(xì)胞后每個(gè)孔中隨機(jī)選出3個(gè)視野,拍攝0 h劃痕照片。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后拍照記錄,計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲率準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需試劑,把實(shí)驗(yàn)所需槍尖和離心管放在冰盒中預(yù)冷處理,稀釋Matrigel基質(zhì)膠,每個(gè)Transwell小室加60 μl,室溫放置8 h,固化培養(yǎng)基。接種細(xì)胞前水化基底膜。取生長良好的細(xì)胞,收集后細(xì)胞計(jì)數(shù),取離心管每管內(nèi)加200 μl含50 000細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,對(duì)照組不處理、NC組處理組加不同濃度的NC,混合均勻加入小室內(nèi),下室加含血清培養(yǎng)基 800 μl,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h。PBS清洗小室,加4%多聚甲醛固定,30 min后用0.1%結(jié)晶紫染色,再一次PBS清洗晾干。每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)視野,顯微鏡拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)數(shù)視野下的穿膜細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲率=處理組穿膜細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響及NC合適濃度的選擇結(jié)果顯示,濃度低于2.5 μM的NC處理LN18細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞存活率影響不明顯。用濃度高于2.5 μM的NC處理LN18細(xì)胞24 h和48 h,不同濃度的NC對(duì)降低細(xì)胞存活率的影響均比較明顯,隨著NC濃度的增加,細(xì)胞存活率逐漸降低,呈濃度依賴性(表1)。在作用時(shí)間48 h時(shí)IC50濃度在5.0 μM到7.5 μM之間,因此選擇5.0、7.5 μM 兩個(gè)濃度的NC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 NC對(duì)膠質(zhì)瘤LN18細(xì)胞存活率的影響

2.2 NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,NC處理后LN18細(xì)胞的劃痕距離比對(duì)照組明顯增大,細(xì)胞遷移率也明顯降低,細(xì)胞遷移率隨NC濃度的增加而降低(圖1,表2)。

圖1 NC對(duì)膠質(zhì)瘤LN18細(xì)胞劃痕距離的影響(×100)

表2 NC對(duì)膠質(zhì)瘤LN18細(xì)胞遷移率的影響

2.3 NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,NC處理后LN18細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,細(xì)胞侵襲率明顯降低,細(xì)胞侵襲率隨NC濃度的增加而降低(圖2,表3)。

圖2 NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)的影響(×200)

表3 NC對(duì)膠質(zhì)瘤LN18細(xì)胞侵襲率的影響

3 討論

本研究采用CCK-8法檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,LN細(xì)胞用不同濃度NC處理24 h和48 h后,細(xì)胞存活率呈濃度依賴性降低,說明NC能抑制LN細(xì)胞增殖。這可能與NC對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響有關(guān)。有研究表明,NC能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞周期停滯[2],NC可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在G2/M期的細(xì)胞周期停滯[6]。

本研究細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,經(jīng)不同濃度NC處理后LN18細(xì)胞的劃痕距離和細(xì)胞遷移率明顯降低,細(xì)胞侵襲率也明顯降低,說明NC能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,但NC抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制尚不清楚。高度侵襲性生長是膠質(zhì)瘤的重要特征之一,惡性膠質(zhì)瘤主要侵入周圍正常腦組織及血管周圍間隙,與正常腦組織的界限不清楚,也難以通過手術(shù)完全切除腫瘤,術(shù)后常常復(fù)發(fā),這是膠質(zhì)瘤預(yù)后不良的主要原因[7]。在侵入周圍腦組織及血管周圍間隙過程中,膠質(zhì)瘤細(xì)胞通常會(huì)發(fā)生一些行為學(xué)變化,包括獲得間質(zhì)細(xì)胞表型、降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)能力和干細(xì)胞表型等。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是惡性腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞表型、增加遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)基礎(chǔ)[8]。近年多項(xiàng)研究證明,腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠發(fā)生EMT[9-10]。有研究表明,NC能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT[11];NC可抑制骨肉瘤細(xì)胞EMT減少細(xì)胞侵襲能力[4]。在Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中,將基質(zhì)膠(Matrigel)鋪在聚碳酸酯膜上制備人工基底膜。當(dāng)腫瘤細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等蛋白酶水解類降解基質(zhì)膠后,細(xì)胞移動(dòng)到膜的下室面,通過計(jì)數(shù)膜下室面的細(xì)胞數(shù),可反映腫瘤細(xì)胞在體外的侵襲能力。一項(xiàng)研究表明,NC通過抑制MMP-2和MMP-9活性來減弱腎癌細(xì)胞細(xì)胞的侵襲力[12],NC通過降低MMP-2和MMP-9活性抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲[3]。

綜上所述,本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)NC能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,在膠質(zhì)瘤治療中具有較好的應(yīng)用前景。但把NC應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的臨床治療,還需考慮NC的臟器毒性及通過血腦屏障等問題。