大腸埃希菌臨床株QD24對(duì)黏菌素和碳青霉烯類耐藥的機(jī)制

王曉慧,賈 楠,王 笑 ,2,姜美妍,朱元祺,2*

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島266003;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部,山東 青島266071; 3.淄博市張店區(qū)人民醫(yī)院,山東 淄博266034)

新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(NDM)是最常見的碳青霉烯酶,除了氨曲南外,對(duì)幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素具有水解作用。目前,包括blaNDM-1到blaNDM-48(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene/#NDM)在內(nèi)的48個(gè)基因變體編碼NDM酶[1]。其中,blaNDM-13基因于2015年由Shrestha首次報(bào)道[2]。黏菌素是治療碳青霉烯耐藥細(xì)菌引起的感染的最后手段[3]。然而,質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1的出現(xiàn)引起了廣泛關(guān)注[4]。一旦mcr-1和blaNDM-13共存,這將威脅到碳青霉烯類耐藥菌的抗感染治療,但目前尚無(wú)同時(shí)攜帶這兩個(gè)基因的病原體的報(bào)道。因此,本文是對(duì)同時(shí)攜帶mcr-1.1和blaNDM-13耐藥基因的ST69型大腸埃希菌臨床分離株進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株大腸埃希菌臨床株QD24分離于2019年住院尿路感染患者的尿標(biāo)本。脈沖場(chǎng)凝膠電泳的分子量標(biāo)記為沙門菌H9812;儀器質(zhì)控菌株為ATCC 25922和ATCC 700603;疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53AziR為質(zhì)粒液相接合受體菌(E.coliJ53AziR)。以上菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器和試劑細(xì)菌鑒定和藥敏為VITEK 2 Compact 全自動(dòng)系統(tǒng),結(jié)果判定按照CLSI-M100-2021[5];碳青霉烯酶檢測(cè)卡為北京金山川公司生產(chǎn);凝膠成像儀和脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)系統(tǒng)為BIO-RAD公司。

1.3 S1核酸脈沖場(chǎng)凝膠電泳和Xba I脈沖場(chǎng)凝膠電泳具體操作步驟和結(jié)果解釋依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[6-7]。

1.4 液相接合試驗(yàn)大腸埃希菌臨床株QD24與E.coliJ53AziR的液相接合操作步驟參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[6]。

1.5 大腸埃希菌臨床株QD24的全基因組測(cè)序采用二代Illumina和三代Nanopore測(cè)序平臺(tái)以獲得QD24株的染色體和質(zhì)粒序列,然后利用在線軟件,如ResFinder(4.1)和PlasmidFinder(2.1)等,分析該菌株的生物學(xué)信息。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌臨床株QD24的碳青霉烯酶篩檢和藥敏結(jié)果

經(jīng)碳青霉烯酶檢測(cè)卡(北京金山川)檢測(cè),大腸埃希菌QD24株產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶。這株(QD24)菌除了對(duì)替加環(huán)素敏感外,對(duì)多黏菌素、碳青霉烯類、磷霉素、青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類和喹諾酮類等常用抗菌藥物耐藥,藥敏結(jié)果見表1。

表1 QD24株與其接合子和E.coli J53AziR的藥敏結(jié)果

2.2 大腸埃希菌臨床株QD24測(cè)序數(shù)據(jù)的分析

經(jīng)Illumina和Nanopore技術(shù)平臺(tái)獲得QD24株的染色體和攜帶的質(zhì)粒序列,經(jīng)在線軟件分析結(jié)果為:①Q(mào)D24株的多位點(diǎn)序列分型(MLST)為ST69(adk_21、fumC_35、gyrB_27、icd_6、mdh_5、purA_5和recA_4)。②該菌株攜帶了3個(gè)質(zhì)粒,依大小分別命名為pQD24-1、pQD24-2和pQD24-3。③pQD24-1屬于IncHI2型質(zhì)粒,除了攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1.1外,還攜帶多個(gè)類型的耐藥基因;pQD24-2為IncFIA/IncFIB 型雜合質(zhì)粒,攜帶了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaCTX-M-55和其他多個(gè)耐藥基因;pQD24-3屬于IncB/O/K/Z型質(zhì)粒,攜帶了碳青霉烯類耐藥基因blaNDM-13和 磷霉素耐藥基因fosA3。測(cè)序分析的詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 QD24株測(cè)序數(shù)據(jù)的生信分析結(jié)果

對(duì)Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)blaNDM-13基因的報(bào)道和/或提交該基因序列的有關(guān)信息進(jìn)行了分析。到目前為止,在已經(jīng)提交6個(gè)序列(不包括本研究)中,blaNDM-13基因有5個(gè)位于質(zhì)粒上,另外1個(gè)位于染色體上[2,8-10]。另外,在提交的序列中,僅有3個(gè)為完整的質(zhì)粒環(huán)形序列(KX094555,CP092912和MN219406)[8,10],質(zhì)粒大小分別為54 kb、88 kb和98 kb。本研究與已報(bào)道blaNDM-13基因的比較詳見表3。

表3 QD24株與提交的blaNDM-13基因序列的比較

2.3 液相接合試驗(yàn)和接合子的鑒定及藥敏結(jié)果

為探討QD24菌株攜帶的質(zhì)粒和耐藥機(jī)制,將供體菌QD24與受體菌E.coliJ53AziR進(jìn)行液相接合試驗(yàn),成功地獲得了接合子,被命名為QD24-C。QD24-C的驗(yàn)證:①藥敏表型,與QD24菌株比較,接合子QD24-C對(duì)氨曲南、多黏菌素顯示為敏感,而前者為耐藥。QD24、QD24-C和E.coliJ53AziR藥敏結(jié)果的比較詳見表1。②碳青霉烯酶檢測(cè)接合子QD24-C,提示產(chǎn)NDM酶。③ S1-PFGE顯示QD24攜帶3個(gè)質(zhì)粒,其分子大小與測(cè)序數(shù)據(jù)pQD24-1、pQD24-2和pQD24-3的結(jié)果相一致,而接合子QD24-C攜帶1個(gè)與pQD24-3大小相同的質(zhì)粒,S1-PFGE結(jié)果見圖1。④因?yàn)楣w菌和接合子都是大腸埃希菌,為了避免接合子QD24-C可能是由大腸埃希菌QD24(盡管理論上該菌對(duì)疊氮鈉敏感)丟失了質(zhì)粒而來(lái),所以將這兩個(gè)菌進(jìn)行Xba I酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖(PFGE)以檢測(cè)其同源性。依據(jù)規(guī)則[7]分析PFGE圖像,結(jié)果表明這兩菌無(wú)同源性,即QD24-C為獲得來(lái)自供體菌pQD24-3質(zhì)粒的E.coliJ53AziR,PFGE結(jié)果詳見圖2。

圖1 S1核酸酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖(S1-PFGE)

圖2 Xba I酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖(PFGE)

上述結(jié)果提示,大腸埃希菌QD24可將攜帶blaNDM-13基因的pQD24-3質(zhì)粒經(jīng)液相接合傳遞到E.coliJ53AziR。但是,攜帶多黏菌素mcr-1.1基因的pQD24-1質(zhì)粒卻不能經(jīng)液相接合進(jìn)行傳遞。

3 討論

碳青霉烯類和黏菌素是臨床治療多重耐藥革蘭氏陰性病原體感染的重要抗生素。本研究的大腸埃希菌QD24株除了對(duì)替加環(huán)素敏感外,對(duì)多黏菌素、碳青霉烯類、磷霉素、其他β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類等常用抗菌藥物耐藥,呈現(xiàn)泛耐藥表型。另外,測(cè)序分析顯示QD24株攜帶了黏菌素耐藥基因mcr-1.1、磷霉素耐藥基因fosA3、編碼產(chǎn)碳青霉烯酶的基因blaNDM-13和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M-55。此外,該菌還同時(shí)攜帶了多個(gè)耐藥相關(guān)基因,如氨基糖苷類和喹諾酮類,并且這些基因型與其耐藥表型相符合。

目前,編碼新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)有48個(gè)blaNDM基因亞型[1],包括blaNDM-1到blaNDM-48。其中,blaNDM-13基因編碼的NDM-13酶是一種與NDM-1相比具有兩種氨基酸取代(D95N和M154L)的變體,導(dǎo)致對(duì)頭孢噻肟的水解活性增加[2]。迄今為止,在5株大腸埃希菌中檢測(cè)到NDM-13基因,分離自尼泊爾(1株)[2]、中國(guó)(3株)[8]和韓國(guó)(1株)[9]的菌株。另外,最近在中國(guó)福建廈門來(lái)源的1株沙門菌(Salmonella Rissen)中,也檢測(cè)到blaNDM-13基因[10]。與上述報(bào)道不同的是,本研究的ST69型大腸埃希菌QD24株除了攜帶blaNDM-13基因外,還同時(shí)攜帶黏菌素耐藥基因mcr-1.1。

黏菌素是治療由多重耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染的最后手段之一。然而,這種抗生素的廣泛使用導(dǎo)致了黏菌素耐藥的出現(xiàn),這可能是染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)的。目前,人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腸桿菌目細(xì)菌對(duì)黏菌素的抗性可能是由于染色體機(jī)制和(或)質(zhì)粒攜帶的移動(dòng)黏菌素抗性基因(mcr)[4,11]。質(zhì)粒介導(dǎo)耐黏菌素歸因于mcr基因,包括mcr-1到mcr-10,其中mcr-1是最主要的mcr類型[11-12]。到目前為止,已經(jīng)有34種mcr-1的等位基因變異體,從mcr-1.1變體到mcr-1.34(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene/#MCR)。質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的mcr-1基因?qū)儆诓煌牟幌嗳萁M(IncI2,IncHI2,IncP,IncX4,IncFI,IncFIB),這介導(dǎo)了它們可以向不同細(xì)菌物種的水平轉(zhuǎn)移。本研究的大腸埃希菌QD24中的pQD24-3質(zhì)粒(攜帶有blaNDM-13基因)可經(jīng)液相接合傳遞到受體菌E.coli J53AziR,但攜帶mcr-1.1基因的pQD24-1質(zhì)粒卻不能經(jīng)液相接合傳遞(該質(zhì)粒屬于IncHI2不相容組),這提示QD24菌株對(duì)黏菌素和碳青霉烯類抗生素的耐藥可能是由于該菌攜帶了mcr-1.1基因并獲得了一個(gè)外源性攜帶blaNDM-13基因的質(zhì)粒pQD24-3,但這需進(jìn)一步研究。

質(zhì)粒介導(dǎo)的耐黏菌素mcr基因的不同亞型(mcr-1到mcr-10)或亞型的等位基因變異體(從mcr-1.1到mcr-1.34)與編碼新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶的blaNDM基因的不同亞型(blaNDM-1到blaNDM-48)可以共存于引起人體感染的同一個(gè)病原體[1]。除了感染病原體外,也可以從食物來(lái)源的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)耐藥基因的共存,如,Wang 等于2022年報(bào)道從肉食分離的大腸埃希菌中檢測(cè)到mcr-1 和blaNDM-5 基因[13]。另外,有研究發(fā)現(xiàn)人體定植菌可同時(shí)攜帶這兩個(gè)耐藥基因,如Liang 等從人體腸道中分離到攜帶NDM-9 和 mcr-1基因的ST1011型大腸埃希菌[14]。以上表明,耐黏菌素mcr基因與碳青霉烯類耐藥blaNDM基因共表達(dá)的細(xì)菌已經(jīng)在環(huán)境、食品和人體以及動(dòng)物中分布。然而,經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,同時(shí)攜帶mcr-1.1和blaNDM-13耐藥基因的細(xì)菌尚未見報(bào)道。

綜上所述,本研究的ST69型大腸埃希菌QD24臨床株對(duì)黏菌素和碳青霉烯類耐藥是因?yàn)樵摼瑫r(shí)攜帶了mcr-1.1和blaNDM-13耐藥基因,并且這兩個(gè)基因位于不同的質(zhì)粒上。