連作年限影響芹菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能類群*

劉 素, 吳宏亮**，陳 倬，馮海萍，張海宇，康建宏

連作年限影響芹菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能類群*

劉 素1, 吳宏亮1**，陳 倬1，馮海萍2，張海宇1，康建宏1

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所，銀川 750000）

芹菜是寧夏冷涼區(qū)特色蔬菜，大規(guī)模種植不可避免地導(dǎo)致連作障礙。為了揭示芹菜根際土壤微生物的多樣性特征和群落結(jié)構(gòu)隨種植年限變化的差異，本研究采用Illumina Novaseq?PE250測(cè)序平臺(tái)對(duì)芹菜種植一年（CA）、連作兩年（CB）和連作三年（CC）時(shí)根際土樣的16S V3V4區(qū)和ITS1區(qū)進(jìn)行雙末端Paired-end測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，土壤細(xì)菌多樣性隨連作年限延長(zhǎng)呈逐漸降低趨勢(shì)，Chao 1指數(shù)第一年8509.41，第三年降低至6314.09。CA香農(nóng)指數(shù)最高，為11.48，CC最低，僅11.08。隨著連作年限的增加，土壤細(xì)菌中的δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）和芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）等優(yōu)勢(shì)菌綱及其中的羅庫(kù)菌屬（）、芽球菌屬（）、紅桿菌屬（）等有益菌豐度減少。土壤真菌的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)等均隨連作年限增加呈先下降后上升趨勢(shì)，表現(xiàn)為CA、CB的Chao 1指數(shù)分別為505.44和264.66，而CC為443.92，CA、CB的香農(nóng)指數(shù)分別為5.98和4.93，而CC為5.61，且連作年限間均存在顯著差異。同時(shí)，土壤真菌中的糞殼菌綱（Sordariomycetes）和瓶毛殼屬（）、黑孢殼屬（）等優(yōu)勢(shì)菌綱屬具有顯著變化差異。微生物主坐標(biāo)成分分析結(jié)果表明，CC與其他處理間存在強(qiáng)異質(zhì)性。PICRUSt2功能預(yù)測(cè)分析表明，芹菜根際土壤細(xì)菌主要有7大類一級(jí)功能層，氨基酸生物合成相對(duì)豐度占比最高，真菌有5大類一級(jí)功能層，核苷和核苷酸生物合成相對(duì)豐度占比最高，同時(shí)芹菜連作不同年限時(shí)多條代謝通路間具有極顯著差異。綜上研究結(jié)果，芹菜連作會(huì)降低根際土壤菌群的豐富度及多樣性，改變菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致根際微生態(tài)環(huán)境失衡，從而引發(fā)相關(guān)連作障礙病害。其中，以芹菜連作三年時(shí)微生物各項(xiàng)指數(shù)變幅最大，故建議寧夏南部山區(qū)芹菜產(chǎn)業(yè)將連作不超過(guò)兩年作為田間種植模式。

芹菜；連作年限；根際土壤微生物；高通量測(cè)序；PICRUSt2功能預(yù)測(cè)

芹菜（L.）為傘形科植物[1?2]，富含大量芹菜素[3]，是一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高營(yíng)養(yǎng)的蔬菜，但芹菜不耐連作。寧夏西吉縣地處海拔1688-2633m，為典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候，海拔高、晝夜溫差大、氣候冷涼、光熱資源豐富，為當(dāng)?shù)厍鄄水a(chǎn)業(yè)的發(fā)展創(chuàng)造了有利條件[4]，素來(lái)具有“中國(guó)西芹之鄉(xiāng)”美稱。但由于當(dāng)?shù)馗孛娣e的有限，加之種植條件的制約及經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)等因素，致使芹菜連作成為農(nóng)戶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常采用的種植方式。而長(zhǎng)期連作會(huì)引發(fā)作物嚴(yán)重的病害問(wèn)題，如根莖腐病、放線蟲害等，使其品質(zhì)及產(chǎn)量顯著下降，嚴(yán)重影響寧夏南部山區(qū)芹菜產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

根際土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[5]，與土壤環(huán)境中的能量流動(dòng)及物質(zhì)轉(zhuǎn)化息息相關(guān)，并參與到許多重要的生化反應(yīng)中[6]。而連作會(huì)對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成破壞，抑制有益生物的存活，同時(shí)促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)，加劇土傳病害的發(fā)生，進(jìn)而對(duì)作物的生長(zhǎng)造成影響，導(dǎo)致減產(chǎn)[7]。高葦?shù)萚8]研究表明，芹菜連作后形成的根腐病會(huì)嚴(yán)重影響土壤真菌、細(xì)菌的種類和數(shù)量。鄭立偉等[9]認(rèn)為，甜瓜連作年限的增加致使土壤細(xì)菌多樣性降低，細(xì)菌中多數(shù)優(yōu)勢(shì)菌門的有益菌豐度減少，土壤真菌的豐度增加。岳思君等[9]通過(guò)冗余分析表明，引起硒砂瓜連作障礙發(fā)生的主要原因是隨著連作時(shí)間的增加，放線菌門、變形菌門等有益微生物豐度下降，而與土壤理化性質(zhì)變化呈不顯著關(guān)系?？傊B作種植在一定程度上會(huì)引起土壤微生物多樣性的改變，但有關(guān)芹菜連作對(duì)微生物多樣性影響尚缺乏系統(tǒng)研究，特別是對(duì)不同連作年限的芹菜種植土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)分析未見(jiàn)報(bào)道。因此，從土壤根際微生物菌群的群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與功能多樣性的微生態(tài)系統(tǒng)角度研究連作障礙，對(duì)作物生產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義[10]。本研究通過(guò)Illumina Novaseq-PE250高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)芹菜連作不同年限時(shí)的根際土壤菌群結(jié)構(gòu)與多樣性進(jìn)行分析，旨在探明芹菜連作時(shí)根際土壤微生物群落變化情況，以期為探究造成芹菜連作障礙的核心病菌提供土壤環(huán)境微生物生態(tài)層次的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣收集

樣品于2020年8月中旬，在寧夏回族自治區(qū)固原市西吉縣隆堡村（N 35°81′E106°11′）不同種植年限芹菜地芹菜收獲期采集，分別命名為芹菜一年根際土壤（用CA表示）；芹菜連作兩年根際土壤（用CB表示）；芹菜連作三年根際土壤（用CC表示）。選擇采樣單元相對(duì)中心位置的典型地塊用五點(diǎn)取樣法收集樣品，用鏟子去除地表植被和其他雜質(zhì)，在地面距根部5cm處挖出植株，再使用抖落法去除未富集根系土壤，將主根與毛根附著發(fā)達(dá)區(qū)域300～500g土壤作為根際土壤。五處根際土壤充分混勻后，挑出根系、秸稈、石塊和蟲體等雜物，在田間用四分法棄去多余部分，最后每個(gè)處理保留1kg左右，裝入17cm×25cm自封袋，掛好內(nèi)外標(biāo)簽，置入簡(jiǎn)易冷藏箱進(jìn)行冷藏，隨后將樣品凍存于-80℃?zhèn)溆?，?zhǔn)備送樣檢測(cè)，每組樣品設(shè)4個(gè)重復(fù)，樣品測(cè)序與分析委托上海某公司完成。

1.2 觀測(cè)項(xiàng)目及分析

1.2.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

使用OMEGA Soil DNA Kit試劑盒通過(guò)間接法提取樣品根際土壤中的宏基因組DNA，再將土壤樣品中的DNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行分子大小判斷，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。選擇用于細(xì)菌鑒定的16S rRNA V3V4區(qū)引物，真菌鑒定的ITS 1區(qū)引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)且檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的制備，最后將合格文庫(kù)在Novaseq-PE250測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 分析流程

（1）對(duì)高通量測(cè)序的原始下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進(jìn)行初步篩查，對(duì)問(wèn)題樣本進(jìn)行重測(cè)、補(bǔ)測(cè)。

（2）通過(guò)質(zhì)量初篩的原始序列按照index和Barcode信息，進(jìn)行文庫(kù)和樣本劃分，并去除barcode序列。

（3）按照QIIME2 dada2[11?12]分析流程進(jìn)行OTU聚類。

（4）對(duì)各樣本（組）在不同物種分類學(xué)水平的具體組成進(jìn)行展示，了解整體概況。

（5）在ASV/OTU層面，計(jì)算各樣本的距離矩陣，并通過(guò)多種非監(jiān)督的排序、聚類手段，結(jié)合相應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法，衡量不同樣本（組）間的Beta多樣性差異及差異顯著性。

（6）在物種分類學(xué)組成層面，通過(guò)各種非監(jiān)督、監(jiān)督的排序、聚類和建模手段，結(jié)合相應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法，進(jìn)一步衡量不同樣本（組）間的物種豐度組成差異，并嘗試尋找標(biāo)志物種。

（7）根據(jù)16S rRNA和ITS基因測(cè)序結(jié)果，做預(yù)測(cè)樣本的PICRUSt2功能預(yù)測(cè)分析[13]菌群代謝功能。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，處理間差異顯著性檢驗(yàn)使用鄧肯法（Duncan，P<0.05）。微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析圖和功能預(yù)測(cè)圖形使用QIIME2 軟件和R語(yǔ)言繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作年限對(duì)芹菜根區(qū)土壤微生物群落多樣性指數(shù)的影響

不同連作年限田間芹菜根區(qū)土壤樣品的細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)觀測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。由表可見(jiàn)，Good’s coverage覆蓋率為95%以上，即該土壤深度已經(jīng)基本覆蓋樣品中所有的物種。對(duì)3個(gè)不同連作年限土壤的細(xì)菌α多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)，隨著連作時(shí)間延長(zhǎng)，土壤的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Pielou’s evenness指數(shù)均有一定程度的降低。同時(shí)，CC處理與CA和CB處理的土壤中均呈現(xiàn)指標(biāo)間顯著差異，說(shuō)明土壤進(jìn)行芹菜的多年連續(xù)種植會(huì)降低其作物根際土壤細(xì)菌群落的豐富度及多樣性。

真菌群落α多樣性指數(shù)結(jié)果表明（表1），各樣品文庫(kù)的覆蓋率為100%，觀測(cè)到樣品中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率很低。各處理多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）、豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)）和均勻度指數(shù)（Pielou’s evenness指數(shù)）變化趨勢(shì)一致，均隨連作年限增加呈下降后再回升的趨勢(shì)，組間呈現(xiàn)顯著性差異。其中CA數(shù)值最高，分別為505.44、5.98和0.6671，CB數(shù)值最低，分別為264.66、4.93和0.6131，說(shuō)明芹菜的種植年限也會(huì)影響其根部土壤真菌菌群群落，連作年限不同，多樣性、豐富度和均勻度不同。

2.2 連作年限對(duì)芹菜根區(qū)土壤細(xì)菌群落的影響

2.2.1 群落組成及豐度分析

選取豐度排名前8的物種，生成柱形圖。由圖1可見(jiàn)，主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌綱γ-變形菌綱（Gammaproteo- bacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）和擬桿菌綱（Bacteroidia）的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)一致，由高到低排序?yàn)镃C＞CB＞CA。其中，CC土壤中的上述4個(gè)菌綱豐度較CA的增幅分別為71.07%、44.40%、67.52%和182.52%。δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、Subgroup_6菌綱、芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）和嗜熱性菌綱（Thermoleophilia）的相對(duì)豐度隨連作年限增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表1 三種連作處理芹菜根際土壤樣品中微生物多樣性指數(shù)比較（平均值±均方差）

注：CA為芹菜種植一年根際土壤，前茬是休閑土壤，CB為芹菜連作兩年根際土壤，CC為芹菜連作三年根際土壤。小寫字母表示處理間在0.05水平上的差異顯著性。下同。

Note: CA is the rhizosphere soil for celery planting for one year, which previous crop is the fallow soil, CB is the rhizosphere soil for celery continuous cropping for two years, and CC is the rhizosphere soil for celery continuous cropping for three years. The lower case letters indicate the significant difference between treatments at 0.05 level. The same as below.

選取屬水平排名前 35 的屬進(jìn)行聚類分析，繪制熱圖。由圖2可見(jiàn)，在CA處理中，細(xì)菌相對(duì)豐度占主要優(yōu)勢(shì)的（相對(duì)豐度＞1%）有羅庫(kù)菌屬（）、菌屬、芽球菌屬（）、菌屬和紅桿菌屬（）共5個(gè)屬。在CB處理中，纖維弧菌屬（）和溶桿菌屬（）兩種菌屬的相對(duì)豐度相較CA的土壤有明顯升高。而CC處理中，以上各屬的相對(duì)豐度明顯降低，而黃桿菌屬（）、菌屬、假單胞菌屬（）、異根瘤菌屬-新根瘤菌屬-副根瘤菌屬-根瘤菌屬（）、砂單胞菌屬（）、氣微菌屬（）和類諾卡氏菌屬（）的豐度較高。以上結(jié)果說(shuō)明，芹菜連作不同年限時(shí)土壤根際菌群在屬分類水平上存在顯著差異。

圖1 三種連作處理中芹菜根際土壤樣品在細(xì)菌綱水平上的組成和相對(duì)豐度

圖2 三種連作處理中芹菜根際土壤樣品在細(xì)菌屬水平上的物種豐度聚類熱圖

圖3表明，PCo1和PCo2能解釋3組樣品中64.5%的樣品信息。其中，CA和CB分布在PCo1負(fù)值區(qū)域，說(shuō)明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，CC分布在正值區(qū)域，距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明相似性較低且組間差異大于組內(nèi)差異，進(jìn)一步表明芹菜連作不同年限時(shí)其根際土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

2.2.2 PICRUSt2細(xì)菌菌群功能預(yù)測(cè)分析

2.2.2.1 代謝通路統(tǒng)計(jì)

基于MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)芹菜連作土壤進(jìn)行細(xì)菌菌群功能預(yù)測(cè)分析（圖4），結(jié)果表明，第一層次代謝通路共有7大類，每一類代謝通路又被進(jìn)一步劃分為多個(gè)等級(jí)。在芹菜根際土壤細(xì)菌的一級(jí)功能層中，生物合成為其主要組成。同時(shí)預(yù)測(cè)基因的第二層次代謝通路分析結(jié)果表明細(xì)菌菌群在多方面具有功能潛能，但只有在9種生物合成方面其相對(duì)豐度大于18000，占比最高的為氨基酸生物合成。

圖3 三種連作處理中芹菜根際土壤樣品細(xì)菌群落組成主坐標(biāo)分析

圖4 基于MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)芹菜根際土壤不同細(xì)菌菌群PICRUSt2功能預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2.2.2 代謝通路差異分析

在獲得代謝通路的豐度數(shù)據(jù)后，對(duì)CA與CB、CB與CC、CA與CC分別進(jìn)行組間代謝通路差異分析。在CA和CB中，以CA為對(duì)照組，CB為上調(diào)組，圖5a顯示，CB相對(duì)CA有34條代謝通路上調(diào)，其中25條通路之間具有極顯著差異（P＜0.001），分別是PWY-6565通路superpathway of polyamine biosynthesis III和ECASYN-PWY通路enterobacterial common antigen biosynthesis等。在CB和CC中（圖5b），以CB為對(duì)照組、CC為上調(diào)組進(jìn)行代謝通路的差異性分析，結(jié)果表明，CC相對(duì)CB有24條通路上調(diào)，26條通路下調(diào)，其中38條通路之間呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.001），分別是PWY-7385通路1,3-propanediol biosynthesis（engineered）和PWY- 7198通路pyrimidine deoxyribonucleotides de novo biosynthesis IV等。在CA和CC中（圖5c），CA為對(duì)照組，CC為上調(diào)組，結(jié)果表明，CC相對(duì)CA有27條通路上調(diào)，23條通路下調(diào)，其中37條通路之間呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.001），分別是PWY-5499通路Pvitamin B6 degradation和PWY-7209通路superpathway of pyrimidine ribonucleosides degradation等。結(jié)果說(shuō)明芹菜的連作年限對(duì)土壤微生物代謝有十分重要的影響，連作年限越長(zhǎng)通路上下調(diào)變化越明顯，通路之間差異越顯著。

圖5 CA與CB(a)、CB與CC(b)以及CA與CC(c)處理中土壤細(xì)菌菌群代謝通路的差異分析

注：logFC[log2(fold change)]為正值代表上調(diào)組相對(duì)對(duì)照組上調(diào)，負(fù)值為下調(diào)。下同。

Note: A positive value of logFC[log2(fold change)] represents upregulation in the upregulation group relative to the control group, and a negative value is downregulation. The same as below.

2.3 連作年限對(duì)芹菜根區(qū)土壤真菌群落的影響

2.3.1 群落組成及豐度分析

選取豐度排名前8的物種，生成柱形圖。由圖6可見(jiàn)，主要真菌優(yōu)勢(shì)菌綱糞殼菌綱（Sordariomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、盤菌綱（Pezizomycetes）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）和傘菌綱（Agaricomycetes）的相對(duì)豐度在三組樣本中均呈先下降后上升趨勢(shì)，由大到小排序?yàn)镃C＞CA＞CB。其中，糞殼菌綱（Sordariomycetes）具有顯著變化差異，相對(duì)豐度分別為55.56%、51.98%和44.52%。座囊菌綱（Dothideomycetes）和被孢霉綱（Mortierellomycetes）的變化趨勢(shì)一致，由高到低分別為CA＞CB＞CC。其中，座囊菌綱（Dothideom- ycetes）的相對(duì)豐度百分比依次為15.56%、13.31%和10.72%。

選取屬水平排名前20的屬進(jìn)行聚類，繪制熱圖。由圖7可見(jiàn)，CA土壤中，前20中相對(duì)豐度大于1% 的有7個(gè)屬，分別為菌屬、刺毛四枝孢菌屬（）、彎孢菌屬（）、炭疽菌屬（）、被孢霉菌屬（）、赤霉菌屬（）和zyma菌屬。CB中以上菌屬的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，而鏈格孢菌屬（）的相對(duì)豐度大于1%。CC中6個(gè)屬的相對(duì)豐度與CA和CB差異顯著，分別為瓶毛殼屬（）、黑孢殼屬（）、木拉克酵母屬（）、絲殼屬（）、假裸囊菌屬（）和土赤殼屬（）。

圖8表明，PCo1和PCo2能解釋3組樣品82.3%的菌群多樣性。其中，CA主要分布于PCo1的負(fù)端區(qū)域，CB分布于PCo1的0值附近，CC位于PCo1的正端區(qū)域，3個(gè)樣品組間相似性較小，差異顯著，說(shuō)明芹菜連作后根際土壤真菌群落譜系間發(fā)生了改變。

2.3.2 PICRUSt2真菌菌群功能預(yù)測(cè)分析

2.3.2.1 代謝通路統(tǒng)計(jì)

基于MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)分析見(jiàn)圖9。由圖可見(jiàn)，芹菜根際土壤真菌菌群的一級(jí)功能層包括5大類，其中生物合成、前體代謝和能量生成功能層的真菌菌群相對(duì)豐度較高。在第二層次代謝通路中，9種生物合成方面和2種前體代謝和能量生成方面真菌菌群的相對(duì)豐度大于3000，其中，占比最高的為核苷和核苷酸生物合成。

圖6 三種連作處理中芹菜根際土壤樣品在真菌綱水平上的組成和相對(duì)豐度

圖7 三種連作處理芹菜根際土壤樣品在真菌屬水平的物種豐度聚類熱圖

2.3.2.2 代謝通路差異分析

代謝通路差異分析可以找出組間具有顯著差異的代謝通路（圖10）。在CA和CB的土壤樣品中（圖10a），以CA為對(duì)照組，CB為上調(diào)組，結(jié)果顯示，CB相對(duì)CA有6條代謝通路上調(diào)，10條通路下調(diào)，其中4條通路之間具有極顯著差異（P＜0.001），下調(diào)通路中PWY-7409通路phospholipid remodeling和P221-PWY通路octane oxidation等變化幅度較大。CB和CC中（圖10b）以CB為對(duì)照組、CC為上調(diào)組進(jìn)行代謝通路的差異性分析，結(jié)果表明，CC相對(duì)CB有4條通路上調(diào)，14條通路下調(diào)，其中9條通路之間呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.001），上調(diào)通路中P221-PWY通路octane oxidation和SO4ASSIM- PWY通路sulfate reduction I （assimilatory）等具較大變幅。在CA和CC的土壤樣品中（圖10c），CA為對(duì)照組，CC為上調(diào)組，結(jié)果表明，CC相對(duì)CA有14條通路均下調(diào)，其中3條通路之間呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.001），分別是PWY4FS-8通路phosphatidylglycerol biosynthesis II （non-plastidic）和PWY4FS-7通路phosphatidylglycerol biosynthesis I （plastidic）等。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明芹菜的連作年限對(duì)其微生物代謝有十分重要的影響，連作年限越長(zhǎng)通路上下調(diào)變化越明顯，通路之間差異越顯著。

圖10 CA與CB(a)、CB與CC(b)以及CA與CC(c)處理中土壤真菌菌群代謝通路的差異分析

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究采用Illumina平臺(tái)對(duì)群落DNA片段進(jìn)行雙端（Paired-end）測(cè)序，通過(guò)將16S rRNA的V3?V4區(qū)和ITS V1區(qū)測(cè)序，結(jié)果表明，序列覆蓋率在95%及以上的測(cè)序結(jié)果可以確切反映土壤環(huán)境中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

根際土壤是植物能量和物質(zhì)代謝最活躍的部位之一[14]，該微環(huán)境代表了植物-微生物和微生物-微生物相互作用的主要生態(tài)位，其中細(xì)菌在根際土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要角色，對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)至關(guān)重要[15?16]。例如能直接參與土壤微生態(tài)物質(zhì)循環(huán)和能量交換過(guò)程的固氮菌和纖維素分解菌，其分別在土壤氮元素循環(huán)和碳元素循環(huán)中起到重大作用[17?18]，能將亞硝酸根氧化成硝酸根離子的硝化細(xì)菌，是幫助作物特別是旱作物順利吸收利用所需氮素的主要細(xì)菌類群[19]，能作為生防菌的芽孢桿菌[20]、假單胞桿菌[21]和巴氏桿菌[22]，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用和拮抗作用誘導(dǎo)作物抗性并促進(jìn)作物生長(zhǎng)，間接提高作物抗性等一種或多種聯(lián)合機(jī)制來(lái)抑制引起植物病害的某些病原菌的存活和活動(dòng)[23?24]。因此，土壤菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)改善土壤質(zhì)量和作物健康起著決定性的作用。

本研究通過(guò)對(duì)不同年限連作的芹菜根際土壤細(xì)菌進(jìn)行比較分析，探究作物不同種植年限與其根際土壤菌群結(jié)構(gòu)及多樣性之間的關(guān)系。結(jié)果表明，芹菜連作兩年時(shí)，纖維素分解性細(xì)菌的纖維弧菌屬（）相對(duì)豐度有所增加，它是具有解磷、固氮等促生功能的有益內(nèi)生菌屬[25]。同時(shí)黃單胞科的溶桿菌屬（）也比一年生芹菜的溶桿菌屬相對(duì)豐度較高，該菌是一種重要的生防革蘭氏陰性細(xì)菌，能產(chǎn)生多種胞外水解酶，包括幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶，以及小分子次生抗菌代謝產(chǎn)物，對(duì)植物病原真菌、卵菌和陽(yáng)性細(xì)菌均有較好的抗菌活性[26]。而在芹菜連作三年的根際土壤中，以上兩種有益細(xì)菌菌屬豐度反而降低，且己科河菌門的病原菌屬豐度急劇減少，黃桿菌門的屬相對(duì)豐度增加。有研究報(bào)道，羅庫(kù)細(xì)菌可以構(gòu)成一種單物理、植物水平譜系，對(duì)廣泛的化學(xué)刺激做出反應(yīng)，同時(shí)編碼多種碳傳遞蛋白，包括專門生產(chǎn)脂質(zhì)、肽和糖的蛋白質(zhì)[27]，而黃桿菌屬為條件致病菌，在高鹽堿土壤中會(huì)明顯增多，與作物連作模式中植物病害的發(fā)生率升高呈顯著相關(guān)性[28?29]。這一結(jié)果說(shuō)明，芹菜種植連作年限越長(zhǎng)，其根際土壤中原有的（具有潛在的纖維素降解功能[30]）（根際促生菌[31]）等功能性細(xì)菌量都會(huì)持續(xù)下降，對(duì)土壤環(huán)境中的土壤營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)、植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用產(chǎn)生一定負(fù)面作用，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，降低作物產(chǎn)量與抗病能力。

對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化分析發(fā)現(xiàn)，芹菜連作三年時(shí)，瓶毛殼菌屬（s）、黑孢殼屬（）、木拉克酵母菌屬（） 、絲殼菌屬（）、假裸囊菌屬（）和土赤殼菌屬（）的相對(duì)豐度急劇增加。其中，F(xiàn)arag Mf[32]通過(guò)真菌的形態(tài)學(xué)特征、病癥癥狀和致病性試驗(yàn)，將確定為番茄粉紅色根腐病的致病因子。同時(shí)，張進(jìn)強(qiáng)等[33]對(duì)天麻連作土壤研究表明，的豐富度與天麻土傳真菌病害發(fā)生率呈顯著正相關(guān)。當(dāng)?shù)厍鄄诉B作障礙主要表現(xiàn)為易感染根腐病，有可能是因?yàn)橐院阪邭俸屯脸鄽僬婢鸀橹?，其他侵襲性真菌為輔過(guò)多積累導(dǎo)致，但本試驗(yàn)結(jié)果還需在田間進(jìn)一步驗(yàn)證，以具體明確影響連作植物生長(zhǎng)的微生物種群，為連作土壤微生物菌群的定向改造提供更加充分的理論依據(jù)。

PICRUSt2軟件是基于PICRUSt軟件升級(jí)后的細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)平臺(tái)，在土壤微生物群落功能預(yù)測(cè)方面多見(jiàn)應(yīng)用[34]，它可以適配OTU序列或ASV序列和豐度數(shù)據(jù)，將微生物的變化情況和生物功能聯(lián)系起來(lái)[35]。王峰等[36]通過(guò)對(duì)茶園土壤細(xì)菌群落進(jìn)行PICRUSt2功能預(yù)測(cè)，得出其在代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息方面功能活躍。呂錫斌等[37]運(yùn)用PICRUSt2預(yù)測(cè)軟件分析得出，赤水河流域微生物群落的功能主要涉及代謝等46個(gè)子功能。本研究通過(guò)將芹菜根際土壤的16S rRNA序列和ITS序列進(jìn)行PICRUSt2功能預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌共涉及7個(gè)主代謝通路，真菌共涉及5個(gè)主代謝通路，其子通路均表現(xiàn)出功能上的豐富性，同時(shí)通路之間也表現(xiàn)出極顯著差異。但鑒于PICRUSt2功能預(yù)測(cè)分析具有一定的局限性，所以后續(xù)研究需要結(jié)合宏基因組測(cè)序等技術(shù)進(jìn)一步分析。

3.2 結(jié)論

芹菜連作時(shí)其根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性之間存在顯著差異。連作年限增加，益生菌比例緩慢下降，致病病原菌比例呈先下降后急劇增長(zhǎng)趨勢(shì)，此微生物群落結(jié)構(gòu)的變化不利于作物的生長(zhǎng)發(fā)育，最終導(dǎo)致芹菜出現(xiàn)嚴(yán)重的連作問(wèn)題。因此，本研究認(rèn)為芹菜連作兩年是寧夏南部山區(qū)較好的田間種植方式，其連作障礙問(wèn)題可能是因?yàn)檫B作兩年后，根際土壤部分致病真菌菌群如黑孢殼屬、土赤殼屬真菌豐度急劇增加、結(jié)構(gòu)劇烈變化引起。

[1] 汪勁武.傘形科植物觀(上)[J].植物雜志, 1989(6):22-24.

Wang J W.Apiaceae plant view(Part I)[J].Chinese Journal of Botany,1989(6):22-24.(in Chinese)

[2] 汪勁武.傘形科植物觀(下)[J].植物雜志, 1990(1):30-32.

Wang J W.Apiaceae plant view (Part II)[J].Chinese Journal of Botany, 1990(1):30-32.(in Chinese)

[3] 李榮華,夏薇,吳坤.蔬菜中芹菜素高效液相色譜測(cè)定[J].中國(guó)公共衛(wèi)生, 2007(7):894-895.

Li R H,Xia W,Wu K.Determination of apigenin in vegetables by high performance liquid chromatography[J]. Chinese Journal of Public Health,2007(7):894-895.(in Chinese)

[4] 陳麗生.西吉縣特色冷涼蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀分析[J].新農(nóng)業(yè),2019(15):84-85.

Chen L S.Analysis of the current situation of the development of special cold vegetable industry in Xiji county[J].New Agriculture,2019(15):84-85.(in Chinese)

[5] Yang R P,Mo Y L,Liu C M,et al.The effects of cattle manure and garlic rotation on soil under continuous cropping of watermelon(L)[J].PloS One, 2016,11(6):e0156515.

[6] Li W,Liu Q,Chen P.Effect of long-term continuous cropping of strawberry on soil bacterial community structure and diversity[J].Journal of Integrative Agriculture, 2018,17(11):2570-2582.

[7] Dong L,Xu J,Feng G,et al.Soil bacterial and fungal community dynamics in relation todeath rate in a continuous cropping system[J].Scientific Reports,2016,6(1):31802.

[8] 高葦,吳峰,王勇,等.棉隆與生物有機(jī)肥協(xié)同防治芹菜根腐病及其對(duì)根際土壤微生物數(shù)量的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2018,34(2):65-68.

Gao W,Wu F,Wang Y,et al.Synergetic effect of dazomet and biological fertilizer on celery root rot and soil rhizosphere microorganisms[J].Chinese Agricultural Science Bulletin, 2018,34(2):65-68.(in Chinese)

[9] 鄭立偉,趙陽(yáng)陽(yáng),王一冰,等.不同連作年限甜瓜種植土壤性質(zhì)和微生物多樣性[J].微生物學(xué)通報(bào),2022,49(1):101- 114.

Zheng L W,Zhao Y Y,Wang Y B,et al.Soil properties and microbial diversity in the muskmelon fields after continuous cropping for different years[J].Microbiology China, 2022, 49(1):101-114.(in Chinese)

[10] 岳思君,馮翠娥,楊彥研,等.不同連作年限硒砂瓜土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2020,38(1):230- 236.

Yue S J,Feng C E,Yang Y Y,et al.Analysis of microbial community structure and diversity in selenium-sand melon soil under different continuous cropping years[J].Agricultural Research in the Arid Areas, 2020,38(1):230-236.(in Chinese)

[11] Callahan B J,Mcmurdie P J,Rosen M J,et al.DADA2:High resolution sample inference from Illumina amplicon data[J]. Nature Methods,2016,13(7):581-583.

[12] Bokulich N A,Kaehler B D,Ram R J,et al.Optimizing taxonomic classification of marker-gene amplicon sequences with QIIME 2's q2-feature-classifier plugin[J]. Microbiome, 2018,6(1):90.

[13] Gavin M D,Vincent J M,Jesse R Z,et al.PICRUSt2 for prediction of metagenome functions[J].Nature Biotechnology: the Science and Business of Biotechnology,2020,38(6): 685-688.

[14] 李夢(mèng)潔,李占彪,周思含,等.植物根際微生物調(diào)控根系構(gòu)型研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象, 2021,42(11):895-904.

Li M J,Li Z B,Zhou S H,et al.Advances in the root system architecture regulated by plant rhizosphere microorganisms[J]. Chinese Journal of Agrometeorology,2021,42(11):895-904. (in Chinese)

[15] Wang X,Feng H,Wang Y,et al.Mycorrhizal symbiosis modulates the rhizosphere microbiota to promote rhizobia- legume symbiosis[J].Molecular Plant,2021,14(3):503-516.

[16] 岳衡,李閃閃,段雅欣,等.深松耕對(duì)寧南山區(qū)馬鈴薯田土壤細(xì)菌多樣性的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,2021,42 (12):998- 1008.

Yue H,Li S S,Duan Y X,et al.Effect of subsoil plowing on soil bacterial diversity in potato fields in mountainous areas of southern Ningxia[J].Chinese Journal of Agrometeorology, 2021,42(12):998-1008.(in Chinese)

[17] 劉亞軍,馬琨,李越,等.馬鈴薯間作栽培對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào), 2018,32(6):1186- 1194.

Liu Y J,Ma K,Li Y,et al.Effect of different Intercropping cultivation patterns of potato on the structure and function of soil microorganism community[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2018,32(6):1186-1194.(in Chinese)

[18] 殷繼忠,李亮,接偉光,等.連作對(duì)大豆根際土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響[J].生物技術(shù)通報(bào), 2018,34(1):230-238.

Yin J Z,Li L,Jie W G,et al.Effects of continuous cropping on bacterial flora structure in soybean rhizosphere soil[J]. Biotechnology Bulletin, 2018,34(1):230-238.(in Chinese)

[19] 張星,林煒鐵,朱雅楠.硝化細(xì)菌中亞硝酸鹽氧化還原酶的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào), 2008,35(11):1806-1810.

Zhang X,Lin W T,Zhu Y N.Research progress of nitrite oxidoreductase in nitrobacteria[J].Microbiology China,2008, 35(11):1806-1810.(in Chinese)

[20] 王蕊,王騰,李二峰.生防芽孢桿菌在植物病害領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2021,28(4):71-77.

Wang R,Wang T,Li E F.Research advances of biocontrol Bacillus in the field of plant disease[J].Journal of Tianjin Agricultural University,2021,28(4):71-77.

[21] 高蕓.生防芽孢桿菌及假單胞菌拮抗植物微生物病害研究進(jìn)展[J].北方園藝,2021(2):131-136.

Gao Y.Research progress in biocontrol of plant microbial diseases by Bacillus and Pseudomonas.[J].Northern Horticulture, 2021(02):131-136.(in Chinese)

[22] 董煒博,石延茂,遲玉成,等.穿刺巴氏桿菌防治植物根結(jié)線蟲病的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用前景[J].中國(guó)生物防治, 1999(2):42-46.

Dong W B,Shi Y M,Chi Y C,et al.Status and prospect of biocontrol of plant root-knot nematode diseases by pasteuria penetrans[J].Chinese Journal of Biological Control,1999(2):42-46.(in Chinese)

[23] Li P,Ma L,Feng Y L,et al.Diversity and chemotaxis of soil bacteria with antifungal activity against Fusarium wilt of banana[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012,39(10):1495-1505.

[24] 李俊州,文才藝.植物病害生防細(xì)菌研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,44(10):1-7.

Li J Z,Wen C Y.Research progress on bacteria for biological control of plant disease[J].Journal of Henan Agricultural Sciences,2015,44(10):1-7.(in Chinese)

[25] 覃仁柳,龐師嬋,唐小付,等.番茄嫁接植株根系內(nèi)生細(xì)菌和真菌群落的組成特征[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2021,34: 1062-1072.

Qin R L,Pang S C,Tang X F,et al.Characteristics of endophytic microbial diversity and community structure in roots of grafted tomatoes[J].Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2021,34:1062-1072.(in Chinese)

[26] 杭唯.產(chǎn)酶溶桿菌第二信使C-dI-GMP合成相關(guān)基因lys385的克隆及功能分析[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

Hang W.Identification and functional characterization of LYS385,a second messenger C-dI-GMP metabolising protein in Lysobacter enzymogenes[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2015.(in Chinese)

[27] Becraft E D,Woyke T,Jarett J,et al.Rokubacteria:genomic giants among the uncultured bacterial phyla[J].Frontiers in Microbiology,2017(8):2264.

[28] 王文團(tuán).耐鹽堿細(xì)菌篩選與生物菌肥對(duì)鹽堿地作物的影響[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2020.

Wang W T.Screening of saline-tolerant bacteria and effects of biological fertilizer on saline-alkali crops[D].Tai’an Shandong Agricultural University,2020.(in Chinese)

[29] 曹佳.蚯蚓和菌根真菌促進(jìn)土霉素降解及其修復(fù)污染土壤的協(xié)同機(jī)制[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2018.

Cao J.Cooperation between earthworm and AM fungi on the degradation and remediation of oxytetracycline in soil[D].Beijing:China Agricultural University,2018.(in Chinese)

[30] 于竺岑.分離自蘆葦根系一株芽生球菌的新菌鑒定及全基因組分析[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古大學(xué),2021.

Yu Z Z.Identification and genome analysis of a new strain ofisolated from the root of phragmites australis[D].Hohhot:Inner Mongolia University,2021.(in Chinese)

[31] 金桃,馮強(qiáng),萬(wàn)景旺,等.五種根際促生菌在改善植物的農(nóng)藝性狀方面的應(yīng)用[P].廣東省:CN106472568B,2020-05- 12.

Jin T,Feng Q,Wan J W,et al.Application of five inter-root promoting bacteria in improving agronomic traits of plants[P].Guangdong Province:CN106472568B,2020-05-12. (in Chinese)

[32] Farag Mf. F.First record of Melanospora chionea as a possible cause of pink root rot disease on tomato plants in Egypt[J].Journal of Plant Pathology & Microbiology, 2020 (11):1-8.

[33] 張進(jìn)強(qiáng),唐鑫,郭蘭萍,等.天麻連作障礙與土赤殼屬真菌的關(guān)聯(lián)分析及改善措施[J].中國(guó)中藥雜志,2022,47(9): 2296-2303.

Zhang J Q,Tang X,Guo L P,et al.Correlation analysis between continuous cropping obstacle of Gastrodia elata and Ilyonectria fungi and relieving strategy[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2022,47(9):2296-2303. (in Chinese)

[34] 宋騰蛟,楊蔣舜,周靜,等.基于Miseq測(cè)序技術(shù)分析不同元胡產(chǎn)區(qū)土壤細(xì)菌功能基因組成與差異[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2018,42(3):178-186.

Song T J,Yang J S,Zhou J,et al.Analysis of composition and difference of soil bacteria functional genes of in different corydalis Yanhusuo producing areas based on Miseq sequencing technology[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2018,42(3):178-186.(in Chinese)

[35] 楊盼,翟亞萍,趙祥,等.叢枝菌根真菌和根瘤菌互作對(duì)苜蓿根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響及PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析[J].微生物學(xué)通報(bào),2020,47(11):3868-3879.

Yang P,Zhai Y P,Zhao X,et al.Effect of interaction between arbuscular mycorrhizal fungi and Rhizobium on Medicago sativa rhizosphere soil bacterial community structure and PICRUSt functional prediction[J].Microbiology China,2020, 47(11):3868-3879.(in Chinese)

[36] 王峰,陳玉真,吳志丹,等.種植模式和坡位對(duì)茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能類群的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2022(20): 1-18.

Wang F,Chen Y Z,Wu Z D,et al. Effects of planting patterns and slope positions on soil bacterial community structure and functional groups in tea gardens[J].Acta Ecologica Sinica,2022(20):1-18.(in Chinese)

[37] 呂錫斌,吳云成,陳良強(qiáng),等.赤水河流域浮游細(xì)菌群落特征及其與水質(zhì)的關(guān)系[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2021,41(11):4596-4605.

Lv X B,Wu Y C,Chen L Q,et al. Characteristics of the bacterioplankton community and their relationships with water quality in Chishui Ｒiver basin[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2021,41(11):4596-4605.(in Chinese)

Continuous Cropping Years Affect the Rhizosphere Soil Microbial Community Structure and Functional Taxa of Celery

LIU Su1, WU Hong-liang1, CHEN Zhuo1, FENG Hai-ping2, ZHANG Hai-yu1, KANG Jian-hong1

(1.School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;2.Institute of Horticulture, Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Yinchuan 750000)

Celery is a characteristic vegetable in Ningxia cold region, and its large-scale planting inevitably leads to the prominent obstacle of continuous cropping. In order to reveal the diversity characteristics of microbes in celery rhizosphere soil and the difference of community structure with planting years, author used Illumina Novaseq-PE250 sequencing platform to sequence 16S V3V4 region and ITS1 region of celery rhizosphere soil samples after planting for one year (CA), continuous cropping for two years (CB) and continuous cropping for three years (CC), and made bioinformatics analysis.The results showed that the soil bacterial diversity decreased gradually with the extension of continuous cropping years. The Chao 1 index decreased from 8509.41 in the first year to 6314.09 in the third year.The CA Shannon index was the highest at 11.48 and the CC was the lowest at 11.08.The abundance of beneficial bacteria such as Deltaproteobacteria and Gemmatimonadetes in soil bacteria and,andin them decreased. The diversity index and richness index of soil fungi first decreased and then increased with the increase of continuous cropping years, which showed that the Chao 1 index of CA and CB was 505.44 and 264.66, while CC was 443.92, the Shannon index of CA and CB was 5.98, 4.93, and CC was 5.61, and there were significant differences between continuous cropping years. At the same time, there are significant differences among soil fungi, such as,,and other dominant genera. The results of microbial principal coordinate component analysis showed that there was strong heterogeneity between CC and other treatments. The function prediction analysis of PICRUSt2 showed that bacteria in the rhizosphere soil of celery mainly had 7 major categories of primary functional layers, with the highest relative abundance of Amino Acid Biosynthesis, fungi had 5 major categories of primary functional layers, and the highest relative abundance of Nucleoside and Nucleotide Biosynthesis. At the same time, there were significant differences between multiple metabolic pathways in different years of continuous cultivation of celery. To sum up, celery continuous cropping will reduce the richness and diversity of rhizosphere soil flora, change the flora structure, and lead to the imbalance of rhizosphere micro-ecological environment, thus causing related continuous cropping obstacle diseases. Among them, the microbial indices changed the most when celery was continuously cropped for three years. Therefore, it is recommended that the celery industry in the southern mountainous areas of Ningxia should be continuously cropped for no more than two years as a field planting mode.

Celery; Continuous croping year; Rhizosphere soil microorganism; High-throughput sequencing; PICRUSt2 functional prediction

10.3969/j.issn.1000-6362.2023.05.003

收稿日期：2022?05?22

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021AAC03079）；寧夏農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和生態(tài)保護(hù)科技創(chuàng)新示范項(xiàng)目（NGSB?2021?8?06）；寧夏自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2020BBF03016）；寧夏青年拔尖人才項(xiàng)目

通訊作者：吳宏亮，副教授，主要從事耕作制度、農(nóng)業(yè)生態(tài)領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)理論和技術(shù)研究，E-mail: nxuwu@163.com

劉素，E-mail：nxuliu@163.com

劉素,吳宏亮,陳倬,等.連作年限影響芹菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能類群[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,2023,44(5):372-385