板藍(lán)根顆粒需氧菌總數(shù)的限度檢測

劉風(fēng)琴，李秀珍，李婷婷，郭樹靜

( 山東省德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 德州 253000)

板藍(lán)根顆粒是一種由大青葉和板藍(lán)根兩種中藥材共同組成的中藥制劑，主要具有解毒、清熱、涼血、利咽等各種功效，臨床中主要應(yīng)用于流行性腮腺炎、流行性感冒發(fā)熱等病毒性疾病的預(yù)防和治療，同時(shí)也是治療病毒性肝炎的傳統(tǒng)藥物之一，針對(duì)扁平疣、帶狀皰疹等各種病毒性皮膚疾病也有較好的臨床療效[1]。大青葉具有涼血消斑、清熱解毒的功效，主要應(yīng)用于抑菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗炎治療中。板藍(lán)根則具有涼血利咽、清熱解毒，以及抗病毒、抗菌、增強(qiáng)免疫功能、抗內(nèi)毒素、抗血小板聚集、抗癌等各種功效。中成藥制劑在生產(chǎn)過程中，需要經(jīng)歷多個(gè)環(huán)節(jié)，這就使得它們極易被微生物污染，從而使得其安全性和質(zhì)量受到影響。加強(qiáng)藥品的微生物檢驗(yàn)和限度測定是保證藥品安全性的重要措施[2]。需氧菌總數(shù)是2020年版《中國藥典》中針對(duì)非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查的重要項(xiàng)目，同時(shí)也是評(píng)價(jià)藥品安全性的重要指標(biāo)，其能夠較好地反映出藥品在生產(chǎn)期間是否達(dá)到了生產(chǎn)要求。微生物計(jì)數(shù)法主要包括了薄膜過濾法、平皿法、最可能數(shù)法，平皿法是微生物計(jì)數(shù)方法中應(yīng)用范圍最廣的試驗(yàn)方法[3]。本研究根據(jù)《中華人民共和國藥典》中關(guān)于控制菌檢查法和微生物計(jì)數(shù)法的相關(guān)指導(dǎo)，構(gòu)建起板藍(lán)根顆粒的需氧菌總數(shù)限定檢測方法，期望為板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

MLS—378L—PC 高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社）；XS105DU 電子天平〔梅特勒一托利多( 上海) 有限公司〕；SHP—250 生化培養(yǎng)箱( 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BWS—27 精密恒溫水槽( 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；HR40-IIA2 生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；IKA 渦旋混勻器(德國)。

1.2 試驗(yàn)試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京路橋技術(shù)股份有限公司）；pH 7.0 無菌氯化鈉·蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；滅菌生理鹽水。大腸埃希菌定量菌株（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；板藍(lán)根顆粒樣品（編號(hào)為QA01、QA02、QA03，中國食品藥品檢定研究院提供）。

1.3 試驗(yàn)方法

根據(jù)《中國藥典》2020 年版第四部通則1105 中的平皿法進(jìn)行樣品需氧菌總數(shù)的檢測操作。

1.3.1 樣品前處理 首先取樣品放置于室溫環(huán)境下，運(yùn)用75% 乙醇對(duì)瓶身進(jìn)行擦拭，然后在生物安全柜內(nèi)小心地將西林瓶蓋開啟。取10 mL 滅菌用水加入瓶內(nèi)，將瓶蓋蓋好。充分溶解混合后的樣品，即可作為待測供試品。在室溫下放置15 min 后可進(jìn)行測試。按照相同的方法獲得3 份樣品。

1.3.2 樣品稀釋 運(yùn)用稀釋管精準(zhǔn)抽取上述待測樣品5 mL，轉(zhuǎn)移至pH 7.0 的無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液（45 mL）中，對(duì)其進(jìn)行充分的振搖?；旌暇鶆?，即得1:10 的樣品。抽取1 mL 的溶液加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（9 mL）中，混合均勻即得1:100的樣品。按照上述稀釋制備方法繼續(xù)進(jìn)行樣品稀釋，直至獲得1:100 000 的稀釋品。最終獲得3 份樣品。

1.3.3 樣品培養(yǎng) 陰性對(duì)照：吸取1 mL pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，將其轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)；樣品：從上述3 種稀釋度的樣品中分別抽取1 mL 轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中，平行兩份。在傾注培養(yǎng)基的過程中，溫度需要控制在45℃以內(nèi)，并以逆時(shí)針的方向?qū)ζ矫筮M(jìn)行勻速旋轉(zhuǎn)。注意不得將培養(yǎng)基濺到皿蓋和皿邊上方，使其能夠充分的混勻，在其凝固之后，即可將平皿倒置于33℃的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)3 ～5 d，注意觀察菌落數(shù)量。

1.3.4 計(jì)數(shù)與報(bào)告 根據(jù)《中國藥典》2020 年版中的相關(guān)要求，對(duì)平板上生長較佳的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)識(shí)別，并如實(shí)記錄檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果

根據(jù)結(jié)果來看，相同稀釋度兩個(gè)平板的菌落數(shù)結(jié)果非常接近，這就表明試驗(yàn)具有較好的平行性，同時(shí)結(jié)果準(zhǔn)確度較高。陰性對(duì)照試驗(yàn)無菌落生長，即表明試驗(yàn)操作中未出現(xiàn)被污染的情況，結(jié)果有效。從QA01 樣品中選取1:1000 稀釋度來實(shí)施檢測，結(jié)果顯示為37 000 cfu/mL。針對(duì)QA02 樣品選取1:10 與1:100稀釋度進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示為1500 cfu/mL。而QA03的樣品無菌落生長。見表1。

表1 樣品檢測結(jié)果（cfu/mL）

2.2 能力驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)中國食品藥品檢定研究院能力驗(yàn)證結(jié)果來進(jìn)行滿意度評(píng)價(jià)，即以≤2表示滿意，2＜≤3表示可疑，＞3表示不滿意。若三個(gè)樣品結(jié)果均表示為滿意，最終結(jié)果即可判定為“滿意”，若其中一個(gè)存疑或不滿意，即判定為“存疑”或者“不滿意”。根據(jù)表2 來看，本次測定結(jié)果表示為滿意，盡管QA03 中的指定值＜1，但本次測試結(jié)果為＜10 cfu/mL，即表明結(jié)果滿意。但為了能夠提升樣品的檢出限，此后針對(duì)未知樣品實(shí)施需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢驗(yàn)期間，可以針對(duì)供試品原液實(shí)施計(jì)算。

表2 能力驗(yàn)證評(píng)價(jià)表

3 結(jié)論

3.1 板藍(lán)根顆粒需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)

為了充分了解板藍(lán)根顆粒的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)情況，本次測試采取平皿法微生物計(jì)數(shù)法按照《中國藥典》中相關(guān)要求進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)操作，根據(jù)結(jié)果反饋情況來看，本次實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行д莆瞻逅{(lán)根顆粒中的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)情況。同時(shí)，在具備這種能力之后，也能夠更為客觀地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力與管理水平，還能夠?qū)⑵渥鳛橹匾曳浅Ｓ行У膶?shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量控制手段。

3.2 質(zhì)量控制分析

3.2.1 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備控制 在接收到樣品之后，應(yīng)當(dāng)及時(shí)對(duì)樣品的完整性進(jìn)行檢查，若樣品存在污染或者破損等問題，就必須及時(shí)聯(lián)系機(jī)構(gòu)做出處理。在接收到樣品之后必須盡快對(duì)其進(jìn)行檢測。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作期間，所采用的各種吸管、培養(yǎng)基、鑷子等均必須根據(jù)相關(guān)要求來實(shí)施滅菌處理，同時(shí)及時(shí)驗(yàn)證滅菌效果。為了避免因高壓滅菌導(dǎo)致培養(yǎng)基量和稀釋液的減少，或者為了能夠最大程度上控制傳遞中的污染問題，所有的稀釋液與培養(yǎng)基都需要配置相應(yīng)的硅膠塞，并做好獨(dú)立包扎吹。在對(duì)吸管實(shí)施滅菌處理之前，上端需要增加小段棉花，避免外界雜菌進(jìn)入到管內(nèi)或者不慎將菌液抽吸出管外，引起不必要的污染問題[4]。

3.2.2 樣品制備和稀釋過程控制 在實(shí)驗(yàn)操作之前首先需要將樣品放置到室溫條件下，運(yùn)用75% 的乙醇充分擦拭瓶蓋，在安全柜內(nèi)完成無菌瓶相關(guān)操作，并向瓶內(nèi)緩慢加入滅菌水，在樣品充分混合之后再根據(jù)要求來進(jìn)行后續(xù)操作。根據(jù)《中國藥典》中需氧菌總數(shù)的控制限度，對(duì)樣品進(jìn)行稀釋處理，各個(gè)樣品需要配置兩個(gè)平板，這期間必須確保菌液具有較好的均勻性，同時(shí)在完成稀釋處理前后，均需要在混勻器上實(shí)施充分的混勻處理?；靹蚱陂g必須對(duì)力度進(jìn)行嚴(yán)格控制，以防有飛濺引起污染。而根據(jù)本次結(jié)果來看，要更好地提升樣品的檢出限，可以采取原液來實(shí)施計(jì)數(shù)檢測[5]。

3.2.3 計(jì)數(shù)觀察控制 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在進(jìn)行培養(yǎng)之后的2 d 內(nèi)就能夠?qū)嵤┯?jì)數(shù)觀察，以防菌落數(shù)覆蓋導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果受到影響。此后，分別需要再次對(duì)培養(yǎng)第3 d、4 d、5 d 的情況進(jìn)行計(jì)數(shù)。需要注意的是，必須盡量保持在超凈工作臺(tái)內(nèi)計(jì)數(shù)，注意不得將培養(yǎng)皿的蓋子開啟，輕拿輕放，以免出現(xiàn)自身和交叉污染情況[6-7]。

總而言之，根據(jù)《中國藥典》中微生物限度檢查法對(duì)板藍(lán)根顆粒的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)進(jìn)行測定，較好地掌握了需氧菌數(shù)量情況，為板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制提供了客觀指導(dǎo)。