免疫熒光染色法在基層醫(yī)院診斷肺結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值分析

練億香，羅海軍，蔣莎莉

（長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

目前結(jié)核病仍然是單一傳染性病原體導(dǎo)致死亡的最常見原因，全球有30 個(gè)相關(guān)高負(fù)擔(dān)國(guó)家，中國(guó)是其中之一[1]。肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌侵入肺部引起的慢性呼吸系統(tǒng)傳染病，常累及多個(gè)臟器甚至引起死亡，已經(jīng)成為全球性公共衛(wèi)生問題[2]。然而，多年來(lái)面臨的相關(guān)診斷難題一直未能徹底解決（即如何早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核?。７谓M織活檢診斷肺結(jié)核的病理形態(tài)學(xué)具有一定的局限性，相當(dāng)程度受病理醫(yī)師的基本知識(shí)、閱片經(jīng)驗(yàn)及邏輯思維的影響，帶有主觀性和經(jīng)驗(yàn)性，且有些疾病的組織形態(tài)學(xué)具有共同性或者相似性，在常規(guī)染色下因“同形”而難以區(qū)別，特異性低，單從組織形態(tài)學(xué)上難以確診。因此目前在基層醫(yī)院，病理科診斷肺結(jié)核主要是根據(jù)病理形態(tài)學(xué)改變結(jié)合傳統(tǒng)抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核桿菌進(jìn)行確診[3]?？顾崛旧椒ê?jiǎn)單、成本低，但是靈敏度低，易漏診[4]。TB-DNA-RNA 具有高靈敏度和特異度，是診斷肺結(jié)核的可靠手段，但該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、設(shè)備、操作人員都有較高的要求，且臨床收費(fèi)高，很多基層醫(yī)院因條件受限無(wú)法開展。因此，基層醫(yī)院病理科亟需一種敏感度、特異性高且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的技術(shù)輔助診斷肺結(jié)核。本研究主要是評(píng)估免疫熒光染色法診斷肺結(jié)核的性能，探索能替代TB-DNA 檢測(cè)的診斷策略。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

從2022 年1 月至2022 年12 月在長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院病理科經(jīng)肺組織活檢考慮肺結(jié)核的病例中選取已做TB-DNA 檢測(cè)項(xiàng)目，并且具有咳嗽、咳痰、發(fā)熱等臨床癥狀病例的組織標(biāo)本453 例。其中排除影像學(xué)結(jié)果缺失的45 例，抗酸染色結(jié)果缺失的21 例，最終387例病例的組織進(jìn)行免疫熒光染色法檢查。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，經(jīng)長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)：2023-002。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 抗酸染色法 所選肺組織行石蠟切片，采用脫蠟液進(jìn)行脫蠟至水，滴加石炭酸復(fù)紅染色15 min，水洗，鹽酸酒精脫色至無(wú)色，亞甲基藍(lán)復(fù)染，蒸餾水清洗，常規(guī)脫水、晾干、封片。由兩位醫(yī)師用光學(xué)顯微鏡閱片判讀。

1.2.2 免疫熒光染色法 所選肺組織行石蠟切片，脫蠟至水，滴加免疫顯色試劑Ⅲ（湖南華厚科技有限公司生產(chǎn)）A 液染色15 min，水洗，滴試劑B 液脫色，直到肉眼觀察無(wú)色為止，水洗。由兩位醫(yī)師在熒光顯微鏡下觀察判讀。

1.2.3 TB-DNA-PCR 石蠟切片后脫蠟，使用核酸提取/ 純化試劑盒提取核酸。配置PCR 反應(yīng)液（TB PCR 反應(yīng)液12.5μl+TB 引物探針混合液3.5μl+H2O 4μl），加入5μl 樣本核酸。在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增及信號(hào)采集。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)熒光曲線調(diào)整基線和閾值，得到各樣本CT 值。若曲線呈圓滑S 型，質(zhì)控合格，CT 值≤37, 可判為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 27.0 軟件分析數(shù)據(jù)。連續(xù)指標(biāo)用中位數(shù)記錄；分類指標(biāo)用頻數(shù)和百分比記錄。兩種方法“和”聯(lián)合代表雙陽(yáng)性判讀為陽(yáng)性，兩種方法“或”聯(lián)合代表雙陰性判讀為陰性。一致性用kappa 值評(píng)估。繪制受試者工作曲線（ROC），計(jì)算曲線下面積（AUC）及其95% 置信區(qū)間。計(jì)算敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)、風(fēng)險(xiǎn)比值比（OR）及置信區(qū)間，并進(jìn)行比較[5]。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨界值取雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共納入387 例進(jìn)行分析，TB-DNA 陽(yáng)性例數(shù)為234 例（60.5%），抗酸染色為陽(yáng)性的占31.0%（120例），免疫熒光為陽(yáng)性的占50.9%（197 例）。在TBDNA 陽(yáng)性組中，病理形態(tài)學(xué)異常率達(dá)97.4%，抗酸染色法的陽(yáng)性率為49.6%。在TB-DNA 陰性組中，抗酸染色法和免疫熒光染色法陽(yáng)性率分別為2.6%和3.9%，而影像學(xué)檢查考慮結(jié)核的比例為61.4%，見圖1。

圖1 不同方法在TB-DNA 陽(yáng)性或陰性組中的陽(yáng)性率

2.2 不同檢查方法與TB-DNA 檢測(cè)結(jié)果的一致性

肺結(jié)核診斷的一致性分析見表1。TB-DNA 法與免疫熒光法的kappa 值為0.746（95%CI=0.681-0.811），與 抗 酸 染 色 法 的kappa 值 為0.416（95%CI=0.343-0.489）。

表1 不同檢查方法與TB-DNA 檢測(cè)結(jié)果的一致性

2.3 不同方法診斷肺結(jié)核的性能

以TB-DNA 為 參 照，影 像 學(xué) 檢 查 的AUC 為0.580（0.532-0.627），病 理 形 態(tài) 學(xué) 的AUC 為0.788（95%CI=0.748-0.828），抗酸染色法的AUC 為0.735（95%CI=0.700-0.769），免疫熒光染色法的AUC 為0.889（95%CI=0.859-0.918），見圖2。

圖2 不同檢查診斷肺結(jié)核的ROC 曲線

不同檢查方法的診斷性能見表2。病理形態(tài)學(xué)的敏感度為97.4%（95%CI=94.5%-99.1%），特異度為60.1%（95%CI=51.9%-67.9%）。抗酸染色法的敏感度和特異度分別為49.6%（95%CI=43.0%-56.2%）、97.4%（95%CI=93.4%-99.3%），免 疫 熒 光 染 色 法的敏感度和特異度分別為81.6%（95%CI=76.1%-86.4%）、96.1%（95%CI=91.7%-98.5%）。免 疫 熒光染色法與抗酸染色法的特異度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.500），敏感度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異（P＜0.001）。

表2 不同檢查方法診斷肺結(jié)核的性能

2.4 不同方法聯(lián)合診斷肺結(jié)核的性能

在所有受試者中，病理形態(tài)學(xué)和免疫熒光染色法的敏感度和特異度分別為79.9%（95%CI=74.2%-84.9%）和96.7%（95%CI=92.5%-98.9%）。病理形態(tài)學(xué)或免疫熒光染色法的敏感度和特異度分別為99.1%（95%CI=96.9%-99.9%）和59.5%（95%CI=51.3%-67.3%）。見表3。

表3 不同方法聯(lián)合診斷肺結(jié)核的性能

3 討論

肺結(jié)核在我國(guó)呈高發(fā)態(tài)勢(shì)，發(fā)病率居世界前列。在臨床上，此病患者可出現(xiàn)午后低熱、盜汗、咳嗽、咯血等癥狀, 通常以行胸部X 線、痰找結(jié)核桿菌的常規(guī)方法檢測(cè)。但是有些患者的臨床癥狀不典型, 常規(guī)方法陽(yáng)性率不高，需要病理組織的確診。傳統(tǒng)抗酸染色法與改良的抗酸染色法在肺泡灌洗液或痰液標(biāo)本檢測(cè)中的敏感度為33.3%～63.8%[6-8]。TB-DNA 在痰液、肺泡灌洗液檢測(cè)的研究中，敏感度均＞90%[7,9-10]。如果缺少TB-DNA 檢測(cè)，許多基層醫(yī)院患者很容易漏診，延誤治療，造成結(jié)核病病情不斷進(jìn)展，甚至危及生命。本研究中免疫熒光染色法與TB-DNA 的kappa 值為0.746，相比于抗酸染色法、病理形態(tài)學(xué)，一致性最高?？顾崛旧ǖ腜PV 為96.7%，但敏感度低。免疫熒光染色法的AUC 為0.899，具有很好的鑒定力，敏感度、特異度、PPV、NPV 分別為81.6%、96.1%、97.0%、77.4%，準(zhǔn)確性指標(biāo)均衡。其NPV（77.4%）偏低，但高于抗酸染色法（55.4%）。病理形態(tài)學(xué)的敏感度高（97.4%），但特異度僅為60.1%。病理形態(tài)學(xué)和免疫熒光染色法的聯(lián)合檢查結(jié)果雙陽(yáng)性判讀為陽(yáng)性，任一結(jié)果為陰性判讀為陰性時(shí)，其敏感度低（79.9%），特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高（均＞95%）。病理形態(tài)學(xué)或免疫熒光染色法的聯(lián)合，雙陰性判讀為陰性，任一結(jié)果為陽(yáng)性判讀為陽(yáng)性時(shí)，其敏感度高（99.1%），陰性預(yù)測(cè)值高（97.8%），表明這種聯(lián)合對(duì)肺結(jié)核的漏診率低，并且雙陰性者患肺結(jié)核的概率很低。

綜合而言，免疫熒光染色法操作簡(jiǎn)單，相比TBDNA 收費(fèi)低，臨床準(zhǔn)確性指標(biāo)都優(yōu)于抗酸染色法，與TB-DNA 檢測(cè)的一致性高。病理形態(tài)學(xué)或免疫熒光染色法對(duì)TB-DNA 陽(yáng)性標(biāo)本檢出率達(dá)99%，NPV 在95%以上，在缺乏開展TB-DNA 檢測(cè)能力的基層醫(yī)院，其是一種潛在的替代診斷策略，該策略的實(shí)際臨床價(jià)值還需多中心前瞻性的臨床研究來(lái)驗(yàn)證。