明膠修飾的 β-胡蘿卜素亞微乳的制備與處方優(yōu)化

徐 歌，敖 莎，陳稞壘，熊婷婷，朱柯武，駱 翔

（紹興文理學(xué)院，浙江 紹興，312000）

β-胡蘿卜素（β-Carotene）（結(jié)構(gòu)式見圖 1）是一種天然果蔬中大量含有的有色天然化合物，可使水果和蔬菜呈現(xiàn)出黃色和橘色等顏色，人體無(wú)法自主合成。β-胡蘿卜素的分子式為 C40H56，相對(duì)分子質(zhì)量為 536.88，在水中幾乎不溶，在乙醇和乙醚等有機(jī)溶劑中微溶，易溶于異丙醇、氯仿以及各類油中[1]。

Fig.1 The structure of β-carotene圖1 β-胡蘿卜素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

β-胡蘿卜素經(jīng)人體吸收后可在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)人體有益的維生素 A。因此，β-胡蘿卜素也被稱為“前維生素 A”（Provitamin A）。β-胡蘿卜素具有良好的維生素 A 源活性，具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、預(yù)防心臟病[4]、提高機(jī)體免疫能力[5]、抗氧化[6]等重要作用。并且，已被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）聯(lián)合食品法規(guī)委員會(huì)認(rèn)證為安全可食用的食品添加劑。鑒于類胡蘿卜素中β-胡蘿卜素在體內(nèi)轉(zhuǎn)化率較高，且不會(huì)因攝食過量β-胡蘿卜素而造成維生素 A人體蓄積中毒。因此，往往選擇β-胡蘿卜素用以補(bǔ)充維生素 A。

盡管β-胡蘿卜素的效果優(yōu)異，但水溶性差且生物利用度低，在氧氣和光照充足、高溫的條件下易發(fā)生化學(xué)降解[7-8]。因此，對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行分離純化，并且選擇合適的載體材料將其制備成納米乳液對(duì)提高β-胡蘿卜素生物利用度至關(guān)重要。人體食用含有β-胡蘿卜素的食物，進(jìn)入小腸后通過被動(dòng)擴(kuò)散被小腸上皮細(xì)胞細(xì)胞膜吸收[9-10]，在進(jìn)入淋巴系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)之前與乳糜微粒結(jié)合，根據(jù)這一機(jī)制，將β-胡蘿卜素制成亞微乳，使其以小液滴的形式精密地分散于水相中穩(wěn)定存在，實(shí)現(xiàn)藥物在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)和生物利用度的提高[11]。亞微乳是一種新型納米級(jí)的藥物遞送系統(tǒng)，乳化劑和助乳化劑的存在使得制劑中的乳滴可以穩(wěn)定地存在于該體系中[12]。亞微乳具有提高藥物的療效[13]、增加藥物的生物利用度[14]、提高親脂性藥物穩(wěn)定性[15]等優(yōu)勢(shì)。

明膠是一種人體親和性極高的生物可降解高分子材料，是天然的乳化劑和穩(wěn)定劑，無(wú)毒無(wú)害，無(wú)免疫原性，且具有良好的藥物緩釋作用，被廣泛用于食品和醫(yī)療等鄰域[16]。因此，選用明膠作為亞微乳的乳化劑可以通過緩釋作用提高藥物穩(wěn)定性、降低毒副作用[17]。

本實(shí)驗(yàn)制備β-胡蘿卜素亞微乳，使用 Design-Expert 11 軟件，用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化β-胡蘿卜素亞微乳處方。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于應(yīng)用 3D 響應(yīng)面和數(shù)學(xué)模型得出的輪廓圖可確定最佳條件，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法，可減少多余的實(shí)驗(yàn)處方，提高實(shí)驗(yàn)精度，使得理論值與實(shí)驗(yàn)值更加接近等。近年來(lái)，此方法在藥物制劑領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[18]。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

β-胡蘿卜素（β-Carotene，天津希恩思生化科技有限公司，純度 ≥ 98%），磷酸二氫鈉（NaH2PO4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190917），磷酸氫二鈉（Na2HPO4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180725），無(wú)水乙醇（C2H6O，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：E809061），異丙醇（C3H8O，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：I811925），大豆油（益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司），大豆卵磷脂（SPC-98A，艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司，純度 98%），明膠（羅賽洛（廣東）明膠有限公司，平均分子量為 35 kDa），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

JY92-IIN 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠），ME204E 分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），UV-2600 紫外分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司），TopPette 微量移液器（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），透析袋（截留分子量 10 kDa，美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)公司），JEM-1011 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

1.3 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和專屬性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密移取 50 mL 大豆油至 100 mL 燒杯中，精密稱取 0.500 gβ-胡蘿卜素加入大豆油中。在該燒杯中加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，在 37 ℃ 下攪拌約 3 h，充分溶解后，將溶有β-胡蘿卜素的大豆油進(jìn)行超速離心。用滴管吸取上清液，棄去底部未溶解的β-胡蘿卜素，得到β-胡蘿卜素-大豆油溶液。作為油相，用于β-胡蘿卜素亞微乳的制備。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取 5 mgβ-胡蘿卜素對(duì)照品，置于西林瓶中，加異丙醇完全溶解，將其定量轉(zhuǎn)移至量瓶中，用異丙醇定容至 10 mL，得到對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精確吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液 100、150、200、250、300、350 μL 于 10 mL 量瓶中，用異丙醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為10、15、20、25、30、35 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。使用紫外分光光度儀，將異丙醇作為本底，對(duì)β-胡蘿卜素異丙醇溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)。并且，以β-胡蘿卜素吸光度（A）對(duì)β-胡蘿卜素濃度（μg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，繪制β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

任選一組實(shí)驗(yàn)處方，按照處方量稱取適量大豆油、磷脂作為油相。稱取處方量的明膠，將其加入 pH 7.4 PBS（10 mmol·L-1）中加熱攪拌，完全溶解作為水相。在 65 ℃ 磁力攪拌的條件下緩慢將水相注入油相中，轉(zhuǎn)速約 20 r·min-1，攪拌 10 min，65 ℃ 下恒溫孵育得到初乳。孵育完成后轉(zhuǎn)移至 10 mL EP 管中。使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，前后分別設(shè)置功率為 10% 2 min 和 20 %4 min 進(jìn)行超聲，得到空白亞微乳，用于專屬性試驗(yàn)。精密吸取制得的空白乳 400 μL，將其置于 10 mL 量瓶中。用異丙醇定容至 10 mL，用紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.4 處方設(shè)計(jì)優(yōu)化

1.4.1β-胡蘿卜素亞微乳的制備

在 Design-Expert 11 軟件中限定各處方的范圍[19-21]，軟件生成需要制備的處方。稱取處方量的β-胡蘿卜素-大豆油溶液、大豆油、磷脂作為油相。稱取處方量的明膠，將其加入 pH 7.4 PBS（10 mmol·L-1）中加熱攪拌，完全溶解作為水相。將兩相分別置于磁力攪拌恒溫水浴鍋中，確保兩相溫度相同后，在磁力攪拌下，將水相緩緩加入到油相中。繼續(xù)攪拌 10 min，65 ℃ 下恒溫孵育得到初乳。孵育完成后轉(zhuǎn)移至 10 mL EP 管中，EP 管外放置冰水浴防止制劑溫度過高。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，前后分別設(shè)置功率為 10 % 2 min 和 20 % 4 min 進(jìn)行超聲得到亞微乳[22-23]，將超聲完的β-胡蘿卜素亞微乳裝入西林瓶中。

1.4.2β-胡蘿卜素亞微乳粒徑測(cè)定[24]

采用 ZS90 馬爾文激光粒度儀測(cè)定亞微乳粒徑。精密移取各個(gè)處方的亞微乳 1 mL 于樣品池中，加入適量的 pH 7.4 PBS（10 mmol·L-1）稀釋到適宜濃度。打開樣品池蓋，放入測(cè)量池中（帶▼符號(hào)面朝向測(cè)量者），開始測(cè)量，測(cè)量結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4.3β-胡蘿卜素亞微乳載藥量測(cè)定

精密吸取各個(gè)處方的亞微乳 2 mL，過 0.8 μm 微孔濾膜，將未被裝載在乳滴中的β-胡蘿卜素除去。再精密吸取過微孔濾膜后的β-胡蘿卜素亞微乳 400 μL，置于 5 mL 容量瓶中，用異丙醇定容至 5 mL，振搖后轉(zhuǎn)移至 10 mL EP 管中，置于超聲波清洗器中，在超聲波的作用下使得β-胡蘿卜素亞微乳中的β-胡蘿卜素可以完全溶于異丙醇。完全溶解將 EP 管放入高速離心機(jī)中去除部分不溶明膠，在 5000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心 2 min，完成后小心取出樣品。精密移取上清液后，以空白亞微乳的異丙醇溶液為本底，用紫外分光光度計(jì)在特征波長(zhǎng) 451 nm 處測(cè)定上清液的吸光度，記錄各個(gè)處方的吸光度。在測(cè)定吸光度時(shí)必須確保其吸光度數(shù)值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線所測(cè)得的吸光度范圍內(nèi)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同處方制備的β-胡蘿卜素亞微乳的載藥量。

1.4.4β-胡蘿卜素亞微乳的離心穩(wěn)定性考察

分別精密吸取未過膜β-胡蘿卜素亞微乳 1 mL 至 2.5 mL EP 管中。將 EP 管放入離心機(jī)中，在5000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心 2 min。離心完成后精密吸取上層液體 100 μL，將其裝入另一 2.5 mL EP管中，再加入異丙醇定容。精密吸取未離心的β-胡蘿卜素亞微乳 100 μL，做相同的處理用于檢測(cè)。

使用紫外分光光度計(jì)，以空白亞微乳的異丙醇溶液作為本底，在特征波長(zhǎng)451 nm 處測(cè)定各溶液吸光度。離心后上層的β-胡蘿卜素亞微乳吸光度記為A1，將未經(jīng)過離心的β-胡蘿卜素亞微乳吸光度記為A0。分別將各組的A1和A0代入穩(wěn)定常數(shù)（Ks）計(jì)算公式，計(jì)算各個(gè)處方β-胡蘿卜素亞微乳的Ks。計(jì)算公式如下：

1.4.5 中心復(fù)合設(shè)計(jì)Central Composite Design（CCD）

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD），研究三個(gè)不同因素對(duì)確定響應(yīng)個(gè)體效應(yīng)和協(xié)同效應(yīng)。通過描繪三個(gè)不同考察因素的響應(yīng)效應(yīng)面，運(yùn)用軟件對(duì)效應(yīng)面進(jìn)行分析，得到理論最優(yōu)處方。該方法可以減少評(píng)估各參數(shù)的主要影響及其相互作用所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)。其特點(diǎn)是：2n階乘運(yùn)行，2n軸運(yùn)行和 6 中心運(yùn)行。在本例中，我們將其轉(zhuǎn)化為 8 個(gè)階乘點(diǎn)，6 個(gè)軸向點(diǎn)和 6 個(gè)中心重復(fù)。根據(jù)公式N=2n+2n+nc共得到 20 個(gè)處方。其中，n是因數(shù)的個(gè)數(shù)。Nc是中心點(diǎn)的數(shù)量（6 個(gè)重復(fù)）。自變量被編碼為 +1 和 1，分別表示 8 個(gè)階乘點(diǎn)的低和高水平。6 個(gè)軸向點(diǎn)位于 (±α,0,0)，(0,±α,0)，(0,0,±α)，在中心 (0,0,0) 進(jìn)行 6 個(gè)重復(fù)，檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)誤差和數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。其中α為軸向點(diǎn)到中心的距離。使設(shè)計(jì)可旋轉(zhuǎn)，其值固定在 1.732?？尚D(zhuǎn)性α的值取決于實(shí)驗(yàn)中參數(shù)的個(gè)數(shù)，由公式：α=Np1/4決定。

響應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)果采用最優(yōu)二次模型確定，具體公式如下：

其中，Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)，b為線性效應(yīng)，b0為偏移項(xiàng)，bi為平方效應(yīng)，Xi是被考慮變量的編碼值多項(xiàng)式模型的擬合質(zhì)量，用相關(guān)系數(shù)（R2）表示。使用F值（Fisher 變異比）、概率值（Prob ＞F）進(jìn)一步解釋所使用模型的重要性和充分性。

本實(shí)驗(yàn)選擇β-胡蘿卜素亞微乳處方以大豆油為油相、明膠為乳化劑、磷脂為助乳化劑，通過對(duì)三種主要成分分別進(jìn)行單因素考察，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法分析得到理論最優(yōu)處方。以大豆油用量（X1）、乳化劑用量（X2）和助乳化劑用量（X3）為自變量，以載藥量 EE（Y1）、粒徑Size（Y2）、離心穩(wěn)定性Ks（Y3）作為響應(yīng)值，用 Design-Expert 11 軟件進(jìn)行處方優(yōu)化，根據(jù)理論最優(yōu)處方進(jìn)行再驗(yàn)證，最終確定最優(yōu)處方。

1.4.6 方差分析和顯著性檢驗(yàn)

對(duì)載藥量 EE（Y1）、粒徑 Size（Y2）、離心穩(wěn)定性 Ks（Y3）進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。通過P值（P-value）的大小可知該結(jié)果是否具有顯著性差異。

1.4.7 殘差的正態(tài)概率

如果殘差的正態(tài)概率圖中的數(shù)據(jù)分布為一條直線，就表明該組正態(tài)分布的結(jié)果較好。

1.4.8 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè)

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用 Design-Expert 11 軟件建立數(shù)學(xué)模型，通過確定某一實(shí)驗(yàn)變量，控制另兩組實(shí)驗(yàn)變量，利用軟件繪制出三維效應(yīng)面模型。

1.4.9 理論最優(yōu)處方

運(yùn)用 Design-Expert 11 軟件，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到理論最優(yōu)處方。

1.5 最優(yōu)處方確證

根據(jù) Design-Expert 11 軟件預(yù)測(cè)的最優(yōu)處方（No.1）配比，制備理論最優(yōu)處方β-胡蘿卜素亞微乳。并對(duì)其載藥量 EE（Y1）、粒徑 Size（Y2）、離心穩(wěn)定性Ks（Y3）進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 模擬體內(nèi)藥物釋放

人體在補(bǔ)充β-胡蘿卜素時(shí)，只有β-胡蘿卜素具有良好的生物可利用性時(shí)才有益于健康，這只能通過消化來(lái)確定[25-27]。雖然利用人體來(lái)研究生物利用度是理想的，但由于成本高、個(gè)體間差異大以及實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，在體內(nèi)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)是不切實(shí)際的。因此，本實(shí)驗(yàn)選用體外釋放模擬實(shí)驗(yàn)，其重復(fù)性高、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短并且可以同時(shí)檢測(cè)大量樣品，在藥物制劑研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

配置釋放介質(zhì)為 pH 7.4 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉（10 mmol·L-1）和十二烷基硫酸鈉緩沖液用于模擬人體體液環(huán)境。將制得的最優(yōu)處方β-胡蘿卜素亞微乳裝入透析袋中作為實(shí)驗(yàn)組，將濃度相同的β-胡蘿卜素-十二烷基硫酸鈉水溶液裝入相同的透析袋中作為對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組透析袋同時(shí)分別放入盛有 100 mL 釋放介質(zhì)的燒杯中，置于水溫恒定為 37 ℃ 的搖床中，模擬體內(nèi)藥物釋放。在 0.5、1、2、4、6、16、24 h 時(shí)間段分別精密吸取 3 mL 釋放溶液，同時(shí)補(bǔ)加 3 mL 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。在特征波長(zhǎng) 451 nm 處測(cè)定各個(gè)時(shí)刻的釋放溶液的吸光度，得到時(shí)間-釋放度曲線。

1.7 透射電鏡觀察

采用磷鎢酸負(fù)染法制備β-胡蘿卜素亞微乳透射電鏡樣品。樣品稀釋到合適濃度后，吸取 10 μL稀釋后的樣品滴于在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，滴加 pH 7.0 的 2%（w/ v）磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染 1 min。用濾紙吸取剩余液體，于室溫自然揮干后，置于透射電子顯微鏡下觀察β-胡蘿卜素亞微乳的形態(tài)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和專屬性實(shí)驗(yàn)

用紫外分光光度儀對(duì)β-胡蘿卜素異丙醇溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在 特征波長(zhǎng) 451 nm 處呈現(xiàn)特征吸收峰。再分別測(cè)定各溶液在特征波長(zhǎng) 451 nm 處的吸光度。以吸光度（A）對(duì)濃度（C）進(jìn)行線性回歸：A=0.011 5C+0.097 4（R2=0.999 5）。表明在該濃度范圍內(nèi)，吸光度（A）與濃度（C）曲線呈良好的線性關(guān)系，能用于后續(xù)β-胡蘿卜素含量的測(cè)定。

β-胡蘿卜素亞微乳和空白乳劑在 200～800 nm 的波長(zhǎng)下掃描測(cè)定的吸收光譜如圖 2、圖 3.結(jié)果表明，β-胡蘿卜素異丙醇溶液在特征波長(zhǎng) 451 nm 處呈現(xiàn)特征吸收峰?？瞻兹橐褐衅渌煞衷讦?胡蘿卜素亞微乳全波長(zhǎng)掃描中沒有出現(xiàn)特征峰，不會(huì)影響后續(xù)β-胡蘿卜素亞微乳的含量測(cè)定。

Fig.2 The full wavelength scan of β-Carotene圖2 β-胡蘿卜素全波長(zhǎng)掃描圖

Fig.3 The full wavelength scan of blank emulsion圖3 空白乳劑全波長(zhǎng)掃描圖

2.2 處方設(shè)計(jì)優(yōu)化的確定

2.2.1β-胡蘿卜素亞微乳的離心穩(wěn)定性考察

計(jì)算公式中的Ks值越小，代表該處方制得的β-胡蘿卜素亞微乳中分散的乳滴在離心力作用下上浮或下沉的數(shù)量越少，即所制備的β-胡蘿卜素亞微乳穩(wěn)定性越高（見圖 4）。

Fig.4 The photo of β-carotene sub-milk centrifugal layering圖4 β-胡蘿卜素亞微乳離心分層

2.2.2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)（Central Composite Design,CCD）

本組實(shí)驗(yàn)考察因素的水平的代碼值分別為 ±1.732、±1 和 0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果見表 1、表 2。

Table 1 Independent variables and their correspondent values in coded and physical form表1 各個(gè)因素水平的代碼及實(shí)際操作物理量

Table 2 Experimental arrangement and results of central composite design表2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果

2.2.3 方差分析和顯著性檢驗(yàn)

載藥量 EE（Y1），粒徑 Size（Y2），離心穩(wěn)定性Ks（Y3）的方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果分別見表 3、表 4 和表 5，當(dāng)P＜ 0.05 時(shí)即表示該變量具有顯著性差異[28]。

對(duì)表 3、表 4 和表 5 進(jìn)行分析，粒徑 Size（Y2），離心穩(wěn)定性 Ks（Y3）項(xiàng)的P＜ 0.05，均具有顯著性差異，而載藥量 EE（Y1）的P＞0 .05，顯著性差異不夠明顯。

回歸方程如下：

Y1=20.137 5 -1.181 9X1-1.303 1X2-1.447 9X3-0.487 5X1X2-1.887 5X1X3+0.487 5X2X3-0.042 3X12 -2.845 0X22 -1.461 7X32 (R2=0.503 9,P＜ 0.000 1,F＞ 0.05)

Y3=26.109 5 -1.459 6X1-0.871 6X2-0.213 7X3-1.368 7X1X2-1.743 7X1X3-4.068 7X2X3-6.585 4X12 -0.847 7X22 -2.522 7X32 (R2=0.976 2,P＜ 0.000 1,F＞ 0.05)

Table 3 ANOVA for response surface quadratic model of Y1表3 響應(yīng)面模型對(duì) Y1 的方差分析

Table 4 ANOVA for response surface quadratic model of Y2表4 響應(yīng)面模型對(duì) Y2 的方差分析

Table 5 ANOVA for response surface quadratic model of Y3表5 響應(yīng)面模型對(duì) Y3 的方差分析

2.2.4 殘差的正態(tài)概率圖

如圖 5、圖 6、圖 7 所示，本次實(shí)驗(yàn)所得到載藥量 EE（Y1）、粒徑 Size（Y2）、離心穩(wěn)定性Ks（Y3）三組數(shù)據(jù)的分布都接近一條直線，表明載藥量 EE（Y1），粒徑 Size（Y2），離心穩(wěn)定性Ks（Y3）三組數(shù)據(jù)都符合正態(tài)分布。

Fig.5 Residual normal probability diagram of effect surface: EE圖5 載藥量效應(yīng)面的殘差正態(tài)概率圖

Fig.6 Residual normal probability diagram of effect surface: Size圖6 粒徑效應(yīng)面的殘差正態(tài)概率圖

Fig.7 Residual normal probability diagram of effect surface: Ks圖7 離心穩(wěn)定性效應(yīng)面的殘差正態(tài)概率圖

2.2.5 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè)

在載藥量 EE、粒徑 Size、離心穩(wěn)定性Ks的響應(yīng)面圖中，響應(yīng)面的曲率越大或越小，表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大。在等高線圖中，等高線越大或越小，表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大。具體結(jié)果見圖 8～圖 13。

Fig.8 Predicted response surface of Y1 as a function of X1 and X2圖8 Y1 對(duì) X1 和 X2 用量的預(yù)測(cè)效應(yīng)面

Fig.9 Contour map of Y1 as a function of X1 and X2圖9 Y1 對(duì) X1 和 X2 用量的等高線圖

Fig.10 Predicted response surface of Y2 as a function of X1 and X2圖10 Y2 對(duì) X1 和 X2 用量的預(yù)測(cè)效應(yīng)面

Fig.11 Contour map of Y2 as a function of X1 and X2圖11 Y2 對(duì) X1 和 X2 用量的等高線圖

Fig.12 Predicted response surface of Y3 as a function of X1 and X2圖12 Y3 對(duì) X1 和 X2 用量的預(yù)測(cè)效應(yīng)面

Fig.13 Contour map of Y3 as a function of X1 and X2圖13 Y3 對(duì) X1 和 X2 用量的等高線圖

2.2.6 理論最優(yōu)處方

如表 6、表 7 所示，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明軟件預(yù)測(cè)的最優(yōu)處方配比（No.1）為：5.00 % 的大豆油、0.729 % 的磷脂、0.200 % 的明膠。

Table 6 Constraints for formula and response表6 響應(yīng)值與效應(yīng)值的限制

Table 7 The preparation of submicron emulsion solutions表7 亞微乳處方優(yōu)化方案

2.3 最優(yōu)處方驗(yàn)證

軟件預(yù)測(cè)的最優(yōu)處方（No.1）配比如圖 14 所示：5.00 % 大豆油、0.200 % 明膠、0.788 %磷脂。

Fig.14 The best prescription predicted by the software圖14 軟件預(yù)測(cè)最優(yōu)處方

理論最優(yōu)處方的載藥量 EE（Y1）、粒徑 Size（Y2）、離心穩(wěn)定性Ks（Y3）結(jié)果見表 8。

Table 8 Predicted and measured values of Y1,Y2,Y3 and bias prepared according to the optimal experimental conditions (X1=-1,X2=-1,X3=-1)表8 最優(yōu)處方下制劑的 Y1、Y2、Y3 的理論值與實(shí)測(cè)值及其偏差（X1=-1,X2=-1,X3=-1）

由表 7 的驗(yàn)證結(jié)果可知，根據(jù)預(yù)測(cè)最優(yōu)處方制備的β-胡蘿卜素亞微乳的載藥量 EE（Y1）、粒徑 Size（Y2）的實(shí)際值和理論之間相對(duì)偏差較低。而離心穩(wěn)定性Ks（Y3）實(shí)際值和理論值之間的相對(duì)偏差較高。但是，最優(yōu)處方離心穩(wěn)定性的實(shí)際值優(yōu)于理論值。表明該模型較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)了最優(yōu)處方，可以很好地協(xié)助試驗(yàn)，減少試驗(yàn)次數(shù)，提高試驗(yàn)精準(zhǔn)度。

2.4 模擬體內(nèi)藥物釋放

如圖 15 所示，從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的β-胡蘿卜素釋放曲線可得對(duì)照組的釋放度大于實(shí)驗(yàn)組。表明明膠修飾的β-胡蘿卜素亞微乳具有一定的緩釋作用。

Fig.15 In vitro release curves of β-carotene submicron emulsion圖15 β-胡蘿卜素亞微乳體外釋放曲線

2.5 透射電鏡觀察

明膠修飾β-胡蘿卜素亞微乳透射電鏡如圖 16。結(jié)果表明明膠修飾的β-胡蘿卜素亞微乳為圓球形，粒徑分布較均勻，粒子分散不聚集，其平均粒徑在 300～400 nm 左右。

Fig.16 Transmission electron micrograph of β-carotene submicron emulsion圖16 β-胡蘿卜素亞微乳透射電鏡圖

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法建立可信的數(shù)學(xué)模型。已知三個(gè)因素的大致可取范圍，運(yùn)用Design-Expert 11 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化處理與分析，減少評(píng)估各參數(shù)的主要影響及各因素相互作用所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

通過數(shù)學(xué)建模的方法，得出各因素的回歸方程。正值表示各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的正相關(guān)，負(fù)值表示各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的負(fù)相關(guān)。通過t檢驗(yàn)在P＜ 0.05，刪除掉多余冗雜的系數(shù)項(xiàng)后，再進(jìn)行非線性估計(jì)，最終達(dá)到優(yōu)化簡(jiǎn)化模型，提高精確度的目的?；貧w方程如下：

Y1=20.137 5 -1.181 9X1-1.303 1X2-1.447 9X3-0.487 5X1X2-1.887 5X1X3+0.487 5X2X3-0.042 3X12 -2.845 0X22 -1.461 7X32 (R2=0.503 9,P＜ 0.000 1,F＞ 0.05)

Y3=26.109 5 -1.459 6X1-0.871 6X2-0.213 7X3-1.368 7X1X2-1.743 7X1X3-4.068 7X2X3-6.585 4X12 -0.847 7X22 -2.522 7X32 (R2=0.976 2,P＜ 0.000 1,F＞ 0.05)

Design-Expert 11 軟件預(yù)測(cè)到的最優(yōu)處方為：5.00 % 大豆油、0.200 % 明膠、0.729 % 磷脂。β-胡蘿卜素亞微乳的載藥量 EE（Y1）、粒徑 Size（Y2）的實(shí)際值和理論之間相對(duì)偏差較低，而離心穩(wěn)定性Ks（Y3）實(shí)際值和理論值之間的相對(duì)偏差較高。但是，最優(yōu)處方離心穩(wěn)定性的實(shí)際值優(yōu)于理論值，表明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所建立的數(shù)學(xué)模型能夠較好的應(yīng)用于β-胡蘿卜素亞微乳制劑的處方設(shè)計(jì)與優(yōu)化中。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的β-胡蘿卜素亞微乳通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法建立的數(shù)據(jù)模型能對(duì)β-胡蘿卜素亞微乳制劑的處方進(jìn)行較好的預(yù)測(cè)。此外，應(yīng)用 3D 響應(yīng)面和數(shù)學(xué)模型得出的輪廓圖來(lái)確定最佳處方，去除多余的實(shí)驗(yàn)步驟，減少試驗(yàn)次數(shù)，提高試驗(yàn)精準(zhǔn)度。能夠很好地用于β-胡蘿卜素亞微乳處方的篩選與亞微乳的制備。