腸道菌群代謝產(chǎn)物三甲胺N-氧化物在對骨質(zhì)疏松癥骨髓間充質(zhì)干細胞功能的影響及與骨質(zhì)疏松癥損害中的作用關系

陳智偉 孫艷 代丹嬌 張華清

(南方科技大學醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東 深圳 518000)

骨質(zhì)疏松癥(OP)是以骨密度降低、骨微結構破壞、脆性增加和骨折風險為特征的一種全身性疾病[1]。其具有潛在的破壞性后果和較高的累積骨折發(fā)生率,對公共衛(wèi)生造成重大的挑戰(zhàn)。與年齡相關的OP中,干細胞調(diào)節(jié)失衡可能是引起疾病發(fā)生的一項關鍵機制之一[2]。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是一種廣泛存在于骨髓腔中的干細胞,具有向多種類型的骨細胞分化并分泌多種調(diào)節(jié)骨代謝物質(zhì)的多功能細胞的潛能[3]。諸多研究[4-5]表明,在機體病理狀態(tài)下,BMSCs的功能發(fā)生了變化失調(diào),導致骨代謝失衡,最終導致OP的發(fā)生。研究[6]報道,腸道微生物區(qū)系通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)(如破骨細胞發(fā)生)、腸道鈣吸收、神經(jīng)遞質(zhì)(如5-羥色胺)釋放等來調(diào)節(jié)骨量。因此,明確腸道微生物具體調(diào)節(jié)機制有助于尋找新的生物標志物,掌握其與骨量紊亂的關系。三甲胺-N-氧化物(TMAO)是一種腸道微生物依賴的膳食膽堿代謝產(chǎn)物,已被證明與心血管風險呈正相關[7]。最近的一項研究[8]發(fā)現(xiàn),TMAO與年齡相關性OP密切相關。然而,關于TMAO如何影響骨代謝以及潛在的分子機制的研究較少。本研究旨在探討TMAO對BMSCs功能的影響,以明確TMAO在OP發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年1月在我院住院期間行骨密度檢查的老年OP患者20例。納入標準[9]:股骨頸骨密度T評分<-2.5SD;年齡<70歲;自愿參與本項研究;無其他基礎疾病。排除標準[10]:年齡≥70歲;存在其他基礎疾病。將20例OP患者納入研究組,選取相同年齡層的20例健康志愿者為對照組。所有病人均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批(LCYJ2021083)。

1.2方法

1.2.1材料 TMAO(貨號317594,Sigma-Aldrich,Burlington,MA,USA)、胎牛血清(FBS)(貨號12483020,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)、α-改良Eagle培養(yǎng)基(α-MEM)(貨號SH302265.01,Hyclone,Logan,Utah,USA)、成脂分化培養(yǎng)基(貨號RASMX-90031,Cyagen,Guangzhou,China)、成骨分化培養(yǎng)基(貨號RASMX-90021,Cyagen,Guangzhou,China)、活性氧(ROS)檢測試劑盒(貨號KGT010-1,KeyGen Biotech,南京,中國)、人氧化三甲胺(TMAO)ELISA試劑盒(貨號JL47698,江萊生物,北京,中國)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自CUSABIO生物技術公司(中國武漢)?？够罨疊細胞核因子κB輕鏈增強子(NF-κB)-p65(Cat#ab16502)的抗體購自Abcam(Cambridge,MA,USA)?？惯^氧化物酶體增殖物激活受體y(PPARγ)(目錄號AF6284)和runt相關轉錄因子2(RUNX2)(目錄號AF0313)的抗體獲自Affinity Biosciences(中國江蘇)。

1.2.2BMSCs的原代培養(yǎng)及特性研究 分離和擴增大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)。采用頸椎脫位法處死的6周齡大鼠,將其浸泡在75%的乙醇5～10 min,使用無菌手術器械,仔細分離完整的大鼠脛骨和股骨。骨髓細胞在1.073 g/mL Percoll密度梯度中沖洗和離心。從界面收集富集的細胞,用在加添加10%胎牛血清和、1%青霉素-鏈霉素-新霉素的α-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后,丟棄未貼壁細胞,用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌貼壁細胞兩次。每隔3 d加入和更換新鮮的完整培養(yǎng)液,第3～5代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3細胞增殖試驗 用不同劑量(0、50、100、200、400、600 μMmol/L)的TMAO三甲氧胺處理BV2細胞,觀察三甲氧胺對細胞活力的量效關系。用CCK8溶液在五個不同的時間段法評估細胞活力。使用微型平板閱讀器檢測450 nm處的吸光度,以便計算每個值并編繪制增殖曲線。

1.2.4活性氧測定 使用活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)活性氧的積累。將骨髓間充質(zhì)干細胞用不同濃度的氧化三甲胺處理48 h后,收集細胞,用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌兩次,再用二氯二氫熒光素二乙酸酯在37℃避光中孵育30 min。在用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌3次以完全去除任何未進入細胞的DCFH-DA后,用FACSCantoTM II流式細胞儀檢測活性氧水平。

1.2.5成脂和成骨分化 將BMSCs接種于12孔板中,用含10-7mmol地塞米松、10 mmol β-甘油磷酸酯和50 μ mmol抗壞血酸-2-磷酸的成骨誘導培養(yǎng)基或成脂誘導培養(yǎng)基(含10-6mmol地塞米松、0.2m mmol吲哚美辛、0.1m mmol胰島素、1m mmol 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)處理。在第14天,通過茜素紅S或油紅O染色來評估分化能力。為了形成鈣沉積,細胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌,并用70%乙醇固定15 min。細胞用0.5%茜素紅S(pH=4.1)室溫放置10 min,蒸餾水清洗3次。橙紅色染色顯示鈣沉積的位置和強度。光鏡下觀察細胞內(nèi)鈣沉積情況。脂肪滴形成用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌,10%甲醛固定30 min。在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌兩次后,細胞在新鮮稀釋的油紅O溶液中染色1 h。然后,去除污漬,用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞兩次。用倒置顯微鏡觀察油紅O染色的細胞圖像。

1.2.6細胞培養(yǎng)上清液中促炎癥細胞因子濃度的檢測 將骨髓間充質(zhì)干細胞分別加或不加TMAO處理12、24、48 h,收集細胞培養(yǎng)上清液。促炎細胞因子(IL-1、β、IL-6、TNF-α)用ELISA試劑盒檢測。

1.2.7Western印跡分析 細胞刺激48 h后,采用放射免疫沉淀試驗提取不同組蛋白,采用二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離總蛋白,并轉移至聚偏二氟乙烯膜中。然后將膜在含有5%脫脂奶粉的三緩沖鹽水中封閉1 h,之后與抗PPARγ(1:500)、C/EBP-α(1:1 000)、RUNX2(1:1 000)、OPN(1:1 000)、NF-κB(1:1 000)和GAPDH(1:2 000)的一抗在4 ℃孵育過夜。然后用TBST洗滌膜,用二抗孵育1 h。使用Pierce ECL Western Blotting底物檢測抗體反應條帶。使用Image J軟件分析條帶強度的定量。

2 結 果

2.1OP患者血清TMAO水平和正常人比較 TMAO濃度與骨密度呈顯著負相關(R2=-0.518,P=0.019)(見圖1A)。與正常組比較,骨質(zhì)疏松癥組TMAO濃度明顯升高(P=0.007<0.01)(見圖1B)。

2.2TMAO對BMSCs增殖的影響 通過檢測OP患者血液樣本中TMAO水平的變化,我們選擇了合適的TMAO濃度進行后續(xù)研究。在細胞增殖實驗中,結果表明,50和100 μM濃度的TMAO對細胞活力無明顯影響,而200～600 μM濃度的TMAO則以時間和劑量依賴的方式顯著抑制細胞的生長(見圖2)。

注:A.OP患者和正常人血清TMAO水平與骨密度相關性;B.采用ELISA法檢測OP患者和正常人血清TMAO水平。圖1 OP患者血清TMAO水平變化

圖2 不同TMAO濃度對BMSCs增殖的影響

2.3TMAO對BMSCs釋放活性氧和促炎細胞因子水平的影響 TMAO處理后BMSCs中活性氧的形成增加,尤其是當TMAO濃度在200～600 μM范圍內(nèi)時(圖3A、B)。根據(jù)這些結果,在后續(xù)的實驗中選擇了TMAO的濃度為200 μM。為闡明TMAO對BMSCs促炎細胞因子水平的影響,采用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中TMAO對BMSCs促炎細胞因子水平的影響。結果表明,與對照組比較,研究組IL-1β(P<0.001)、TNF-α(P<0.001)和IL-6(P<0.001)水平明顯升高(圖3C、D、E)。

注:(A)用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;(B)用平均熒光百分率表示ROS水平的變化;(C、D、E)用ELISA法測定促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)水平。圖3 TMAO對BMSCs活性氧釋放和促炎細胞因子水平的影響

2.4TMAO對BMSCs的影響 為了闡明TMAO對BMSCs成脂分化和成骨分化的影響,我們在成脂誘導培養(yǎng)基和成骨誘導培養(yǎng)基中分別加入和不加TMAO處理BMSCs、油紅O染色觀察脂肪滴形成情況、茜素紅染色觀察鈣沉積情況,結果表明,TMAO處理的細胞比對照細胞產(chǎn)生更多的脂肪滴,同時礦化結節(jié)減少(圖4A,B放大倍數(shù)見圖)。通過Western印跡分析進一步檢測相應的成骨(Runx2和OPN)或成脂(PPAR、γ和C/EBP-α)標志物的表達,結果表明,TMAO可上調(diào)PPARγ和C/EBp-α蛋白的表達,降低Runx2和OPN蛋白的表達(圖4C,D),提示TMAO對BMSCs成脂分化有促進作用,但對成骨分化有抑制作用。

2.5TMAO通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)BMSCs功能 NF-κB信號通路已被證明在骨代謝的調(diào)節(jié)中起著關鍵作用。我們檢測NF-κB蛋白水平,以確定NF-κB信號通路是否參與了三甲氧胺誘導的BMSCs分化功能。結果表明:無論是單次注射還是單次注射TMAO,BMSCs中NF-κB蛋白的表達水平均在氧化三甲胺存在的情況下升高(圖4C,D)。為確定NF-κB活性是否參與TMAO調(diào)節(jié)的BMSCs功能,我們應用NF-κB抑制劑BAY 11-7082阻斷NF-κB的活性,如圖5A和B所示,與TMAO處理組相比,BAY 11-7082處理組的活性氧水平顯著降低。同樣,ELISA結果顯示,BAY11-7082預處理可顯著降低TMAO誘導的促炎細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平(圖5C、D、E)。此外,經(jīng)TMAO處理的BMSCs進入OIM后,Bay11-7082處理組的Runx2蛋白表達和礦化結節(jié)明顯增加(圖5F,G)。以上結果表明NF-κB活性在氧化三甲胺處理BMSCs的細胞功能中起著至關重要的作用(圖5H)。

3 討 論

OP的特征是骨量和/或骨質(zhì)的減少導致骨骼脆性增強。骨強度不能在體內(nèi)直接測量,但骨密度與骨強度高度相關。因此,骨密度值經(jīng)常被用作預測骨折風險的關鍵臨床指標。在本研究中,TMAO水平與骨密度值呈顯著負相關,OP患者血清TMAO水平高于對照組,提示TMAO在OP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

最近的研究[11-13]表明,腸道微生物可能是骨生理學的關鍵調(diào)節(jié)因素。腸道微生物區(qū)系可以通過細菌修飾或通過它們的代謝物的作用來激活包括骨髓在內(nèi)的各種組織中的炎癥反應。TMAO是一種腸道微生物依賴的膳食膽堿代謝產(chǎn)物,已被證明與OP相關。在本研究中,BMSCs經(jīng)三甲氧胺處理后,細胞增殖明顯下降,而促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)水平明顯升高。此外,TMAO處理的BMSCs內(nèi)活性氧的產(chǎn)生呈劑量依賴性增加。提示TMAO對BMSCs功能的影響可能是通過激活炎癥反應實現(xiàn)的。目前,OP被廣泛認為是由BMSCs代謝異常引起的疾病。許多證據(jù)表明[14-15],OP的BMSCs在內(nèi)在信號上存在缺陷,導致功能改變,導致成骨分化能力低下,有利于增加脂肪生成。本研究發(fā)現(xiàn)TMAO對BMSCs成脂分化有誘導和促進作用,但對BMSCs成骨分化有抑制作用。成脂分化標志蛋白PPARγ和C/EBp-α表達上調(diào),成骨分化蛋白Runx2和OPN表達下調(diào)。這些結果證實了TMAO通過調(diào)節(jié)BMSCs的分化參與了OP的發(fā)生發(fā)展。

NF-κB是炎癥和骨重建過程的主要調(diào)節(jié)者。NF-κB活性的增加伴隨著骨吸收的增強和骨形成能力的降低[15]。本研究顯示TMAO處理后NF-κB p65表達增加。為確定NF-κB的調(diào)節(jié)是否與TMAO介導的BMSCs功能有關,用NF-κB的特異性抑制劑BAY 11-7082預處理細胞2 h,然后用TMAO處理。結果表明,NF-κB抑制劑BAY11-7082能顯著降低BMSCs促炎細胞因子(IL-1β、α和IL-6)的產(chǎn)生和活性氧的釋放,與TMAO治療組相比(P<0.05)。此外,Bay11-7082可顯著逆轉Runx2(P<0.05)和鈣結節(jié)的表達。然而,這項研究有幾個局限性。首先,樣本量相對較小,需要更大的樣本量才能擴大研究范圍。其次,盡管本研究證實TMAO通過NFκB信號通路調(diào)節(jié)骨BMSCs的功能(包括細胞增殖、細胞分化和炎癥反應),但也可能涉及其他信號通路(如自噬信號通路),這需要進一步的驗證。最后,TMAO對BMSCs成骨分化的抑制作用還有待體內(nèi)實驗進一步驗證。

綜上所述,TMAO水平與骨密度值呈顯著負相關。TMAO通過上調(diào)NF-κB信號通路抑制BMSCs增殖,增加促炎性細胞因子的產(chǎn)生和活性氧的釋放,抑制成骨分化,促進成脂分化,可能導致骨代謝失衡,加重骨丟失,進而導致OP的發(fā)生。(圖4、圖5見封三)。