基于電子鼻技術(shù)的黃精霉變快速無損鑒別研究

拱健婷，關(guān)佳莉，李 莉*，梁 如，于淑琳，叢 悅，趙藝萌，徐媛媛，鄒慧琴*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京市中醫(yī)藥研究所，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京102488）

黃精為百合科植物滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricumRed.或多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua.的干燥根莖[1]，作為傳統(tǒng)中藥在我國沿用已久。2002 年黃精被列入《既是食品又是藥品的物品名單》，至今也是國家衛(wèi)生健康委員會公布的藥食同源品種[2-3]。因其具有藥食同源的特性，黃精具有較高的經(jīng)濟價值，以黃精為原料研發(fā)出的中成藥或湯藥、保健品、食品、化妝品等市場需求量逐步增長。截至2019 年，我國注冊黃精保健食品達(dá)351 種[4]，黃精的年需求量為3 500 ～ 4 000 t[5]。但是由于黃精富含多糖，因此黃精貯藏過程中極易產(chǎn)生霉變變質(zhì)現(xiàn)象。黃精每年因霉變造成較大的損失，霉變黃精早期的檢測與診斷對保證其質(zhì)量具有重要的作用。此外，霉變會導(dǎo)致中藥有效成分大量流失，影響臨床療效；霉變中藥真菌產(chǎn)生的多種真菌毒素會對患者的肝臟、腎臟、神經(jīng)和造血系統(tǒng)等造成嚴(yán)重?fù)p害，甚至可能誘發(fā)癌癥，威脅健康，故有“霉藥不治病，甚至害人命”的說法[6-7]。因此，對黃精霉變進行檢測與診斷對于減少黃精經(jīng)濟損失和臨床用藥安全也具有重要意義。

目前評價中藥霉變的主要方法為性狀鑒定法和理化測定法，性狀鑒別存在主觀性、經(jīng)驗性，常規(guī)的真菌鑒定方法耗時費力且昂貴，無法滿足自動化、現(xiàn)場快速的檢測需求[8]。在中藥霉變過程中會有霉味、腐臭味、酸味或甜味等，這些氣味的主要成分是微生物產(chǎn)生的羥、醛、硫化物等，可以通過氣味變化了解中藥霉變情況。電子鼻是模擬人類嗅覺的智能感官儀器，其靈敏度很高，氣味的檢測限可達(dá)ppb 級甚至ppt級水平。關(guān)于電子鼻技術(shù)在霉變檢測中的應(yīng)用和研究主要集中于谷物大米[9]、玉米[10]、小麥[11]、燕麥[12]等，近年來電子鼻在草莓[13]、蘋果[14]和家電“霉味”[15]的檢測，及中藥肉豆蔻[16]、川芎[17]的霉變預(yù)警上的探索應(yīng)用也有報道，可見電子鼻在霉變檢測方面具有巨大潛力。為此，本研究采用電子鼻技術(shù)對黃精氣味信息進行檢測，獲取樣品的氣味指紋圖譜，再聯(lián)合模式識別算法分析，從而實現(xiàn)快速識別黃精是否發(fā)霉。

1 材料與方法

1.1 藥材

6 批黃精樣品均于2019 年7 月采集于遼寧省瓦房店市，經(jīng)北京市中醫(yī)藥研究所李莉研究員鑒定為百合科植物黃精Polygonatum sibiricumRed.的干燥根莖。3 批未霉變黃精（HJ5、HJ6、HJ7）；3 批霉變黃精樣品為2019 年7 月至2021 年7 月儲藏過程中霉變所取樣品（MHJ5、MHJ6、MHJ7），霉變黃精藥材表觀顏色加深，可聞到異味，明顯觀測到生長的菌絲體。樣品儲存于北京市中醫(yī)藥研究所。

1.2 儀器

α-FOX3000 型電子鼻（法國Alpha M.O.S.公司），包括HS-100 型自動頂空取樣器、空氣發(fā)生器和12 根金屬氧化物傳感陣列（LY 型傳感器LY2 /LG、LY2 /G、LY2 /AA、LY2 /GH、LY2 /gCTL、LY2 /gCT 構(gòu)成Sensorchamber1，TP 型傳感器T30 /1、P10 /1、P10 /2、P40 /1、T70 /2、PA/2 構(gòu)成Sensorchamber 2），每根傳感器對揮發(fā)性成分的響應(yīng)性能不同，見表1[18]；FW-135 型中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；BS-124S 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

表1 α-FOX3000 型電子鼻傳感器及其檢測范圍Tab.1 α-FOX3000 electronic nose sensors and its detection range

1.3 黃精氣味檢測方法

1.3.1 檢測參數(shù) 參照于淑琳[19]方法進行黃精氣味檢測，檢測參數(shù)如下：載氣流速為150 mL/min；攪動速度為250 r/min；進樣體積為2 500 μL；注射速度為2 500μL/s；注射針溫度為60℃；數(shù)據(jù)采集時間為120 s；采集周期為1 s；延遲時間為600 s。

1.3.2 樣品制備 分別精密稱取0.3 g 黃精/霉變黃精樣品粉末（65 目標(biāo)準(zhǔn)篩），裝入10 mL 頂空進樣瓶，加蓋密封，放入電子鼻自動進樣器樣品盤中進行檢測，獲取氣味指紋圖譜見圖1。每份樣品平行檢測6次。

圖1 樣品的氣味指紋圖譜Fig.1 Odor fingerprint of sample

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

黃精的氣指紋圖譜由12 根傳感器的120 s 數(shù)據(jù)組成，通常選取峰值或波谷作為特征點，通常同一樣品此處的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，不同樣品之間的差異通常最大[20]，因此，在數(shù)據(jù)分析中，選擇12 根傳感器響應(yīng)絕對值的最大點響應(yīng)值為分析指標(biāo)。利用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進行t檢驗、主成分分析、聚類分析、逐步判別分析，simca-p 13.0 進行偏最小二乘判別和VIP 分析，Origin7.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精與霉變黃精電子鼻響應(yīng)值分析

黃精與霉變黃精在電子鼻12 根傳感器上的響應(yīng)值見圖2，可以看出霉變黃精在12 根傳感器上的響應(yīng)絕對值均高于黃精。對所采集的樣品響應(yīng)值進行分析，通過四分位距法剔除異常數(shù)據(jù)（HJ7-1）后進行t檢驗，結(jié)果顯示黃精與霉變黃精在電子鼻12 根傳感器上的響應(yīng)值均存在極顯著差異（P＜0.001），見表2，黃精與霉變黃精氣味差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以黃精響應(yīng)值為參照，計算二者的差異率，結(jié)果顯示黃精與霉變黃精的氣味在傳感器差異率在6.839 5% ～122.873 9%，在傳感器S1 上差異率最小，在傳感器S2 上差異率最大，且在S2、S3、S6、S11 的響應(yīng)值差異率均超過 80% ，是黃精霉變氣味特征的重要區(qū)別點，其中，S6 響應(yīng)值差異率較大（110.751 3%）也與電子鼻傳感器 S6 對黃精及霉變黃精響應(yīng)值較低存在一定的關(guān)系。說明揮發(fā)性氣味特征差異為電子鼻的分析檢測提供了可能，基于氣味進行黃精霉變與否的鑒別是可行的。

圖2 黃精與霉變黃精電子鼻響應(yīng)值散點圖Fig.2 Scatter Chart of Rhizoma Polygonatum and moldy Rhizoma Polygonatum

表2 黃精及霉變黃精的電子鼻傳感器響應(yīng)值Tab.2 Response value of Rhizoma Polygonatum and moldy Rhizoma Polygonatum

2.2 黃精與霉變黃精判別模型的建立

2.2.1 主成分分析 主成分分析（PCA）是電子鼻構(gòu)建判別模型時常用的統(tǒng)計方法，其可以消除數(shù)據(jù)中相互重疊的信息，將電子鼻12 根傳感器的特征降維，實現(xiàn)用少數(shù)原始變量線性組合的關(guān)鍵變量表征原變量的數(shù)據(jù)特征[21-23]。對黃精與霉變黃精樣品電子鼻檢測數(shù)據(jù)進行PCA 分析，結(jié)果見圖3，第一主成分方差貢獻率為99.03%，第二主成分方差貢獻率為0.78%，二者累積方差貢獻率為99.81%，說明保留的兩個主成分包含了樣品原始特征中的大部分特征信息。

圖3 黃精與霉變黃精主成分分析得分圖Fig.3 Scatter chart of principal component analysis

黃精與霉變黃精在PCA 散點圖上明顯分為 2 個區(qū)域，PCA 分析能夠?qū)崿F(xiàn)黃精霉變與否的正確判別。黃精樣本主要分布在第二、三象限，除MJH5-5 外，霉變黃精樣品均分布在第一、四象限，兩類樣品間的差異明顯，且差別主要體現(xiàn)在信息權(quán)重較大的第一主成分上。進一步對12 根傳感器進行Loadings 分析，發(fā)現(xiàn)傳感器S7、S8、S11、S12 對第一主成分的貢獻度最大。此外，黃精樣品電子鼻數(shù)據(jù)在主成分分析圖上相對集中，霉變黃精電子鼻數(shù)據(jù)在主成分分析圖上較為分散，可能與霉變黃精樣品霉變的程度存在一定的關(guān)系。

2.2.2 聚類分析 聚類分析是電子鼻數(shù)據(jù)處理中常用的模式識別算法之一。分層聚類分析是應(yīng)用最廣的聚類分析方法，是一種將研究對象分為相對同質(zhì)的群組的統(tǒng)計分析技術(shù)，分層聚類分析是依據(jù)個體或變量的數(shù)量關(guān)系來分類，客觀性較強[24]。將黃精與霉變黃精樣品電子鼻檢測數(shù)據(jù)進行聚類分析，根據(jù)歐式距離進行樣本的聚類，最終樣本聚為兩大類，黃精及霉變黃精樣品的分層聚類分析圖，見圖4，正判率為97.14%，其中僅一份霉變黃精樣本（MHJ5-5）被聚類到黃精樣品中，與主成分分析結(jié)果一致，其余聚類全部正確。在霉變黃精樣品中，MHJ5 樣本整體的電子鼻響應(yīng)值較MHJ6、MHJ7 樣本低，MHJ5-5 電子鼻響應(yīng)值較低，故錯判為未霉變黃精。

圖4 聚類分析結(jié)果Fig.4 Cluster analysis results

2.2.3 逐步判別分析 具有篩選能力的判別分析法統(tǒng)稱為逐步判別分析。在判別分析的過程中，往往有很多變量對判別結(jié)果有影響，但影響大小不一。當(dāng)判別變量較多時，適當(dāng)?shù)淖兞亢Y選有利于建立的判別函數(shù)的穩(wěn)定性。逐步判別分析的基本思想是采用“有進有出”的算法，即根據(jù)變量的重要性逐步引入變量，而最初引入的變量也可能因為后引入的新變量而失去其重要性被刪除。引入或刪除變量的每個步驟都需要進行統(tǒng)計檢驗，確保最終的判別函數(shù)只保留重要變量[25-26]。

71.43%的樣本（霉變黃精13 份，黃精12 份）被隨機抽取以形成訓(xùn)練集，剩余28.57%的樣本（霉變黃精、黃精各5 份）構(gòu)成測試集以評估所建逐步判別模型的性能。模型的F臨界值為2.09，兩類樣本間馬氏距離200.53。通過逐步判別分析，依次選入5 個變量S12、S1、S2、S5 和S4 作為判別分析的指標(biāo)。根據(jù)逐步判別函數(shù)系數(shù)，霉變黃精的判別函數(shù)為YMHJ= -1 837.41 + 28 310.58S1+ 7 047.37S2+ 6 737.68S4-13 593.4S5+ 106.96S12，黃精的判別函數(shù)為YHJ=-2 276.54 + 34 299.97S1+ 10 155.68S2+ 15 703.75S4-28 543.5S5- 368.39S12，基于上述函數(shù)訓(xùn)練集結(jié)果顯示兩類樣本的正判率均為100%，說明判別模型識別能力強。使用獲得的判別函數(shù)去判別測試集樣本，均判別正確，正判率為100%，見表3。通過判別分析，電子鼻可以區(qū)分黃精和霉變黃精，效果理想。

表3 黃精樣品逐步判別模型的建立與驗證結(jié)果Tab.3 Multivariate stepwise analysis model

2.2.4 偏最小二乘判別分析 PLS-DA 是一種集主成分分析、典型相關(guān)分析、多元線性回歸分析于一體的常用多變量分析方法。它具有清晰直觀的分析結(jié)果、較高的預(yù)測精度和廣泛的實用性，在中藥質(zhì)量評價和控制的過程中具有廣泛的應(yīng)用[27]。采用SIMCA-P13.0 軟件對黃精與霉變黃精樣品進行PLSDA 分析，表示模型擬合程度參數(shù)R2Y值為0.973，表示該模型預(yù)測能力參數(shù)Q2值為0.952，表明該模型具有良好的擬合度、較高的穩(wěn)定性和預(yù)測率。PLSDA 分析結(jié)果見圖5，兩種類型的樣品集中在兩個不同的區(qū)域，這表明黃精在霉變后氣味信息發(fā)生了顯著變化，PLS-DA可以實現(xiàn)黃精霉菌的快速準(zhǔn)確識別。

圖5 黃精與霉變黃精PLS-DA 分析（A）及VIP 分析(B)Fig.5 Score scatter plot of by PLS-DA（A）and VIP analysis（B）

變量重要性分析值（Variable Importance for the Projection，VIP）可以量化每個變量對分類模型的貢獻，便于篩選重要的分類變量。VIP 值越大，該變量在兩種樣本之間的差異就越顯著。對12 根傳感器的VIP 值進行排序，S7 ～ S12 VIP 值大于1，這表明以上指標(biāo)是判別模型中體現(xiàn)黃精與霉變黃精差異性的主要變量，對黃精霉變的分類鑒別具有顯著影響，而其余6 根傳感器的影響較小。此外，S7 ～ S12 為TP型傳感器，根據(jù)傳感器的性能，可能是黃精霉變后芳香族化合物、氨氣、胺類、甲烷、烷烴類成分種類及含量發(fā)生了顯著變化。

3 討論

霉變是常見中藥變質(zhì)現(xiàn)象之一，直接影響中藥的質(zhì)量與安全。準(zhǔn)確評價中藥霉變與否是藥品安全生產(chǎn)和使用的重要保障。目前，評價中藥霉變的主要方法是性狀鑒定法和理化測定法，前者最為常用。文獻報道，現(xiàn)存在霉變的中藥通過撞刷、搶水洗、沸水噴淋、酒洗、醋洗、油擦、熱炒、熱蒸等方法除去表面霉菌后干燥重新流入市場的現(xiàn)象，并且刷去霉菌的藥材和正常中藥很難區(qū)分，對鑒別者的經(jīng)驗要求很高，且某些藥物還存在假性霉變現(xiàn)象的干擾。隨著技術(shù)的發(fā)展，中藥微性狀鑒定法應(yīng)用到中藥霉變鑒別中，通過觀察藥材組織及表面的菌絲體和芽孢能鑒別出“水洗貨”霉變木瓜、霉變辛夷[28]；劉吉爽等[29]采用柱色譜、薄層色譜等技術(shù)分離制備了葵花盤霉變標(biāo)志物，對多糖、皂苷及蛋白質(zhì)含量較高的植物藥材的霉變評價具有一定的適用性；另外，酶聯(lián)免疫測定法[30]、膠體金免疫層析法[31]、高效液相色譜法[32]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]等應(yīng)用于霉變中藥多種真菌毒素的檢測。相較于依賴鑒別經(jīng)驗的傳統(tǒng)性狀鑒定法和復(fù)雜的常規(guī)真菌鑒定方法，電子鼻技術(shù)更為客觀便捷。電子鼻可以將傳統(tǒng)鑒定經(jīng)驗轉(zhuǎn)化為客觀數(shù)據(jù)，量化不同樣品之間的氣味差異，樣品預(yù)處理過程相對簡單，數(shù)據(jù)分析速度快。

本研究以黃精為研究載體，采用電子鼻技術(shù)提取黃精和霉變黃精氣味特征指紋，聯(lián)合無監(jiān)督的主成分分析、聚類分析及有監(jiān)督的逐步判別判別分析、偏最小二乘判別分析建立了黃精霉變與否定性鑒別模型。對比不同的判別模型結(jié)果，主成分分析中S7、S8、S11、S12 對第一主成分的貢獻度最大，逐步判別分析依次選入S12、S1、S2、S5、S4 共計5 個變量作為判別分析的指標(biāo)，偏最小二乘判別分析中貢獻度較大的傳感器為S7 ～ S12，不同判別模性中傳感器S12 對判別結(jié)果均有較大貢獻，另外主成分分析、偏最小二乘判別分析結(jié)果較為一致，TP 型傳感器對黃精霉變與否的氣味影響更為顯著。綜合來看，LY 型傳感器S1、S2、S4、S5 和TP 型傳感器S7 ～ S12 對黃精霉變判別模型貢獻較大，提示黃精霉變后氧化氣體、有機胺類、硫化物、短鏈烷烴、芳香族化合物等成分發(fā)生了變化?？梢噪娮颖欠治鼋Y(jié)果作為一個方向性的指導(dǎo)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜離子遷移譜等手段針對以上成分進行分析，進一步研究黃精霉變前后揮發(fā)性成分的構(gòu)成差異，為黃精霉變的有效鑒別提供科學(xué)的參考依據(jù)。研究結(jié)果表明，電子鼻技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)能有效地檢測到黃精與霉變黃精的氣味差異，無監(jiān)督和有監(jiān)督判別模型均可以準(zhǔn)確實現(xiàn)黃精霉變與否的定性鑒別，為黃精霉變評價提供了一種快速而有效的方法，在中藥霉變鑒別上有較好的應(yīng)用前景和推廣價值。

本研究依托黃精儲藏過程中自然霉變以獲取霉變樣品，故而收集到的樣品量少，導(dǎo)致樣品的代表性存在一定的局限性?；诖耍诮窈蟮难芯恐袘?yīng)收集更多、更具代表性的樣品，一方面進行模型驗證；另一方面，在本實驗判別模型的基礎(chǔ)上，可利用判別應(yīng)用中不斷累積的新資料進行完善，增加其可靠性，建立更完善的判別模型。此外，本研究只是對黃精霉變的初步探索，還有許多問題值得進一步研究，例如黃精與霉變黃精具體有哪些氣味成分的區(qū)別，它們是否與藥效成分有關(guān)，如何跟蹤黃精霉變過程中的氣味變化，找到即將發(fā)生霉變的最佳處理時刻來控制貯藏條件，從而減少黃精霉變的發(fā)生，課題組將繼續(xù)對黃精霉變氣味的物質(zhì)基礎(chǔ)進行進一步的探索。

4 結(jié)論

電子鼻技術(shù)可以實現(xiàn)黃精及霉變黃精氣味信息客觀化，霉變黃精電子鼻響應(yīng)絕對值顯著高于黃精。電子鼻結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法建立了黃精霉變與否的主成分、聚類、逐步判別、偏最小二乘判別模型，可以從整體氣味的角度實現(xiàn)對黃精霉變與否的快速無損鑒定，為黃精霉變快速檢測提供了方法參考，保障臨床用藥安全。