八號燒傷膏與燒傷凝膠治療大鼠燙傷的比較研究

宮 鵬 韓 碩 李成網(wǎng) 劉增輝 朱倩云

中藥復(fù)方制劑八號燒傷膏是由大黃炭、五倍子、地榆炭、冰片等組成，具有清熱解毒斂瘡，活血消腫生肌的作用，由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院20世紀(jì)70年代研制。經(jīng)臨床反復(fù)使用，發(fā)現(xiàn)其對各種原因引起的燒傷和燙傷均有顯著治療作用。目前，八號燒傷膏主要是采用麻油為基質(zhì)的油性膏劑，劑型單一。本研究利用安徽醫(yī)科大學(xué)在中藥復(fù)方制劑八號燒傷膏基礎(chǔ)上新開發(fā)的燒傷凝膠，考察比較八號燒傷膏與燒傷凝膠對大鼠皮膚Ⅱ度燙傷的治療效果，并測定給藥后大鼠血液中沒食子酸的含量及炎癥因子IL-6和抗炎因子IL-10水平，對八號燒傷膏和燒傷凝膠治療燙傷效果進(jìn)行藥效學(xué)比較和評價。明確八號燒傷膏及燒傷凝膠治療燙傷的優(yōu)缺點(diǎn)，從而豐富燒燙傷的臨床治療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 5周齡SPF雄性SD大鼠33只，體質(zhì)量（145±15）g[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2020-0009，動物合格證編號：202203580]，飼養(yǎng)于安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院SPF級動物房，保 持12 h/12 h（8:00-20:00）晝 夜 變 化，室 溫（23±2）℃，濕度40%~70%。自由飲食飲水，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 八號燒傷膏由大黃炭、五倍子、地榆炭、冰片等中藥組成，除輔料外，燒傷凝膠與燒傷膏中藥組成相同，生藥量比為1:1.75，均由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。試劑：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號110831-201906），水合氯醛（批號C804539），無水乙醚（批號20160917），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（C0105S），IL-6（YJ102828）及IL-10（YJ037371）ELISA試劑盒。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 TG16A臺式高速離心機(jī)，XP56百萬分之一天平，U3000高效液相色譜儀，Axio Scope.A1病理成像系統(tǒng)，JC-1087A全波長酶標(biāo)分析儀。

1.4 方法

1.4.1 造模與給藥[1]將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的大鼠隨機(jī)分為對照組（6只），模型組（7只），空白凝膠組（6只），燒傷膏組（7只），燒傷凝膠組（7只），每組單籠飼養(yǎng)。除對照組外，其他大鼠按以下方法造模：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉；先剃除后背部兩側(cè)毛發(fā)，再用脫毛膏脫毛，直至完全暴露出皮膚，隨后將置于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱的橫截面直徑為2 cm的柱狀鐵棒，立即置于大鼠背部已脫毛皮膚持續(xù)5 s進(jìn)行燙傷，形成直徑2 cm圓形創(chuàng)面。除對照組外，模型組涂抹純水，其他各組分別涂抹空白凝膠、八號燒傷膏及燒傷凝膠，八號燒傷膏及燒傷凝膠組給藥量（生藥量）均為0.01 g/g·d-1。建模后每天早晚兩次給藥，建模第0 d、第7 d，第14 d、第19 d對每組大鼠進(jìn)行稱重及拍照記錄，并按體質(zhì)量調(diào)整各大鼠的給藥劑量。

1.4.2 樣品收集 ①血漿樣品收集：第一次給藥后的0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h分別采用抗凝毛細(xì)管在眼眶取血方法，收集燒傷膏組大鼠和燒傷凝膠組大鼠血液，3000 rpm離心5 min后，收集血漿，-80 ℃暫存。另，造模給藥后14 d時，各組大鼠按以上方法收集血漿，用于ELISA析。②實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集創(chuàng)面皮膚組織，生理鹽水清洗后，置于4%福爾馬林溶液保存24 h后，4 ℃暫存，用于切片分析。

1.4.3 樣品分析 ①血漿中沒食子酸含量分析[2-3]：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用甲醇配制10.48 g/L、52.4 g/L、104.8 g/L、209.6 g/L、524 g/L、1048 g/L系列沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；供試品制備：取血漿20 L于1.5 mL EP管中，加入20 L的超純水和10 L 20%的維生素C水溶液，渦旋30 s后加入300 L乙酸乙酯，渦旋1min，4℃低溫7500 r/min離心10 min，取上清液于另一1.5 mL EP管中，氮吹至快干時停止，待自然揮發(fā)完全，向其中加入100 L 10%乙腈溶液，渦旋1 min移入進(jìn)樣瓶，待分析。色譜條件：色譜柱：島津ODS C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相：乙腈—0.1%檸檬酸溶液（10：90），檢測波長：273 nm，柱溫：25 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：40 μL。②皮膚創(chuàng)面進(jìn)行切片分析，取福爾馬林溶液浸泡后的組織，脫水處理并石蠟包埋，5 μm厚度切片后HE染色（具體步驟參照蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒），電子顯微鏡下觀察并拍照[4]。③參照ELISA試劑盒方法，分析血漿中促炎因子IL-6和抗炎因子IL-10水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間的差異采用t-test方法分析，若P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 八號燒傷膏及燒傷凝膠治療燙傷的效果分析 實(shí)驗(yàn)中定期對每組大鼠的燙傷創(chuàng)面進(jìn)行觀察拍照并記錄，同時對各組大鼠創(chuàng)面結(jié)痂掉落情況進(jìn)行記錄并統(tǒng)計(jì)（見圖2）。結(jié)果表明，燙傷造模后7 d時各處理組大鼠創(chuàng)面均結(jié)痂，持續(xù)至14 d時，模型組大鼠創(chuàng)面逐漸愈合，但仍有痂覆蓋，隨后在第16~19 d痂逐漸全部脫落。在造模后第12 d，空白凝膠組大鼠創(chuàng)面逐漸恢復(fù)，部分大鼠創(chuàng)面所結(jié)痂開始脫落，至18 d時，全部脫落。實(shí)驗(yàn)中觀察到八號燒傷膏處理組大鼠創(chuàng)面恢復(fù)較快，第11 d時，八號燒傷膏處理組大鼠創(chuàng)面逐漸恢復(fù)，部分大鼠創(chuàng)面痂脫落，到15 d時，痂全部脫落。燒傷凝膠處理組大鼠持續(xù)給藥后，凝膠堆積形成深色痂，持續(xù)至19 d時仍未見痂脫落。以上結(jié)果表明，相較于模型組，八號燒傷膏治療大鼠燙傷早6 d開始掉痂，治療效果最佳，而燒傷凝膠治療組大鼠創(chuàng)面均未有痂脫落，治療效果不及八號燒傷膏。見圖1。

圖1 不同時間大鼠燙傷創(chuàng)面恢復(fù)情況

圖2 大鼠燙傷后創(chuàng)面痂脫落情況

2.2 燙傷創(chuàng)面切片分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，收集創(chuàng)面皮膚組織，蘇木素－伊紅染色顯示模型組大鼠皮膚組織受損后逐漸恢復(fù)，見少量新生上皮，但上皮組織與皮下組織連接不緊密，八號燒傷膏組大鼠燙傷創(chuàng)面新生上皮層較厚，結(jié)構(gòu)緊密，恢復(fù)較好。燒傷凝膠給藥后大鼠創(chuàng)面也有新生成的上皮層，但厚度不及八號燒傷膏。見圖3。

圖3 大鼠皮膚燙傷創(chuàng)面恢復(fù)后病理切片（HE染色，40Ⅹ）

2.3 給藥后血漿中沒食子酸含量變化 藥物透皮吸收效果是決定燒燙傷藥物治療效果的關(guān)鍵，因此，實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法分析了八號燒傷膏及燒傷凝膠首次給藥后，大鼠不同時間點(diǎn)血漿中五倍子主要活性成分之一的沒食子酸含量。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、八位燒傷膏組和燒傷凝膠組樣品色譜圖分別見圖4A、圖4B和圖4C，保留時間為3.020 min的吸收峰為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品特征峰。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到如圖4D所示標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0001910x-0.003344，R2=0.9993，分 析 結(jié) 果見表1，造模后立即給予大鼠八號燒傷膏和燒傷凝膠，0.5 h后血漿中即可檢測到?jīng)]食子酸。給藥后4 h八號燒傷膏組和燒傷凝膠組大鼠血漿中沒食子酸濃度無顯著性差異。給藥后6 h八號燒傷膏組和燒傷凝膠組大鼠血漿中沒食子酸濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥后8 h，八號燒傷膏組和燒傷凝膠組大鼠血液中沒食子酸濃度達(dá)到最大，分別為（1164.9±226.11）g/L和（692.3±69.34）g/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥后10 h和12 h，八號燒傷膏組和燒傷凝膠組大鼠血漿中沒食子酸濃度逐漸降低，10 h時沒食子酸濃度差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；給藥12 h后血漿中沒食子酸濃度約降至最大濃度一半，無顯著性差異。組間差異性分析表明，給藥后八號燒傷膏組和燒傷凝膠組大鼠血漿中沒食子酸濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖4 大鼠燙傷給藥后血漿中沒食子酸含量分析

表1 不同時間點(diǎn)大鼠血漿中沒食子酸含量（g/L）

2.4 大鼠血漿中炎癥因子IL-6和IL-10的變化 燒燙傷易導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞過度活化，產(chǎn)生炎癥，過量的炎癥因子易導(dǎo)致傷口愈合緩慢，因此抑制炎癥是燒燙傷治療的重點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)中分析了大鼠給藥后第14天血液中炎癥因子IL-6和IL-10水平，結(jié)果表明，模型組大鼠血漿中促炎因子IL-6水平顯著上升，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），給予八號燒傷膏和燒傷凝膠治療14天后，IL-6水平均顯著下降（P＜0.05），但八號燒傷膏和燒傷凝膠組間無顯著性差異。與對照組相比，大鼠燙傷后，模型組及空白凝膠組血漿中抗炎因子IL-10水平與對照組相比無顯著性差異，八號燒傷膏組（P＜0.01）及燒傷凝膠組（P＜0.05）顯著上升。同時八號燒傷膏組IL-10水平也顯著高于燒傷凝膠組（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠血漿中IL-6和IL-10水平比較（pg/mL）

3 討 論

八號燒傷膏是目前臨床用于治療燒燙傷的常用外涂院內(nèi)制劑，其主要成分五倍子、地榆炭及冰片等均具有抑菌抗炎功效。另外，其含有的大黃炭還具有清熱瀉火、消腫止血功效，五倍子具有收濕斂瘡，地榆炭具有清熱解毒，消腫斂瘡的功效，而冰片具有清熱止癢生肌的功效[5-6]。復(fù)合以上中藥研制的八號燒傷膏，對燒燙傷有顯著的治療效果，在本研究中得到進(jìn)一步的確認(rèn)。目前八號燒傷膏劑型單一，開發(fā)如凝膠劑等其他劑型可有助于提高其適應(yīng)范圍。但本研究顯示，與八號燒傷膏相比，燒傷凝膠促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合效果不及八號燒傷膏。八號燒傷膏給藥后創(chuàng)面結(jié)痂，痂層較軟，不易積累硬化，對藥物透皮吸收影響較小，而燒傷凝膠多次給藥積累較厚痂層，對藥物透皮吸收影響較大。因此，八號燒傷膏給藥組痂較早脫落。HE切片分析表明，燒傷凝膠給藥后，有新生上皮形成，表明燒傷凝膠組雖然在實(shí)驗(yàn)中無痂脫落，但燙傷創(chuàng)面依然會愈合。與燒傷凝膠相比，八號燒傷膏給藥后，新生上皮層較厚，意味著八號燒傷膏對燙傷創(chuàng)面愈合效果較好，這可能與上述八號燒傷更易透皮吸收相關(guān)。

沒食子酸具有良好的抗炎抑菌功效，其是五倍子中重要活性成分之一，研究表明其能夠通過透皮吸收發(fā)揮功效，因此本研究以血漿中沒食子酸含量作為評價八號燒傷膏透皮吸收效果的指標(biāo)[7]。研究顯示，給藥后可在血液中檢測到?jīng)]食子酸，表明沒食子酸可透皮吸收入血。給藥后，八號燒傷膏組大鼠血漿中沒食子酸含量高于燒傷凝膠組，表明八號燒傷膏透皮吸收效果優(yōu)于燒傷凝膠，這與八號燒傷膏對燙傷治療效果優(yōu)于燒傷凝膠結(jié)果一致。另外，八號燒傷膏和燒傷凝膠給藥后8 h均達(dá)到最大血藥濃度，12 h時血藥濃度約為最大血藥濃度一半，即藥物半衰期約為12 h，因此，通過早晚兩次給藥可有效維持高血藥濃度，可達(dá)到滿意的治療燙傷效果。

燒燙傷會刺激創(chuàng)面免疫細(xì)胞大量分泌IL-6等促炎因子，引起全身炎癥反應(yīng)，IL-6水平可反映機(jī)體炎癥變化程度。IL-10 也是目前最常見的反應(yīng)抗炎的指標(biāo)之一，IL-10可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗炎因子的合成和釋放，抑制單核或巨噬細(xì)胞抗原表達(dá)。IL-10是重要的抗炎因子，可有效對抗炎癥介質(zhì)的生成，如IL-10可直接抑制T細(xì)胞產(chǎn)生IL-6[8]。有報道表明，SD大鼠深Ⅱ度燙傷后14天的傷口滲液及血漿中IL-6水平依然顯著升高[9]。大鼠燙傷后隨著促炎因子的產(chǎn)生，體內(nèi)IL-10等抗炎因子也相應(yīng)升高，給藥干預(yù)后還可顯著提高IL-10水平，抑制炎癥[8，10]。在本研究中造模14天后，模型組IL-6水平顯著高于對照組，表明大鼠體內(nèi)有炎癥反應(yīng)，與已有研究報道一致。給藥后IL-6水平均顯著降低，同時，IL-10水平顯著升高，且八號燒傷膏組IL-10顯著高于燒傷凝膠，表明八號燒傷膏及燒傷凝膠能夠顯著抑制由于燙傷而導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，且八號燒傷膏抗炎效果更好，這與八號燒傷膏給藥后治療效果優(yōu)于燒傷凝膠的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，與燒傷凝膠相比較，八號燒傷膏具有更好的透皮吸收效果和抗炎效應(yīng)，對大鼠深Ⅱ度燙傷具有顯著的治療效果。該研究結(jié)果可為八號燒傷膏的廣泛應(yīng)用提供依據(jù)和理論基礎(chǔ)。