蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13對松材線蟲生理生化指標的影響1)

潘敏 許嘉麟 談家金 孫玉鳳 葉建仁

(南京林業(yè)大學,南京,210037)

松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一種可危害黑松(PinusthunbergiiParlatore)、馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、火炬松(PinustaedaL.)、黃松(PodocarpusimbricatusBl. Enum. Pl. Jav.)等多種松樹的病害[1-3]。松材線蟲主要由松墨天牛(Monochamusalternatus)、云杉花墨天牛(M.saltuarius)等為媒介昆蟲進行遠距離傳播,在感病30～40 d后,寄主松樹枯死[4]。松材線蟲病在我國首次被發(fā)現(xiàn)是在1982年,自此,該病害侵害范圍不斷擴大,已經(jīng)蔓延至我國多個省市地區(qū)[5]。由于松材線蟲病具有快速傳播性和高度危害性,導致其對全世界多種松樹資源都存在著巨大威脅,該病的防控已成為世界性的難題[6]。

近年來,生物防治逐漸進入大眾視野,其最突出的特點就是不污染環(huán)境,與化學防治相比,具有較強的環(huán)境友好性[7-8]。微生物是生物防治的重要組成部分,而細菌因易于繁殖、生產(chǎn)簡單等優(yōu)點,在生物防治中被廣泛應用[9-11],其中又以芽孢桿菌菌劑應用較為廣泛[12-14]。Li et al.[11]從馬尾松中分離得到短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)LYMC-3,其代謝產(chǎn)物中的胍類化合物能對松材線蟲產(chǎn)生明顯抑殺作用。徐華潮等[15]研究發(fā)現(xiàn)2株蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)020和RBT-200701的胞外毒素對松材線蟲表現(xiàn)出較強的殺線蟲活性。

氧自由基的化學反應活性高,極不穩(wěn)定,易與其他物質(zhì)發(fā)生化學反應,直接或間接造成細胞結構的破壞,從而導致細胞凋亡[16]。而氧自由基能被松材線蟲體內(nèi)的過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)清除,減少氧自由基對線蟲的危害[17-18]。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)能夠催化谷胱甘肽(GSH)與活性氧反應,減輕活性氧對線蟲的損害[19]。丙二醛(MDA)是常見的膜脂過氧化指標,MDA的質(zhì)量摩爾濃度與線蟲氧化損傷程度呈正相關[20-22]。因此,檢測線蟲體內(nèi)MDA的質(zhì)量摩爾濃度及SOD、POD、CAT、GSH-Px的活性可以反映機體被氧化損傷的程度。一般來說,乙酰膽堿酯酶(AchE)在突觸或神經(jīng)肌肉連接處,催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)的水解,同時終止神經(jīng)沖動,是松材線蟲不可或缺的酶[23-24]。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)NJSZ-13是從松樹體內(nèi)分離得到的一株生防菌,已知松材線蟲在NJSZ-13的菌懸液中處理48 h后,死亡率達到81.5%[25]。為了進一步明確菌株NJSZ-13的殺線機理,本研究在此基礎上,探究NJSZ-13菌株代謝產(chǎn)物對松材線蟲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、MDA質(zhì)量摩爾濃度、AchE和保護性酶(SOD、POD、CAT、GSH-Px)活性的影響,為研發(fā)微生物源殺線劑提供參考。

1 材料與方法

供試材料:蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株和松材線蟲AMA3蟲株來源于南京林業(yè)大學森林病理實驗室。

營養(yǎng)瓊脂(NA)固體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L,氯化鈉5 g/L,蛋白胨10 g/L,瓊脂20 g/L,pH為7.2～7.4。

營養(yǎng)肉湯(NB)液體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L,氯化鈉5 g/L,蛋白胨10 g/L,pH為7.2～7.4。

菌株NJSZ-13菌懸液和發(fā)酵濾液的獲得:挑取單個NJSZ-13菌落接入NB液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、200 r/min條件下?lián)u培4 d,即得發(fā)酵液。將發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min后,上清液用注射器經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得發(fā)酵濾液,沉淀菌體用等體積的無菌水懸浮即得菌懸液(菌體濃度為3×108個/mL)。

菌株NJSZ-13處理松材線蟲:采用浸漬法,將一定數(shù)量的松材線蟲(每個處理30 000條)用蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、菌懸液分別處理6、12、24、36 h后(對照用無菌水和NB液體培養(yǎng)基處理),于室溫條件下,以3 500 r/min離心5 min去除浸漬液,之后用無菌水沖洗沉淀3次,每個處理重復3次。

線蟲生理生化指標測定:將供試線蟲液與可溶性蛋白提取液混合于1.5 mL離心管中,用低溫預冷組織研磨儀(凈信JXFSTPRP-CL)將其研磨180 s,4 ℃、3 500 r/min條件下離心10 min,上清液即為組織勻漿液。線蟲可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定采用Bradford法[26],利用紫外分光光度計(Perkin Elmer Lambda 365)在波長595 nm處測量吸光值。其余6種指標(SOD、POD、CAT、GSH-Px的活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度和AchE活性)的測定按照蘇州科銘生物技術有限公司的試劑盒方法進行。

數(shù)據(jù)處理:采用Excel 2021進行數(shù)據(jù)整理,IBM SPSS Statistics 25軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結果與分析

2.1 菌株NJSZ-13對松材線蟲可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響如表1所示,對照組與處理組在整個處理時間均呈下降趨勢。前6 h,處理組松材線蟲體內(nèi)蛋白的質(zhì)量濃度緩慢下降,處理組與對照組差異顯著(p<0.05);6 h后,處理組松材線蟲體內(nèi)蛋白的質(zhì)量濃度急劇下降,發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理組尤為明顯,且極顯著地低于對照組(p<0.05)。由數(shù)據(jù)可知,3組處理組中,線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與對照組相比顯著下降(p<0.05),這是造成菌株NJSZ-13殺死松材線蟲的重要原因之一。

2.2 菌株NJSZ-13對松材線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響如表2所示,在整個處理時間內(nèi),SOD活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在0～12 h內(nèi),處理組松材線蟲體內(nèi)的超氧化物歧化酶活性均高于對照組。6 h時3組處理組高于對照組,差異顯著(p<0.05);在12 h時各處理組和對照組結果相近,無顯著性;在24、36 h時,3組處理組低于2組對照組,差異顯著(p<0.05)。

表2 不同處理的松材線蟲超氧化物歧化酶活性

2.3 菌株NJSZ-13對松材線蟲過氧化物酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)過氧化物酶(POD)活性的影響如表3所示,菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲體內(nèi)的過氧化物酶活性在整個處理時間段均低于對照組。0～12 h時,菌懸液處理與對照組無顯著差別,24、36 h時顯著降低(p<0.05)。發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理后,與對照組相比,POD活性在處理后6、12 h存在顯著差異,在24、36 h時有極顯著差異(p<0.05)。

表3 不同處理的松材線蟲過氧化物酶活性

2.4 菌株NJSZ-13對松材線蟲過氧化氫酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同時間對松材線蟲體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的影響如表4所示,菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲體內(nèi)的過氧化氫酶活性的變化趨勢與POD相近,在處理6 h時,處理組與對照組有顯著差異(p<0.05);6 h后,CAT活性急劇下降,與對照組形成顯著差異(p<0.05)。

表4 不同處理的松材線蟲過氧化氫酶活性

2.5 菌株NJSZ-13對松材線蟲谷胱甘肽酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)谷胱甘肽酶(GSH-Px)活性的影響如表5所示,菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲體內(nèi)谷胱甘肽酶活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。菌懸液處理后,谷胱甘肽酶活性在6、12 h時,與對照差異不顯著,24、36 h時則顯著低于對照(p<0.05)。發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理后,谷胱甘肽酶活性在6 h時高于對照,但差異不顯著,隨后急劇下降,與對照組形成顯著差異(p<0.05)。

2.6 菌株NJSZ-13對松材線蟲丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度的影響如表6所示,松材線蟲體內(nèi)丙二醛質(zhì)量摩爾濃度在菌株NJSZ-13處理后的變化區(qū)別于其他幾種物質(zhì),呈現(xiàn)出上升趨勢。菌懸液處理后的松材線蟲,體內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度在6、12、36 h時較對照略高,無顯著差別,24 h時顯著高于對照(p<0.05)。發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理后的松材線蟲體內(nèi)的MDA質(zhì)量摩爾濃度在6、24 h時與對照有顯著差異(p<0.05),在12 h與對照組均達到極顯著差異水平(p<0.05),在36 h時發(fā)酵液處理與對照差異不顯著,發(fā)酵濾液處理與對照極顯著(p<0.05)。

表5 不同處理的松材線蟲谷胱甘肽酶活性

表6 不同處理的松材線蟲丙二醛質(zhì)量摩爾濃度

2.7 菌株NJSZ-13對松材線蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)活性的影響如表7所示,其中對照組和3組處理組的線蟲體內(nèi),AchE活性變化大體一致,均呈下降趨勢。處理6 h時,菌懸液處理與對照無顯著差異,發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理較對照顯著降低(p<0.05);處理12 h時,菌懸液處理酶活性降低,與對照組差異不顯著,發(fā)酵液和發(fā)酵濾液較對照極顯著降低(p<0.05);處理24、36 h時,菌懸液酶活性顯著降低,發(fā)酵液和發(fā)酵濾液均極顯著降低(p<0.05)。

表7 不同處理的松材線蟲乙酰膽堿酯酶活性

3 討論與結論

經(jīng)菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲SOD和GSH-Px的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。2種物質(zhì)的活性在處理前期升高,表明細菌處理導致線蟲啟動防御機制,引起活性氧迸發(fā),產(chǎn)生大量超氧自由基和過氧化物,機體以提高體內(nèi)SOD和GSH-Px活性開啟自身免疫反應。此后2種酶的活性下降,使線蟲體內(nèi)的氧自由基不能及時被清除,造成其抗氧化保護酶系統(tǒng)被破壞,最終導致線蟲死亡。隨著細菌處理時間的延長,線蟲另外2種保護性酶POD和CAT活性受到抑制,進一步導致超氧自由基和過氧化物不斷積累。蔣春艷[27]研究發(fā)現(xiàn)SOD、POD、CAT 3種保護酶在黃曲條跳甲抵抗綠僵菌引起的氧化脅迫中發(fā)揮了重要作用。李會平等[28]發(fā)現(xiàn)在桑天牛對白僵菌的免疫作用中,SOD和POD是首先發(fā)生作用的酶系,CAT是繼上述兩種酶之后發(fā)生作用的酶系,其中POD所起作用更為重要。經(jīng)菌株NJSZ-13處理后,線蟲體內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度不斷上升,說明了線蟲脂質(zhì)過氧化程度不斷加重,其細胞結構和功能持續(xù)受損,可能最終導致線蟲的死亡。

線蟲體內(nèi)的大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)為參與各種代謝的酶類,所以可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度是一個重要的生理生化指標。3組處理的松材線蟲體內(nèi),可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著低于對照,表明菌株NJSZ-13使松材線蟲體內(nèi)蛋白代謝受到嚴重影響。AchE是生物神經(jīng)傳導中的關鍵性酶,在神經(jīng)傳導調(diào)節(jié)中起重要作用[29]。試驗中發(fā)現(xiàn),菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲行動遲緩,反應遲鈍,一段時間后蟲體僵直死亡。這與其體內(nèi)的AchE活性降低,導致神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)無法正常水解,造成線蟲神經(jīng)傳導受到影響有關。侯金麗等[30]發(fā)現(xiàn),松材線蟲體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)關鍵酶(TChE)的活性受到Sr18菌代謝產(chǎn)物的顯著抑制,造成線蟲體內(nèi)乙酰膽堿的大量積累,使突觸后膜長期處于興奮狀態(tài),導致神經(jīng)傳遞中斷,引起線蟲的中毒反應。同時,翁群芳等[31]研究發(fā)現(xiàn),駱駝蓬提取物能抑制松材線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性,從而導致線蟲死亡。

在蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13處理松材線蟲的過程中可以發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液對松材線蟲的各項生理指標影響最為明顯,這與前期試驗中發(fā)酵液對線蟲的致死率最高相一致。通過菌株處理后線蟲的各個生理效應可以推測,菌株NJSZ-13對松材線蟲的致死作用是綜合性的,其中包括蛋白代謝、保護酶系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等方面的共同作用。在今后的研究中,可考慮從代謝組和轉錄組的角度,研究菌株處理后松材線蟲的重要代謝通路和關鍵酶基因的表達量變化,以期找出菌株NJSZ-13對松材線蟲的關鍵致死機制。