小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

韓志松 白俊艷 曾凡林 李靜云 何豫涵 陳夢柯 盧小寧

摘要：主要分析GHR、GHRH、GHRHR基因的多態(tài)性，以及其與小尾寒羊肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)，以期為優(yōu)質(zhì)綿羊新品種培育提供一定的參考依據(jù)。采用PCR技術(shù)，檢測小尾寒羊群體中GHR、GHRH和GHRHR基因的多態(tài)性，利用SPSS軟件分析以上3種基因的不同基因型與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，GHR與GHRHR共有3種基因型，分別為II、ID、DD，而GHRH基因僅檢測到2種基因型，分別為II、DD。GHR基因中II基因型頻率最高，為0.625，ID的基因型頻率為0.313，DD的基因型頻率最低，為0.063；多態(tài)信息含量（PIC）為0.283，處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50）；小尾寒羊GHR基因的DD基因型肉質(zhì)的色澤顯著低于ID、II基因型（P＜0.05）。GHRHR基因中II基因型頻率最高，為0.687 5，DD基因型頻率最低，為0.062 5，ID基因型頻率為0.2500；多態(tài)信息含量為0.258，處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50）；GHRHR基因的DD基因型的剪切力顯著高于ID、II基因型（P<0.05）。GHRH基因中DD基因型頻率最低，為0.437 5，II基因型頻率最高，為0.562 5；多態(tài)信息含量（PIC）為0.371，處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50）；GHRH不同基因型對于小尾寒羊的所有肉質(zhì)性狀影響不顯著（P>0.05）。綜上所述，GHR基因、GHRHR基因可以作為小尾寒羊提升肉質(zhì)品質(zhì)的候選基因之一。

關(guān)鍵詞：小尾寒羊；GHR基因；GHRHR基因；肉質(zhì)性狀；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：S826.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0145-05

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31201777）；博士啟動基金計劃（編號：20111148）；橫向課題（編號：橫20220047）。

作者簡介：韓志松（1977—），男，遼寧阜新人，碩士，助理研究員，研究方向為畜牧生態(tài)模式。E-mail：hanzhisongcy@163.com。

通信作者，白俊艷，博士，副教授，研究方向為動物分子育種。E-mail：junyanbai@163.com。

生長激素受體（growth hormone receptor，簡稱GHR）基因在1976年從兔的肝臟細(xì)胞的細(xì)胞膜上被發(fā)現(xiàn)［1］。GHR基因?qū)τ诩永＠麃喭玫纳L性能有促進(jìn)作用［2］，可以作為候選基因，用來改善該奶牛群體的相關(guān)性能［3］。GHR-F279Y位點苯丙氨酸的編碼T被酪氨酸編碼A取代，導(dǎo)致其脂肪、蛋白質(zhì)和乳的產(chǎn)量有所降低［4］。GHR基因的g.914T>A的T等位基因與肌肉以及乳房的大小呈現(xiàn)出正相關(guān)性［5］。GHR基因還可以為安納托利亞水牛早期選種提供一定的優(yōu)勢［6］。 生長激素釋放激素（growth hormone releasing hormone，簡稱GHRH） 是在下丘腦的弓狀核中合成分泌的小分子多肽［7］。GHRH基因不僅是在種間還是種內(nèi)都具有高度保守性［8］。雄性小鼠缺乏GHRH會增加體力活動［9］。牛的GHRH基因可能是影響體質(zhì)量的重要因素之一［10］。GHRH 基因mRNA表達(dá)和生長性狀相對于基因型（+/-）均表現(xiàn)出差異不顯著［11］。GHRH類似物通過抗炎和抗氧特性使其在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期具有保護(hù)神經(jīng)血管作用［12］。 生長激素釋放激素受體（growth hormone releasing hormone receptor，簡稱GHRHR） 在細(xì)胞增殖、生長激素合成與分泌等方面都發(fā)揮著重要作用。迄今為止僅在異種動物、雞和斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的GHRHR同時容納GHRH和PRP［13］。GHRHR確定為GH1之后的第2個IGHD基因［14］。CREB3L2能夠促進(jìn)GHRHR啟動子的活性［15］。

InDel多態(tài)性分子標(biāo)記是基于插入/缺失位點2側(cè)的序列設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的標(biāo)記，其本質(zhì)仍屬于長度多態(tài)性標(biāo)記，可利用便捷的電泳平臺進(jìn)行分型。InDel標(biāo)記準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析模糊。此外，InDel標(biāo)記能擴(kuò)增混合DNA樣品和高度降解的微量DNA樣品，并進(jìn)行有效分型。InDel標(biāo)記目前已開始應(yīng)用于動植物群體遺傳分析、分子輔助育種以及人類法醫(yī)遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域［16］。本研究以小尾寒羊為研究對象，對GHR、GHRH、GHRHR基因的InDel多態(tài)性與肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以此來探討GHR、GHRH、GHRHR基因?qū)π∥埠蛉赓|(zhì)性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取遼寧省沙地治理與利用研究所阜瑤牧業(yè)公司阜新市種羊場的小尾寒羊164只，通過頸靜脈采血，并作ACD抗凝處理后的血樣至于冰盒中，放入冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 肉質(zhì)性狀指標(biāo)測定 測定指標(biāo)包括滴水損失、水分、蒸煮損失、色澤、粗蛋白、粗脂肪，測量方法參考張沅主編的《家畜育種學(xué)》［17］。

1.2.2 引物設(shè)計 引物設(shè)計參考Wu等的研究［18］。并由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析 PCR擴(kuò)增體系 15 μL：上下游引物各 1 μL，DNA 2 μL，2×Tap PCR Master Mix 7.5 μL，dd H2O 3.5μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。通過SPSS 26.0軟件中的一般線性模型方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，最終以作圖形式展示關(guān)聯(lián)結(jié)果。

1.2.4 試驗地點與時間 試驗地點為河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院動物遺傳育種實驗室，試驗時間為2021年4月至2022年4月。

2 結(jié)果與分析

2.1 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因的多態(tài)性檢測

從圖1可以看出，GHR基因具有3種基因型，分別為II基因型、ID基因型、DD基因型。從圖2可以看出，GHRH基因具有2種基因型，分別為II基因型、DD基因型。從圖3可以看出，GHRHR基因具有3種基因型，分別為II基因型、ID基因型、DD基因型。

2.2 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因的群體遺傳多樣性

從表1可以看出，GHR基因的II基因型頻率最高，為0.625；DD基因型頻率最低，僅有0.063。等位基因I的頻率最多，為0.781；D的頻率較少，為0.219。純合度為0.685，雜合度為0.342，多態(tài)信息含量為0.283，在群體中處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50），χ2為0.235，P值為0.628>0.05，說明GHR基因符合Hardy-Weinberg平衡。

GHRH基因II基因型頻率最高，為0.563；DD基因型頻率較低，為0.437。等位基因I的頻率最高，為0.536；D的頻率最小，為0.437。純合度為0.508，雜合度為0.492，多態(tài)信息含量為0.371，在群體中處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50），χ2為32.000，P值為0.000<0.001，說明GHRH基因極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

GHRHR基因的ID基因型頻率為0.250；DD基因型頻率最低，為0.062；II基因型頻率最高，為0.688。等位基因I頻率最高，為0.813；等位基因D頻率最低，為0.187。純合度為0.695，雜合度為0.305，多態(tài)信息含量為0.258，在群體中處于中度多態(tài)性（0.25≤PIC＜0.50），χ2為1.031，P值為0.310>0.05，說明小尾寒羊GHRHR基因位點符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

從圖4可以看出，小尾寒羊GHR基因的DD基因型肉質(zhì)色澤顯著低于ID、II基因型（P＜0.05），而滴水損失、剪切力、水分、蒸煮損失、粗蛋白、粗脂肪在GHR基因的不同基因型之間無顯著差異（P>0.05）。從圖5可以看出，GHRH不同基因型對于小尾寒羊的所有肉質(zhì)性狀影響不顯著（P>0.05）。從圖6可以看出，GHRHR基因的DD基因型個體的剪切力顯著高于ID、II基因型個體（P<0.05），而滴水損失、水分、蒸煮損失、色澤、粗蛋白、粗脂肪在GHRHR基因的不同基因型之間無顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

目前，對于GHR、GHRH、GHRHR這3種基因的研究大多數(shù)都集中在其生長性狀的相關(guān)分析，但是對于這3種基因的關(guān)于肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析卻較少，而且多數(shù)的研究都集中在牛等其他動物身上，有關(guān)綿羊類的研究非常少。

3.1 GHR基因的多態(tài)性

在不同年齡的西羅希山羊品種中，GHR基因的1個SNP與體質(zhì)量存在顯著影響［19］。GHR基因T229C位點對牛的宰前活質(zhì)量、屠宰率、胴體質(zhì)量、凈肉率、肉骨比、脂肪覆蓋率、頭質(zhì)量、胴體產(chǎn)肉率、前蹄質(zhì)量、后蹄質(zhì)量、大理石花紋評分和剪切力影響顯著［20］。在家兔群體中，GHR基因的外顯子上發(fā)現(xiàn)2個突變位點，分別是2 067（C/T）、1 797（T/C），在1 797（T/C）位點中不同基因型肉用性狀之間使用最小二乘分析結(jié)果顯示，在不同基因型個體間差異不顯著（P>0.05），而2 067（C/T）突變位點在胴體質(zhì)量、背腰質(zhì)量、35日齡體質(zhì)量、70日齡體質(zhì)量、前腿質(zhì)量、皮質(zhì)量和后腿質(zhì)量等屠宰性狀及肌內(nèi)蛋白質(zhì)含量和干物質(zhì)含量等肉質(zhì)性狀的最小二乘均值雜合型MN型個體顯著優(yōu)于MM型、NN型個體（P<0.05）［21］。本研究中GHR基因僅與小尾寒羊的肉質(zhì)色澤存在顯著相關(guān)性，可以推測出GHR基因可以作為小尾寒羊提升肉質(zhì)品質(zhì)的候選基因之一。

3.2 GHRH基因的多態(tài)性

GHRH激動劑可以減輕誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)抑郁、焦慮和認(rèn)知缺陷，并且降低氧化應(yīng)激標(biāo)志物，促紅細(xì)胞生成素和胰島素生長因子-1表達(dá)上調(diào)，并明顯降低了小鼠在睡眠期間的間歇性缺氧時的水迷宮缺陷［22］。GHRH除了影響內(nèi)分泌作用和代謝以外，在炎癥和疼痛的調(diào)節(jié)中同樣發(fā)揮作用?？梢酝ㄟ^注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒的方法來提高綿羊的增質(zhì)量和生長速率。PCR結(jié)果顯示，經(jīng)pM-GHRH處理后的綿羊中幾乎沒有質(zhì)粒殘留，并且也不存在器官腫大或相關(guān)的病理 ［23］。在朝鮮牛群體中，GHRH基因在9 kb全基因區(qū)域內(nèi)共發(fā)現(xiàn)12個單核苷酸多態(tài)性，結(jié)果顯示-4241A>T與EMA和CW呈顯著相關(guān)，表明GHRH基因多態(tài)性可能是影響肉牛胴體產(chǎn)量的重要遺傳因素之一［24］。本試驗結(jié)果與之存在差異，這可能是由于所選的動物種類不同，而導(dǎo)致的結(jié)果存在差異，本試驗結(jié)果中的GHRH基因與小尾寒羊肉質(zhì)性狀的無顯著相關(guān)性，故不可以作為小尾寒羊肉質(zhì)形狀的候選基因。

3.3 GHRHR基因的多態(tài)性

GHRHR基因的2種單倍型的效應(yīng)大于其他任何基因，表明GHRHR可能是迄今為止發(fā)現(xiàn)的影響人類身高正常變異的最重要基因之一［25］。 在南陽牛、陜縣紅牛和秦川牛中發(fā)現(xiàn)GHRHR的4個位點共檢測出10個SNPs，而且對陜縣紅牛的管圍存在極顯著的影響（P<0.01），對其體高、體斜長、腰角寬、體質(zhì)量、十字部高、尻長和胸圍有顯著影響（P<0.05）；對南陽牛0～6月齡平均日增質(zhì)量、6月齡體質(zhì)量、體斜長和6～12月齡平均日增質(zhì)量有明顯的影響（P<0.05）［26］。本研究中GHRHR基因僅與小尾寒羊的剪切力存在顯著相關(guān)性，可以推測出GHRHR基因可以作為小尾寒羊提升肉質(zhì)品質(zhì)的候選基因之一。

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