氟吡菌酰胺與百菌清混配對灰葡萄孢菌的聯(lián)合毒力及田間藥效

張揚　周飛　鄭斐　賈云鶴　李宏偉

摘要［目的］篩選出氟吡菌酰胺與百菌清混配對灰葡萄孢菌的增效組合。［方法］采用菌絲生長速率法測定氟吡菌酰胺與百菌清混配對灰葡萄孢菌菌絲生長的聯(lián)合毒力，并采用孢子萌發(fā)法和田間藥效試驗對優(yōu)選出的配比進行驗證。 ［結(jié)果］氟吡菌酰胺與百菌清以有效成分質(zhì)量比10∶40、8∶42、6∶44、5.5∶44.5、5∶45、4∶46和3∶47混配抑菌菌絲生長的共毒系數(shù)（CTC）均大于120，表現(xiàn)增效作用。混配藥劑對孢子萌發(fā)的抑制效果隨百菌清含量增加而增強。41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑與720 g/L百菌清懸浮劑按照有效成分質(zhì)量比8∶42桶混在900～1 500 mg/L劑量下對番茄灰霉病的防治效果與對照藥劑41.7%氟吡菌酰胺SC（400 mg/L）相當，略優(yōu)于43%氟菌·肟菌酯SC（400 mg/L），顯著優(yōu)于720 g/L百菌清SC（1 260 mg/L）和50%異菌脲WP（1 000 mg/L）。［結(jié)論］氟吡菌酰胺與百菌清按有效成分質(zhì)量比8∶42混配可以有效防控番茄灰霉病，推薦劑量為900～1 500 mg/L。

關(guān)鍵詞氟吡菌酰胺；百菌清；灰葡萄孢菌；聯(lián)合毒力；田間藥效

中圖分類號S482.2文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0156-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.036開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Joint Toxicity of Mixing Fluopyram with Chlorothalonil against Botrytis cinerea and Their Field Efficacy against Tomato Grey Mold

ZHANG Yang， ZHOU Fei， ZHENG Fei et al （Shanghai GreenTech Laboratory Co.，Ltd.， Shanghai 201612）

Abstract［Objective］ To screen out the synergistic combination of fluopyram and chlorothalonil against B.cinerea. ［Method］ The joint toxicity of mixing fluopyram with chlorothalonil against B.cinerea was determined by measuring mycelial growth rate test. The conidial germination test and the field efficacy test in controlling tomato gray mould were also carried out to verify the effect of the optimized ratio. ［Result］ The results showed that synergia effect against B. cinerea of mixing fluopyram with chlorothalonil were found at the ratios of 10∶40， 8∶42， 6∶44，5.5∶44.5， 5∶45， 4∶46 and 3∶47， all co-toxicity coefficient （CTC） was greater than 120.The inhibitory effect of the mixture on spore germination increased with the increase of chlorothalonil content. The control effect of fluopyram 41.7% SC and chlorothalonil 720 g/L SC in the dosage of 900-1 500 mg/L according to the mass ratio of 8∶42 was comparable to fluopyram 41.7% SC at the dosage of 400 mg/L， which was better than that of fluopyram and trifloxystrobin 43% SC at the dosage of 400 mg/L and significantly better than chlorothalonil 720 g/L SC and iprodione 50% WP when the treatment dose were 1 260， 1 000 mg/L. ［Conclusion］ The mixture of fluopyram and chlorothalonil at the ratio of 8∶42 could effectively control tomato gray mold， and the recommended dose is 900-1 500 mg/L.

Key wordsFlupiramide;Chlorothalonil;Botrytis cinerea;Joint toxicity;Field efficacy

由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一種世界性的重要病害，主要危害番茄的莖、葉片、花和果實［1］?；移咸焰呔哂挟a(chǎn)孢量大、遺傳變異快、生命周期短、傳播能力強等特點，極易產(chǎn)生抗藥性，甚至多重抗藥性［2］。國內(nèi)大量報道田間檢測到對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯胺基嘧啶類及琥珀酸脫氫酶抑制劑殺菌劑產(chǎn)生抗性的灰葡萄孢菌株［3-7］。

氟吡菌酰胺是由德國拜耳公司研發(fā)的一種苯甲酰胺類殺菌劑，其通過抑制呼吸鏈中琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）的電子轉(zhuǎn)移，阻礙線粒體呼吸，從而抑制病原菌的生長，進而達到控制病害的目的。氟吡菌酰胺對灰葡萄孢菌、白粉病菌和核盤菌等引起的病害效果突出［8］，用于防治灰霉病時，與咯菌腈、啶酰菌胺、嘧霉胺、腐霉利、異菌脲之間均不存在交互抗性［9］。

百菌清是一種廣譜高效保護性殺菌劑，廣泛應(yīng)用于蔬菜、果樹、大田作物、煙草、草坪等，其與真菌細胞中的三磷酸甘油醛脫氫酶發(fā)生作用，與該酶中含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而破壞該酶活性，使真菌細胞的新陳代謝受破壞而失去生命力［10］。近年來，隨著殺菌劑抗性管理的需要，百菌清作為傳統(tǒng)保護性殺菌劑受到更多關(guān)注。百菌清對灰葡萄孢的敏感性較高，與其他灰霉病常規(guī)防治藥劑相比，對病原菌的抗性水平較低［11］。

目前，化學(xué)防治仍是防治番茄灰霉病的主要手段。將作用機制不同的殺菌劑進行合理混配對灰葡萄孢的抗藥性治理及延緩抗藥性的產(chǎn)生具有重要意義。筆者測定氟吡菌酰胺與百菌清不同配比對灰葡萄孢的聯(lián)合毒力，旨在篩選出2種藥劑的最佳增效配比，為灰霉病的防治及抗性治理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株?；移咸焰呔˙otrytis cinerea），菌株編號2019TF004，由上海曉明檢測技術(shù)服務(wù)有限公司生測實驗室長期保存。

1.1.2供試藥劑。95%氟吡菌酰胺原藥（TC），上海泰禾國際貿(mào)易有限公司提供；98%百菌清原藥（TC）和720 g/L百菌清懸浮劑（SC），江蘇新河農(nóng)用化工有限公司生產(chǎn)；41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑（SC）和43%氟菌·肟菌酯懸浮劑（SC），拜耳作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)；50%異菌脲可濕性粉劑（WP），富美實植物保護劑有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1氟吡菌酰胺與百菌清混配對灰葡萄孢菌的聯(lián)合毒力測定。抑制菌絲生長：參照行標NY/T 1156.2—2006［12］，采用菌絲生長速率法，分別將適量的氟吡菌酰胺和百菌清原藥溶于DMF，然后按照10∶40、8∶42、6∶44、5.5∶44.5、5∶45、4∶46和3∶47的質(zhì)量比混合，得到不同配比的混合母液。用滅菌的0.1%吐溫-80水將混合母液進行系列稀釋，與PDA培養(yǎng)基按體積比1∶49的比例混合后制成含藥平板，氟吡菌酰胺、百菌清單劑及其混劑的含藥平板最終濃度分別為40、16、6.4、2.56、1.02、0.41和0.163 mg/L。將直徑5 mm的灰葡萄孢菌菌餅，菌絲面朝下，轉(zhuǎn)接到各含藥平板中央，每皿1個菌餅，每處理3次重復(fù)，設(shè)空白對照，于20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑，利用DPS統(tǒng)計分析軟件，計算氟吡菌酰胺、百菌清及其混劑的有效抑制中濃度（EC）及相關(guān)系數(shù)，采用Sun-Johnson（1960）的共毒系數(shù)法（CTC）來評價藥劑混用的增效作用。根據(jù)下列公式計算菌絲生長抑制率：

菌落生長直徑=菌落直徑平均值-0.5 cm

菌絲生長抑制率=（空白對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/空白對照菌落生長直徑×100%

抑制孢子萌發(fā)：采用96孔板法［13］，按照上述方法配制氟吡菌酰胺和百菌清單劑及其混劑母液。用滅菌的0.1%吐溫-80水將各原藥及混合母液進行系列稀釋，配制成100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.195 mg/L的藥液。取在PSA培養(yǎng)基上已大量產(chǎn)孢的灰葡萄孢菌平板，用含有0.1%吐溫-80、2%葡萄糖和1%酵母膏的洗脫液沖洗下孢子，4層無菌紗布過濾，濾液離心（5 000 r/min，10 min）去除上清液。將孢子重新懸浮于上述洗脫液中，調(diào)節(jié)孢子濃度至1×105個/mL，制備成孢子懸浮液。每處理取0.5 mL藥液和0.5 mL孢子液加入2 mL離心管中充分混勻備用。取孢子液和藥液混合液100 μL加入96孔板中，每個處理3個孔，設(shè)只含孢子懸浮液的處理為空白對照。96孔板的外圍用封口膜封住以減少水分蒸發(fā)，然后將其置于20 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。接種24 h后調(diào)查，分別記錄孢子萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)。根據(jù)下列公式計算孢子萌發(fā)抑制率：

孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/調(diào)查孢子總數(shù)×100%

孢子萌發(fā)抑制率=（空白對照萌發(fā)率-藥劑處理萌發(fā)率）/空白對照萌發(fā)率×100%

1.2.2田間藥效試驗。田間藥效試驗于2020和2021年分別在浙江省紹興市東浦鎮(zhèn)行宮山村和上海市奉賢區(qū)葉莊公路888號進行，試驗地常年種植番茄，灰霉病較易發(fā)生。

2020年試驗：番茄，品種為合作903，日光大棚內(nèi)栽培，于2020年9月15日移栽，株行距40 cm×40 cm。試驗設(shè)9個處理，分別為41.7%氟吡菌酰胺SC與720 g/L百菌清SC混合物（質(zhì)量比1∶5.25）900、1 200、1 500 mg/L（均為有效劑量，下同），41.7%氟吡菌酰胺SC 240 mg/L，720 g/L百菌清SC 1 260 mg/L，43%氟菌·肟菌酯SC 400 mg/L，50%異菌脲WP 1 000 mg/L和清水對照。各小區(qū)隨機排列，每處理3次重復(fù)，小區(qū)面積10 m。2020年11月25日（番茄始花期，灰霉病零星發(fā)生）和12月4日分別進行第一次和第二次施藥，共用藥2次。

2021年試驗：番茄，品種為粉太郎，于2020年12月14日移栽，試驗處理及種植模式與2020年相同。2次施藥時間分別是3月2日（始花期）和3月13日。

2次試驗使用中保綠農(nóng)背負式電動噴霧器對番茄進行均勻噴霧，噴施藥液時以葉面濕潤而不滴水為宜，如實記錄噴液量。病情調(diào)查參考農(nóng)藥田間藥效試驗準則（GB/T 17980.28—2000）。施藥前，番茄葉片上灰霉病零星發(fā)生，病情基數(shù)視為0。末次用藥后10 d調(diào)查發(fā)病情況，調(diào)查每小區(qū)全部果實。計算病情指數(shù)及防效。

病情指數(shù)=∑（各級病果數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總果數(shù)×9）×100

防治效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用DPS v16.05數(shù)據(jù)處理軟件進行分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法（DMRT）進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1氟吡菌酰胺與百菌清混配對灰葡萄孢的聯(lián)合毒力氟吡菌酰胺、氟吡菌酰胺與百菌清不同配比對灰葡萄孢菌表現(xiàn)出較高的毒力。氟吡菌酰胺與百菌清在不同質(zhì)量比下對灰葡萄孢菌均表現(xiàn)增效作用，在質(zhì)量比為10∶40和8∶42時，共毒系數(shù)分別為223和215，對灰葡萄孢的毒力最強（表1）。百菌清對灰葡萄孢菌的菌絲抑制作用較弱。

氟吡菌酰胺和百菌清對灰葡萄孢菌的孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出一定抑制作用，24 h顯微鏡下調(diào)查孢子萌發(fā)情況，百菌清在1.56 mg/L劑量下可完全抑制灰葡萄孢菌的孢子萌發(fā)，該劑量下，氟吡菌酰胺孢子萌發(fā)抑制率僅為2%。氟吡菌酰胺在100 mg/L劑量下對灰葡萄孢菌的孢子萌發(fā)抑制率接近100%?；炫渌巹┲?，百菌清的含量越高，藥劑對孢子的抑制作用越強（圖1）。

2.2田間藥效試驗2020年的田間試驗結(jié)果表明（表2），41.7%氟吡菌酰胺 SC與720 g/L百菌清SC按有效成分質(zhì)量比8∶42混配對番茄灰霉病表現(xiàn)出良好的防治效果，且對作物安全。在混配有效用量為900、1 200、1 500 mg/L時，對番茄灰霉病的防效分別為80.01%、81.67%和89.33%，混配藥劑的防效呈現(xiàn)一定劑量反應(yīng)。3個混配處理對番茄灰霉病的防效與單獨施用41.7%氟吡菌酰胺SC（240 mg/L）無顯著差異，略優(yōu)于43%氟菌·肟菌酯SC（400 mg/L），顯著優(yōu)于720 g/L百菌清SC（1 260 mg/L）和50%異菌脲WP（1 000 mg/L）的防效。2021年的田試結(jié)果與2020年基本一致。

3結(jié)論與討論

殺菌劑的聯(lián)合作用與選擇的靶標、菌種本身特性、單劑表現(xiàn)、組合比例、菌體生活階段、試驗方法等多種因素有關(guān)［14］。Sun-Johnson方法是評價殺菌劑聯(lián)合作用的主要方法之一，因此該研究在采用菌絲生長速率法進行聯(lián)合毒力測定的基礎(chǔ)上，同時采用孢子萌發(fā)法對混配藥劑的孢子萌發(fā)抑制效果進行了驗證，并進行田間桶混試驗，對室內(nèi)篩選出的增效組合進行藥效評價。結(jié)果表明，采用Sun-Johnson法分析發(fā)現(xiàn)氟吡菌酰胺和百菌清按有效成分質(zhì)量比10∶40、8∶42、6∶44、5.5∶44.5、5∶45、4∶46和3∶47混配的共毒系數(shù)（CTC）均大于120，表現(xiàn)增效作用。此外，在田間試驗中，41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑與720 g/L百菌清懸浮劑按照有效成分質(zhì)量比8∶42桶混，在900、1 200、1 500 mg/L劑量下對番茄灰霉病的防效與單獨施用41.7%氟吡菌酰胺SC（240 mg/L）無顯著差異，顯著優(yōu)于720 g/L百菌清SC（1 260 mg/L）單劑的防效，表明2種藥劑混合使用后降低單劑用量仍可以達到較優(yōu)的防治效果。

該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟吡菌酰胺和百菌清對灰葡萄孢菌表現(xiàn)出不同作用特性。2種藥劑對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有一定抑制作用［15-16］。氟吡菌酰胺對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制作用顯著優(yōu)于百菌清，以EC50值進行評價，氟吡菌酰胺的活性是百菌清的4～9倍。采用96孔板法測定氟吡菌酰胺和百菌清對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用，百菌清對灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用顯著優(yōu)于氟吡菌酰胺，以完全抑制孢子萌發(fā)的藥劑濃度進行評價，百菌清的活性約是氟吡菌酰胺的64倍。在番茄灰霉病田間試驗中，因2年試驗均于番茄灰霉病始發(fā)期施藥，試驗中百菌清單劑對番茄灰霉病的防效較常規(guī)防治效果差，但當百菌清與氟吡菌酰胺桶混使用時，兩者表現(xiàn)相加作用，對番茄灰霉病的防效優(yōu)于相同劑量下單劑的防效。上述研究結(jié)果進一步表明，氟吡菌酰胺和百菌清分別作用于灰葡萄孢菌的不同發(fā)育階段，將這2種作用機制不同的殺菌劑進行合理混配對灰葡萄孢菌的抗藥性治理、延緩抗藥性的產(chǎn)生及彌補單一藥劑自身缺陷具有重要意義。

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