不同試驗(yàn)條件對(duì)綿羊沖胚效果的影響

高峰　李心海

摘要 湖羊是江浙地區(qū)常見的綿羊品種之一，繁殖性能優(yōu)越，肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，為了進(jìn)一步探索湖羊的繁殖潛力，采用CIDR+PMSG+PG+FSH法對(duì)湖羊進(jìn)行同期發(fā)情和超數(shù)排卵，并在此基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)情母羊進(jìn)行腹腔鏡子宮角輸精；采用相同輸精密度、不同輸精時(shí)間（撤栓后48、54、60 h）分別對(duì)發(fā)情母羊進(jìn)行腹腔鏡子宮角授精，通過(guò)沖胚進(jìn)行卵子受精率和可用胚胎率檢查，探究對(duì)湖羊進(jìn)行腹腔鏡子宮角輸精時(shí)的最適輸精密度與最適輸精時(shí)間。結(jié)果表明，輸精密度為2×10個(gè)/mL組的卵子受精率和可用胚胎率顯著低于其余4組（P<0.05），其余4組差異不顯著（P>0.05）；撤栓后48 h輸精組與撤栓后54 h輸精組可用胚胎率差異不顯著（P>0.05），但均高于撤栓后60 h，且差異顯著（P<0.05）；不同輸精密度的鮮精以及不同輸精時(shí)間均會(huì)對(duì)湖羊卵子受精率和可用胚胎率產(chǎn)生一定的影響，輸精密度為3×10個(gè)/mL可以作為湖羊鮮精輸精的最低有效密度，撤栓后48～54 h輸精可以作為湖羊腹腔鏡子宮角輸精的最佳時(shí)間。

關(guān)鍵詞輸精密度；輸精時(shí)間；沖胚；胚胎質(zhì)量；綿羊

中圖分類號(hào)S826文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2023）08-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.022開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Different Experimental Conditions on Embryo Flushing Effect of Sheep

GAO Feng，LI Xin-hai（Xuzhou Institute of Biotechnology，Xuzhou，Jiangsu 221000）

Key wordsHu Sheep is one of the common sheep breeds in Jiangsu and Zhejiang regions， with excellent reproductive performance， fresh and tender meat and rich nutrition. In order to further explore the reproductive potential of Hu sheep， CIDR+PMSG+PG+FSH method was used to conduct simultaneous estrus and superovulation of Hu sheep， and on this basis， laparoscopic uterine horn insemination was performed on the estrous ewes; Laparoscopic uterine horn insemination was performed on estrous ewes using the same insemination density and different insemination times （48， 54， and 60 hours after thrombolysis removal）. The fertilization rate and available embryo rate were examined by embryo flushing to explore the optimal infusion precision and time for laparoscopic uterine horn insemination in Hu sheep. The results showed that the fertilization rate and available embryo rate of the 2×10 pieces/mL group were significantly lower than those of the other 4 groups （P<0.05）， while the other 4 groups had no significant difference （P>0.05）;There was no significant difference in the available embryo rate between the 48 h after thrombectomy and the 54 h after thrombectomy groups （P>0.05）， but both were higher than those at 60 h after thrombectomy， and the difference was significant （P<0.05）;fresh semen with different precision and different insemination time have certain influence on fertilization rate and available embryo rate of Hu sheep eggs， 3×10 pieces/mL could be used as the lowest effective density of fresh semen insemination in Hu sheep. 48-54 hours after embolectomy could be the best time for laparoscopic uterine horn insemination in Hu sheep.

Key wordsInfusion precision；Insemination time；Flushing embryo；Embryo quality;Sheep

湖羊是江浙地區(qū)常見的綿羊品種之一，繁殖性能優(yōu)越，肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有早熟、一年四季均可發(fā)情、多羔、泌乳性能優(yōu)良、生長(zhǎng)發(fā)育速度快、耐熱耐濕等優(yōu)良性狀，是一種適宜廣泛舍飼的優(yōu)良品種［1-5］。近年來(lái)，隨著腹腔鏡子宮角輸精技術(shù)的成熟和發(fā)展，優(yōu)良種畜的利用率越來(lái)越受到重視。在技術(shù)水平相同條件下，提高種公羊的精液利用率，顯得尤為重要。為了進(jìn)一步利用新技術(shù)開發(fā)湖羊繁殖優(yōu)勢(shì)，該研究探究對(duì)湖羊進(jìn)行腹腔鏡子宮角輸精時(shí)的最適輸精密度與最適輸精時(shí)間，以期為后續(xù)湖羊繁殖技術(shù)改良提供基礎(chǔ)參考，加快湖羊繁殖新技術(shù)的推廣。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)?zāi)秆蜻x擇1～2歲齡，體重50 kg 左右，膘情良好，無(wú)生殖道疾病，未懷孕的經(jīng)產(chǎn)湖羊母羊80只。試驗(yàn)公羊選擇體格健壯，性欲旺盛，體重60 kg左右，無(wú)生殖道疾病的湖羊公羊10只。母羊與公羊分開飼養(yǎng)。

1.1.2藥品與儀器。羊用陰道栓（CIDR，南非ZOETIS公司生產(chǎn)），規(guī)格：每包20支，每支含0.3 g孕酮；獸用孕馬血清（PMSG，寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn)），規(guī)格：1 000 IU/瓶，批號(hào)：110914564；氯前列烯醇（PGF2α，寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn)），規(guī)格：每支2 mL每支含量0.2 mg，批號(hào)：110912207；促卵泡素（FSH，寧波第二激素廠）規(guī)格：100 IU/瓶，批號(hào)110254629，4 ℃條件保存。

試驗(yàn)儀器包括沖胚管、母羊保定臺(tái)、恒溫水浴鍋、腹腔鏡、體視顯微鏡、子宮鉗、集精杯、手術(shù)剪、醫(yī)用噴壺、止血鉗、注射器、培養(yǎng)皿、手術(shù)刀片、醫(yī)用縫合線、留置針等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1飼養(yǎng)管理。精料選擇全價(jià)顆粒料，粗料選擇苜蓿、花生秧、秸稈等青貯飼料。每日上、下午各飼喂1次，置自動(dòng)飲水器飲水。種公羊采精鮮精，活力在0.7以上才可使用。

1.2.2試驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥。試驗(yàn)時(shí)間：2021年10—11月，試驗(yàn)地點(diǎn)：徐州湖羊養(yǎng)殖基地。

試驗(yàn)發(fā)情母羊共80只，均進(jìn)行同期發(fā)情和超數(shù)排卵處理，處理過(guò)程中不分組。

1.2.3同期發(fā)情與超數(shù)排卵處理。對(duì)所有母羊采用CIDR+PMSG+PG+FSH法進(jìn)行同期發(fā)情和超數(shù)排卵處理。埋栓當(dāng)天記為第1天，每只母羊都埋栓13 d，第11天下午開始肌注FSH，每隔12 h注射1次，連續(xù)注射7次，劑量逐漸遞減，F(xiàn)SH總劑量為400 IU/只。

1.2.4不同輸精密度沖胚效果試驗(yàn)過(guò)程。將經(jīng)過(guò)同期發(fā)情和超數(shù)排卵處理的發(fā)情母羊隨機(jī)分為5組，組別分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，每組10只，撤栓后48 h進(jìn)行腹腔鏡子宮角授精。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別使用不同精液密度的鮮精，依次為2×10、3×10、4×10、5×10、6×10個(gè)/mL；每只母羊輸入0.2 mL精液，活力在0.7以上。

1.2.5不同輸精時(shí)間沖胚效果試驗(yàn)過(guò)程。將經(jīng)過(guò)同期發(fā)情和超排處理的發(fā)情母羊隨機(jī)分為3組，每組10只，采用相同輸精密度、不同輸精時(shí)間進(jìn)行腹腔鏡子宮角授精。根據(jù)輸精時(shí)間分組如下：Ⅰ組（撤栓后48 h）、Ⅱ組（撤栓后54 h）、Ⅲ組（撤栓后60 h）；每只母羊輸入0.2 mL精液，活力在0.7以上。

1.2.6腹腔鏡子宮角輸精。穿刺部位一般選擇在母羊乳頭下方14 cm左右，腹中線兩側(cè)各穿刺1孔，見圖1乳頭下方黑點(diǎn)所在位置［6-7］。在左側(cè)乳頭下方14 cm左右，偏離腹中線左側(cè)3～4 cm 處插入0.7 cm的套管針，刺穿皮膚深度2 cm，將套管送入腹腔。通過(guò)套管往腹腔伸入帶有冷光源的內(nèi)窺鏡，觀察卵巢上排卵點(diǎn)和紅體狀態(tài)以及數(shù)量。此時(shí)，在右側(cè)相同位置處插入套管針，拔針后通過(guò)套管插入輸精槍。用輸精槍輕輕挑起卵巢，以便觀察排卵點(diǎn)和紅體。如果卵巢上有多個(gè)紅體和排卵點(diǎn)時(shí)即可輸精，若沒(méi)有排卵點(diǎn)和紅體則不必輸精。找到子宮角分叉處，在一側(cè)子宮角距離分叉1/3 處，輸精槍前端針頭刺入子宮角內(nèi)，應(yīng)感覺到有阻力，緩慢注射1/2精液量，然后拔出針頭，將剩余精液注入另一側(cè)子宮角相應(yīng)位置，完成輸精。

1.2.7胚胎的采集。輸精后第6天對(duì)供體湖羊采卵。手術(shù)前對(duì)供體湖羊肌肉注射陸眠寧1 mL/只。在靠近乳房的腹部作一縱行切口，用食指和中指夾住子宮角并拉出腹腔外，生理鹽水沖洗，用滅菌的回形針刺破子宮角壁，并從此處插入套管針，將針芯抽出，再用回形針刺破子宮角另一端，并在此處插入沖胚管。用注射器向沖胚管內(nèi)注入適量水，能夠?qū)⒆訉m角撐開，但不能將子宮角壁撐破，在沖胚管的另一端用集卵皿收集胚胎。用注射器吸取生理鹽水從套管處注入沖胚，在沖胚管的末端收集沖胚液，然后用注射器將水囊的水抽完，從子宮角抽出沖胚管，沖洗子宮并放回腹腔，縫合腹壁，手術(shù)完成后肌肉注射陸醒寧1 mL/只，并肌肉注射青鏈霉素以防發(fā)生感染。

1.2.8檢胚。將沖胚液靜置10 min，在室溫下用體視顯微鏡放大20倍檢胚。先用吸管吸取上清液并棄掉，再用吸管將胚胎轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿中，反復(fù)尋找胚胎，將所有胚胎檢出。

胚胎質(zhì)量鑒別依據(jù)：胚胎按發(fā)育狀況和形態(tài)可依次分為A、B、C、D 4 個(gè)等級(jí)。A級(jí)，胚胎和胚齡發(fā)育階段吻合、結(jié)構(gòu)緊湊、輪廓清晰、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)完整均勻、透明帶光滑均勻、存在極少游離細(xì)胞，變性細(xì)胞比例少于10%；B級(jí)，基本符合胚胎胚齡發(fā)育一致、輪廓清晰、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)較完整、透明帶較均勻、變性細(xì)胞為10%～30%；C級(jí)，胚胎與胚胎發(fā)育階段胚齡有差異，色澤與透明度較暗，變性和游離細(xì)胞占30～40%；D級(jí)，發(fā)育停滯、退化或萎縮的胚胎。其中，A級(jí)和B級(jí)胚胎為可移植胚胎，其妊娠率明顯高于C、D 級(jí)胚胎。仔細(xì)嚴(yán)格檢查收集到的胚胎，并且做好胚胎的質(zhì)量鑒定分級(jí)和記錄。把同級(jí)的胚胎用吸管檢出放入內(nèi)有胚胎保存液的培養(yǎng)皿，在蓋上做好標(biāo)記備用。

1.3數(shù)據(jù)處理沖胚數(shù)包括未受精卵和受精卵形成受精胚胎的總數(shù)。受精率=受精胚胎數(shù)/沖胚數(shù)×100%，可用胚胎率=可用胚胎/受精胚胎數(shù)×100%。

用Excel 2003軟件記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行整理，用SAS軟件中的PROCFREQ程序進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1不同密度鮮精液對(duì)供體母羊沖胚的影響由表1可知，不同密度鮮精液對(duì)供體母羊腹腔鏡子宮角輸精后的沖胚結(jié)果有一定影響。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組鮮精沖胚數(shù)最高為137枚、最低為127枚；受精胚胎數(shù)最高為128枚、最低為110枚；卵子受精率最高為93.43%、最低為85.27%。受精胚胎中的可用胚胎數(shù)最高為111枚，最低為83枚；可用胚胎率最高為86.72%，最低為75.45%。Ⅰ組（2×108個(gè)/mL）與其余各組相比，無(wú)論在卵子受精率和可用胚胎率上均存在顯著差異（P<0.05），其余各組不存在顯著差異（P>0.05）。

2.2不同輸精時(shí)間對(duì)供體母羊沖胚的影響由表2可知，不同輸精時(shí)間對(duì)供體母羊腹腔鏡子宮角輸精后的沖胚結(jié)果有一定影響。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組沖胚數(shù)最高為146枚、最低為132枚；受精胚胎數(shù)最高為139枚、最低為118枚；卵子受精率最高為95.21%、最低為84.29%。受精胚胎中的可用胚胎數(shù)最高為122枚、最低為93枚；可用胚胎率最高為87.77%、最低為78.81%。Ⅲ組（60 h）與其余各組相比，無(wú)論在卵子受精率和可用胚胎率上均存在顯著差異（P<0.05），其余各組不存在顯著差異（P>0.05）。

3討論

隨著腹腔鏡子宮角輸精技術(shù)的成熟和發(fā)展，優(yōu)良種畜的利用率越來(lái)越受到重視。在技術(shù)水平相同條件下，提高種公羊的精液利用率顯得尤為重要。

3.1不同輸精密度對(duì)綿羊胚胎移植供沖胚的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，在進(jìn)行湖羊腹腔鏡子宮角輸精時(shí)可以將精液密度稀釋7～10倍，達(dá)到3×10個(gè)/mL，每只母羊輸入0.2 mL，有效精子數(shù)0.42億～0.54億，其卵子受精率可達(dá)91.67%，可用胚胎率達(dá)85.95%。一般來(lái)講，綿羊的精液密度為20億～30億/mL，每次采精1.5 mL左右。傳統(tǒng)的子宮頸輸精和陰道人工授精普遍采用3～4倍稀釋后，每只母羊輸入0.2 mL的精液，這在一定程度上造成了優(yōu)質(zhì)精液的浪費(fèi)，加上傳統(tǒng)輸精效果有限，就限制了優(yōu)質(zhì)精液的利用。劉桂娟等［8］在綿羊人工授精和腹腔鏡輸精效果比較研究中發(fā)現(xiàn)腹腔鏡輸精受胎率為89.9%，遠(yuǎn)高于人工授精組的39.2%。蘇和等［9］在對(duì)美利奴羊、無(wú)角陶賽特羊的腹腔鏡輸精試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腹腔鏡輸精受精率92.71%，遠(yuǎn)高于人工授精組的受精率79.33%，并且腹腔鏡輸精有效精子數(shù)0.3億時(shí)，沖胚受精率可達(dá)90.83%。毛鳳顯等［10］在腹腔鏡輸精對(duì)白山羊研究中，采用鮮精有效精子數(shù)0.5億輸精，其母羊受精率達(dá)到85.71%。魏玉剛［11］將精液稀釋5倍采用腹腔鏡子宮角輸精對(duì)卡拉庫(kù)爾羊進(jìn)行試驗(yàn)，其受胎率達(dá)到89.8%，遠(yuǎn)高于人工授精組的受胎率70.9%。許文海［12］在對(duì)薩?？司d羊進(jìn)行腹腔鏡輸精技術(shù)研究中也發(fā)現(xiàn)，輸精密度為3×10個(gè)/mL時(shí)，其可用胚胎率可達(dá)88.2%。從以上研究結(jié)果來(lái)看，將公羊鮮精進(jìn)行多倍稀釋后，受胎率仍可以達(dá)到85%以上，其研究結(jié)果與該次試驗(yàn)結(jié)果基本一致。由此可見，傳統(tǒng)的子宮頸輸精和陰道輸精雖然操作方法較為簡(jiǎn)單，但是由于很多客觀原因，如陰道和子宮頸彎曲程度和皺褶程度高，精子難以穿過(guò)，還容易出現(xiàn)倒流的現(xiàn)象，所以造成傳統(tǒng)輸精方法受胎率低。相比傳統(tǒng)輸精方法，腹腔鏡輸精操作雖然有一定難度，但是經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后短時(shí)間可以掌握，加之對(duì)母羊傷害并不大、受胎率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)輸精方法，應(yīng)該得到大力推廣。另外，從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在腹腔鏡輸精背景下，一定程度上對(duì)精液進(jìn)行高倍稀釋，卵子受精率和可用胚胎率都會(huì)相應(yīng)提高，可以節(jié)省精液，提高優(yōu)質(zhì)公畜精液的利用率。但是，該次試驗(yàn)僅涉及鮮精的使用，對(duì)于不同密度冷凍精液對(duì)腹腔鏡子宮角輸精的效果還有待研究。

3.2不同輸精時(shí)間對(duì)綿羊胚胎移植供體沖胚效果的影響分析該次研究結(jié)果可知，撤栓后48和54 h的腹腔鏡輸精在卵子受精率和可用胚胎率上差異不顯著，但是要高于撤栓后60 h，且差異顯著。高志英等［13］在對(duì)多浪羊的研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓后48 h采用凍精進(jìn)行陰道輸精，受胎率達(dá)到24.52%。肖西山［14］在對(duì)小尾寒羊的研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓后48～60 h采用鮮精連續(xù)陰道輸精2次，受胎率達(dá)到68.33%。韓旭飛等［15］在對(duì)東北細(xì)毛羊的研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓48 h后，腹腔鏡輸精受胎率達(dá)到89.9%。王晶晶［16］在對(duì)美利奴羊的研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓后48 h腹腔鏡輸精受胎率達(dá)到90%，要遠(yuǎn)高于撤栓后24、36和72 h。趙霞等［17］在對(duì)綿羊腹腔鏡輸精研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓后46～58 h獲得的受胎率在89.92%～97.44%，遠(yuǎn)高于其他時(shí)間段的受胎率。張靜等［18］在對(duì)烏珠穆沁羊腹腔鏡輸精研究中發(fā)現(xiàn)，最佳輸精時(shí)間應(yīng)在撤栓后48～58 h，受胎率在92.4%～94.8%。綜上可知，無(wú)論是陰道和子宮頸輸精還是腹腔鏡輸精，輸精時(shí)間均為36～58 h，與該次試驗(yàn)結(jié)果基本一致。綿羊排卵基本發(fā)生在發(fā)情結(jié)束前后，精子維持受精時(shí)間在3 d左右，卵子維持受精的時(shí)間較短，在5 h左右，而綿羊同期發(fā)情大致在撤栓以后的48 h左右。相比傳統(tǒng)輸精方式，腹腔鏡輸精節(jié)省優(yōu)質(zhì)精液的使用量和精子的運(yùn)行時(shí)間。從該試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在撤栓后48～54 h輸精可以使可用胚胎率達(dá)到87.77%，有效地保證輸精效果。但是，該試驗(yàn)僅涉及鮮精的使用，對(duì)于不同時(shí)間段冷凍精液對(duì)腹腔鏡子宮角輸精的效果還有待研究。

4結(jié)論

近年來(lái)，羊的腹腔鏡輸精技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，而精液品質(zhì)的好壞，是此項(xiàng)技術(shù)能否成功推廣的關(guān)鍵。最佳輸精密度和輸精時(shí)間是推廣腹腔鏡輸精技術(shù)、擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)公畜利用率關(guān)鍵技術(shù)之一。輸精密度低，會(huì)導(dǎo)致卵子受精率下降；精液密度過(guò)高，不僅會(huì)浪費(fèi)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，也會(huì)造成惡化精子生存環(huán)境，降低精液品質(zhì)。輸精時(shí)間過(guò)早母羊未及時(shí)排卵，卵子不夠成熟；輸精時(shí)間過(guò)晚卵子會(huì)出現(xiàn)退化，同樣難以完成受精作用。該研究通過(guò)分析不同輸精密度和輸精時(shí)間對(duì)鮮精腹腔鏡子宮角輸精效果，認(rèn)為：在腹腔鏡子宮角輸精技術(shù)背景下，湖羊的輸精最低輸精密度可以設(shè)置為3×108個(gè)/mL，高于此密度卵子受精率和可用胚胎率并沒(méi)有大幅度提高，低于此密度會(huì)造成下降；最佳輸精時(shí)間宜在撤栓后48～54 h。通過(guò)最低輸精密度和最佳輸精時(shí)間的設(shè)置，可以大大提高優(yōu)秀種公羊的利用率和覆蓋面，降低種公羊的飼養(yǎng)規(guī)模，從人力、物力等多方面節(jié)約成本，給羊場(chǎng)帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)效益。

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