體外誘導(dǎo)耐藥及相關(guān)基因檢測(cè)

張騰月　嚴(yán)梓晴　馬驛　丁月霞

摘要［目的］了解常見致病菌產(chǎn)生耐藥性后耐藥基因和毒力基因的變化。［方法］采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定21種臨床常見抗生素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的最小抑菌濃度，選取敏感藥物進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)，采用PCR法檢測(cè)耐藥基因和毒力基因。［結(jié)果］5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株均對(duì)氨基糖苷類藥物敏感；大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類藥物敏感；鼠傷寒沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌和肺炎鏈球菌對(duì)喹諾酮類藥物敏感；金黃色葡萄球菌對(duì)克林霉素敏感。與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，氨基糖苷類和四環(huán)素類耐藥菌株中均檢測(cè)出新出現(xiàn)的相關(guān)耐藥基因；喹諾酮類耐藥基因parE在多殺性巴氏桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐諾氟沙星菌株中檢測(cè)出，gyrB基因僅在肺炎鏈球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐氧氟沙星菌株中檢測(cè)出。在大腸桿菌中均檢測(cè)出CS31A毒力基因，此外標(biāo)準(zhǔn)菌株中檢測(cè)出fimH基因，耐多西環(huán)素菌株中檢測(cè)出afa基因；多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株未檢測(cè)出毒力基因，耐藥菌株中均檢測(cè)出oma87和tbpA基因；而鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌僅在標(biāo)準(zhǔn)菌株中檢測(cè)出毒力基因。［結(jié)論］說明氨基糖苷類抗生素更容易誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥基因，而毒力基因與耐藥基因無明顯的相關(guān)性。細(xì)菌獲得耐藥性后，其毒力基因變化因菌株不同存在差異。

關(guān)鍵詞體外誘導(dǎo)耐藥；耐藥基因；毒力基因；標(biāo)準(zhǔn)菌株；最小抑菌濃度（MIC）

中圖分類號(hào)S859.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2023）08-0075-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.018開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The Inducing Drug-resistance Bacteria in vitro and Detection of Related Gene

ZHANG Teng-yue，YANG Zi-qing，MA Yi et al（College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract［Objective］To evaluate drug resistance genes and virulence genes of the inducing drug-resistance pathogenic bacteria in vitro.［Method］ A total of 21 common antibiotics and 5 standard strains were recruited as the study objects.A broth microdilution method was performed to test standard strains antimicrobial susceptibility and mutants resistant to sensitive antibiotics were selected by stepwise exposure of standard strain to increasing concentrations of drug.PCR was used to determine drug resistance genes and virulence genes.［Result］The results of antimicrobial susceptibility testing showed that five standard strains were highly sensitive to aminoglycoside antibiotics.And Escherichia coli were sensitive to tetracycline antibiotics;Salmonella typhimurium，Pasteurella multocida and Streptococcus pneummoniae were sensitive to quinolones antibiotics;Staphylococcus aureus were sensitive to lincomycin.The results of drug-resistance gene test showed that new resistance genes were detected in aminoglycoside-resistance strains and tetracycline-resistant strains;quinolone resistant gene parE were detected in norfloxacin-resistance and standard strains of Pasteurella multocida;quinolone resistant gene gyrB were detected in ofloxacin-resistance and standard strains of Streptococcus pneumoniae.The results of virulence gene test showed that all the 3 Escherichia coli carried CS31A gene and Escherichia coli standard strains carried fimH ，doxycycline-resistant strains carried afa gene.No virulence genes were detected in Pasteurella standard strain，and oma87 and tbpA genes were detected in the resistant strains.The virulence genes were detected in standard strains of Salmonella typhimurium，Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae.［Conclusion］In general，it was easy to select resistant-strains by aminoglycoside antibiotics.There is no significant correlation between different drug resistance gene and virulence gene.There were differences in virulence gene changes after bacteria acquired drug resistance.

Key wordsInduced resistance in vitro;Drug resistance gene;Virulence gene;Standard strain; Minimum inhibitory concentration（MIC）

近年來集約化養(yǎng)殖帶來的各種環(huán)境污染問題備受關(guān)注，高密度的養(yǎng)殖模式使細(xì)菌性疾病頻發(fā)，目前抗生素仍是治療細(xì)菌感染的主要手段［1］。但是抗生素的不規(guī)范和不科學(xué)使用會(huì)引起藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等問題［2］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括產(chǎn)生水解酶或鈍化酶、改變細(xì)胞膜通透性、激活主動(dòng)外排系統(tǒng)、藥物靶位改變、形成生物被膜、基因突變和獲得外源耐藥基因等［3-4］。目前，細(xì)菌的耐藥情況日益嚴(yán)重，多重耐藥致病菌頻繁出現(xiàn)，給畜牧養(yǎng)殖中的疾病防治帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。環(huán)境中的耐藥基因可以通過垂直傳播遺傳給下一代菌株，也可以通過質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子等進(jìn)行水平傳播，將耐藥基因傳播給周邊環(huán)境中的微生物，其中包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等病原微生物，這類細(xì)菌在自然環(huán)境中廣泛存在，其耐藥基因會(huì)隨著食物鏈傳播，嚴(yán)重威脅人類健康安全［5-7］。相關(guān)研究表明，病原菌的致病力與毒力因子有直接相關(guān)性，某些毒力基因不會(huì)增加致病性，但會(huì)促進(jìn)其在宿主中的定植［8-9］。毒力因子是由毒力基因編碼的產(chǎn)物，通過破壞宿主細(xì)胞或影響細(xì)胞調(diào)控途徑發(fā)揮致病作用［10］。耐藥性和致病性是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的體現(xiàn)，與自身攜帶的耐藥基因和毒力基因有直接關(guān)系［11-12］。病原菌耐藥性增強(qiáng)是否影響致病性已引起廣泛關(guān)注。該研究采用5種病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，通過體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)菌出現(xiàn)耐藥表型后，其耐藥和毒力基因的改變情況，對(duì)細(xì)菌性疾病的防治和臨床指導(dǎo)用藥有重要意義，為研究細(xì)菌耐藥性與致病性的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株多殺性巴氏桿菌（C48-1）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、大腸桿菌（ATCC25922）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC13311）、肺炎鏈球菌（ATCC49619）5種標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.2藥品鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素、新霉素、大觀霉素、青霉素、氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林克拉維酸、頭孢曲松、頭孢噻肟、諾氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、克林霉素、黏菌素、紅霉素、甲砜霉素共21種抗生素，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3主要試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Premix EX Taq versin 2.0、DL1000 DNA Marker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自北京凱歐迪生物科技有限公司；Goldview核酸染色劑，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；TBE緩沖液、試驗(yàn)所用引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC測(cè)定參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI），采用微量肉湯二倍稀釋法，測(cè)定21種抗生素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC。根據(jù)21種抗生素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值，選擇2種不同種類的敏感抗生素進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)。

1.5體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)采用藥物濃度梯度遞增法誘導(dǎo)耐藥菌株，初次誘導(dǎo)的藥物濃度為1/2 MIC。將各菌株接種于藥物濃度遞增的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，待細(xì)菌生長(zhǎng)狀況良好后傳代培養(yǎng)3代。采用相同的方法以2倍遞增濃度繼續(xù)誘導(dǎo)菌株，直至藥物濃度為128倍MIC，誘導(dǎo)停止。獲得的耐藥菌株在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)8代，以確保其并非適應(yīng)性生長(zhǎng)，測(cè)定其MIC。

1.6耐藥基因和毒力基因的檢測(cè)耐藥菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測(cè)的相關(guān)耐藥基因與毒力基因見表1和表2。PCR擴(kuò)增體系為DNA模板0.500 μL，上下游引物各0.500 μL，dNTPs 2.00 μL，Taq酶0.125 μL，10×PCR buffer 2.500 μL，ddHO補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有目標(biāo)條帶。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC測(cè)定根據(jù)21種抗生素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC選擇2種不同種類的敏感抗生素進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)，誘導(dǎo)耐藥前后各菌株的MIC見表3。結(jié)果顯示，5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株均對(duì)氨基糖苷類抗生素（鏈霉素、慶大霉素或阿米卡星）敏感；此外，大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素較敏感；鼠傷寒沙門氏菌和多殺性巴氏桿菌均對(duì)諾氟沙星敏感；金黃色葡萄球菌對(duì)克林霉素敏感；肺炎鏈球菌對(duì)氧氟沙星敏感。

2.2體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)由表3可知，耐藥菌株經(jīng)8次傳代培養(yǎng)后的MIC 與標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC相比，其增長(zhǎng)倍數(shù)不同。耐慶大霉素鼠傷寒沙門氏菌和耐氧氟沙星肺炎鏈球菌的MIC與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比增長(zhǎng)了1 023倍以上，而耐慶大霉素大腸桿菌和耐諾氟沙星鼠傷寒沙門氏菌的MIC與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比僅增長(zhǎng)了15倍。

2.3耐藥基因檢測(cè)由表4可知，大腸桿菌誘導(dǎo)耐藥前后菌株相比，標(biāo)準(zhǔn)菌株中沒有檢測(cè)出氨基糖苷類和四環(huán)素類耐藥基因；耐慶大霉素菌株中檢測(cè)出aac（3）-Ⅱa基因；耐多西環(huán)素菌株中檢測(cè)出tetA基因。鼠傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)耐藥前未檢測(cè)出氨基糖苷類和喹諾酮類耐藥基因；而耐鏈霉素菌株中檢測(cè)出aacC4基因；耐慶大霉素菌株中檢測(cè)出aacC2、aacC4和Aph（3′）-Ⅱa基因。多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐諾氟沙星菌株中均檢測(cè)出parE基因；耐鏈霉素菌株中檢測(cè)出aacC2基因；耐慶大霉素菌株中檢測(cè)出aacC2和strB基因。金黃色葡萄球菌的耐阿米卡星菌株檢測(cè)出aac（3）-Ⅱa基因，而標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐克林霉素菌株中均沒有檢測(cè)出耐藥基因。肺炎鏈球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐氧氟沙星菌株中檢測(cè)出gyrB基因；耐鏈霉素菌株和耐慶大霉素菌株中檢測(cè)出aacC2基因。

51卷8期張騰月等體外誘導(dǎo)耐藥及相關(guān)基因檢測(cè)2.4毒力基因檢測(cè)各菌株致病基因檢測(cè)結(jié)果見表4。表4表明，大腸桿菌誘導(dǎo)耐藥菌株中均檢測(cè)出CS31A基因，而標(biāo)準(zhǔn)菌株中檢測(cè)出fimH基因，耐多西環(huán)素菌株中檢測(cè)出afa基因。多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株未檢測(cè)出毒力基因，而3種耐藥菌株中均檢測(cè)出oma87和tbpA基因。鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌均在標(biāo)準(zhǔn)菌株中檢測(cè)出毒力基因，而耐藥菌株中未檢測(cè)出毒力基因。

3討論與結(jié)論

大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和肺炎鏈球菌都是能夠引起人獸共患病的病原微生物，在自然環(huán)境中廣泛分布［13-15］。隨著細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，這類病原微生物的耐藥性和致病性研究也引起越來越多學(xué)者的關(guān)注。該研究對(duì)5種病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素和喹諾酮類抗生素對(duì)5種病原菌有較好的抑制效果，其中慶大霉素和鏈霉素的抑菌作用更加突出。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基糖苷類耐受菌株中均檢測(cè)出氨基糖苷修飾酶的編碼基因，包括氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶，說明產(chǎn)生修飾酶是病原菌耐受氨基糖苷類抗生素的最廣泛、最主要的機(jī)制［16］。多殺性巴氏桿菌與肺炎鏈球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和喹諾酮類抗生素耐受菌株中檢測(cè)出耐藥基因gyrB和parE，耐藥菌株中未檢測(cè)出新的喹諾酮類耐藥基因。喹諾酮類抗生素耐藥的主要機(jī)制是藥物作用的靶位點(diǎn)的基因突變，即由編碼DNA促旋酶的gyrA/gyrB基因和編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC /parE基因發(fā)生突變，通常gyrB和parE基因突變對(duì)耐藥性的影響較?。?7-19］。該試驗(yàn)中，耐多西環(huán)素大腸桿菌中檢測(cè)出tetA基因，該基因編碼四環(huán)素的外排蛋白，通過外排蛋白將藥物主動(dòng)排出胞外，降低胞內(nèi)的藥物濃度，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［20］。崔佳佳等［21］在強(qiáng)力霉素體外誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌耐藥試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后的耐藥菌株中出現(xiàn)tetA基因，猜測(cè)tetA基因在該菌耐藥機(jī)制中有極其重要的作用。

由于病原菌的耐藥性和致病性進(jìn)化時(shí)間不同步，所以研究二者的選擇和進(jìn)化機(jī)制有較大難度［22］。楊立軍等［23］研究發(fā)現(xiàn)，禽致病性大腸桿菌的致病性與耐藥性存在一定的相關(guān)性，90%的強(qiáng)毒株對(duì)10種以上抗生素耐受，具有多重耐藥性。張珍等［24］對(duì)10株廣西雞源沙門氏菌研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌耐藥種類越多，攜帶耐藥基因數(shù)量越多，其對(duì)小鼠的毒力越強(qiáng)，說明沙門氏菌的耐藥性與致病性呈正相關(guān)關(guān)系。方艷紅［25］研究發(fā)現(xiàn)，非傷寒沙門氏菌耐藥性改變時(shí)，其毒力基因不會(huì)發(fā)生明顯變化。王德寧［26］研究發(fā)現(xiàn)，病雞中分離的沙門氏菌的耐藥性與致病性之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。該研究中，大腸桿菌中均檢測(cè)出CS31A基因，此外標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐多西環(huán)素菌株中分別檢測(cè)出大腸桿菌粘附因子基因afa、fimH；多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株未檢測(cè)出毒力基因，耐藥菌株中均檢測(cè)出外膜蛋白編碼基因oma87和轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A編碼基因tbpA；而鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌僅在標(biāo)準(zhǔn)菌株中檢測(cè)出毒力基因。綜合來看，毒力基因與耐藥基因無明顯的相關(guān)性。目前相關(guān)研究報(bào)道中細(xì)菌耐藥性對(duì)致病性的影響有增強(qiáng)作用、減弱作用或者無明顯的相關(guān)性，這或許與細(xì)菌種類、耐藥機(jī)制、致病機(jī)制等有關(guān)［27-28］。現(xiàn)有研究還不足以闡明兩者間的關(guān)系，還需進(jìn)行深入研究。

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)菌株均對(duì)氨基糖苷類藥物敏感，而氨基糖苷類抗生素更易誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥基因。細(xì)菌獲得耐藥性后，其毒力基因變化因菌株不同存在差異，且毒力基因與耐藥基因無明顯的相關(guān)性。

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