紅參低氘水精華液的研發(fā)

段瑞培, 劉如佳, 劉祎寧, 羅元鴻, 崔承弼

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133000)

紅參為人參經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖[1]。紅參性溫,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)、心血管和內(nèi)分泌,補(bǔ)氣益血、養(yǎng)心安神等功效。紅參具有抗氧化能力,可清除羥自由基,其活性成分中的Rg5清除自由基的效果最佳[2]。

低氘水(LDW)是指氘豐度低于天然豐度的水,是一種穩(wěn)定同位素產(chǎn)品。低氘水可以預(yù)防疾病、延緩衰老、活化機(jī)體免疫細(xì)胞,防治癌癥[3]。低氘水是改進(jìn)化妝品品質(zhì)的安全且有效的組分,有助于提高皮膚細(xì)胞抗老化、保濕、抗紫外線照射、抗過敏等功能[4]。

黃原膠分子中含有大量的親水基團(tuán),是一種良好的表面活性物質(zhì),具有抗氧化、防止皮膚衰老等功效。因此,幾乎絕大多數(shù)高檔化妝品都將黃原膠作為其主要功能成分[5]。王昌濤等以甘油作為保濕劑,研究其保濕功效,得出化妝品中添加甘油有良好的保濕效果[6]。因此,該試驗(yàn)選擇以低氘水研制紅參功效成分的精華液,以期達(dá)到具有顯著美白功效、顯著抗氧化能力、符合化妝品行業(yè)有關(guān)規(guī)定的精華液。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

低氘水(瀘州哈羅德健康科技有限公司);紅參(長白山科學(xué)研究院提供);75%乙醇;甘油;黃原膠;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉);透明質(zhì)酸鈉;1,3-丁二醇;尿囊素;蓖麻油;青花香精;蒸餾水;維生素C(Vc);磷酸鹽緩沖溶液(PBS,Gibco公司);L-酪氨酸(Sigma試劑公司);酪氨酸酶(諾維信生物技術(shù)有限公司)。

1.2 設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(HWS-24型,上海百典儀器設(shè)備有限公司);水浴鍋(OSB-2100-CE型,東京理化器械株式會(huì)社);落地式連續(xù)投料粉碎機(jī)(DF-35,溫嶺市林大機(jī)械有限公司);多功能熒光酶標(biāo)儀(SP-Max3500FL型,上海閃譜生物科技有限公司);離心機(jī)(TG16A-WS型,上海盧湘儀器有限公司);分析天平(FA2004型,上海上平儀器有限公司);立式鼓風(fēng)干燥箱(DHC-9620A型,上海百典儀器設(shè)備有限公司);pH計(jì)(FE28型)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 紅參提取方法

采用水提醇沉法[7]提取紅參中的有效成分。200 g紅參稱重粉碎,按照料液比1∶20(g∶mL)加入75%乙醇,40 ℃蒸煮2 h,用離心機(jī)以4 000 r/min離心3 min,取上清液,濾渣重復(fù)操作1次,最后結(jié)合3次離心的上清液進(jìn)行旋蒸濃縮,離心取上清液,將上清液置于-80 ℃冷凍后凍干成粉末,提取物粉末密封保存在4 ℃冰箱中[8]。

2.2 單因素與正交試驗(yàn)

2.2.1 單因素試驗(yàn)

1) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 準(zhǔn)確稱取紅參粉末0.1 g(精確到0.000 1 g)置于10 mL容量瓶,蒸餾水定容,配制成10%的儲(chǔ)備液。

參考李波等[9]制作靈芝面膜精華液的基礎(chǔ)配方,選定紅參提取液添加量、甘油添加量以及黃原膠添加量作為單因素試驗(yàn)的對象,在此基礎(chǔ)配方中黃原膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～0.25%,參考林志魁等[10]研制的一種新型瓊膠寡糖面膜精華液中甘油添加量4%～12%、瓊膠寡糖添加量0.6%～1.4%,制定單因素試驗(yàn)的濃度梯度。

2) 紅參提取液添加量的選擇 在甘油10%,黃原膠0.15%的條件下,以0.5%、1%、2%、3%和4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的紅參提取液濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn),根據(jù)感官評價(jià)確定3個(gè)最優(yōu)值,以確定制作功能性低氘水精華液中紅參提取液的最優(yōu)濃度。

3) 甘油添加量的選擇 在紅參提取液1%,黃原膠0.15%的條件下,以6%、8%、10%、12%和14%的甘油添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn),根據(jù)感官評價(jià)確定3個(gè)最優(yōu)值,以確定制作精華液甘油的最優(yōu)添加量。

4) 黃原膠添加量的選擇 在紅參提取液1%,甘油10%的條件下,以0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的黃原膠添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn),根據(jù)感官評價(jià)確定3個(gè)最優(yōu)值,以確定制作精華液黃原膠的最優(yōu)添加量。

精華液感官標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 精華液感官評價(jià)指標(biāo)

2.2.2 正交試驗(yàn)

利用正交試驗(yàn)表L9(33)設(shè)計(jì)試驗(yàn),正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下(表2)。

將紅參提取液(0.5%、1%、2%)、甘油(8%、10%、12%)、黃原膠(0.10%、0.15%、0.20%)作為變量,進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)。DPPH自由基在517 nm下有吸收峰[11],在517 nm測定各組的DPPH自由基清除率,以DPPH自由基清除率作為正交試驗(yàn)結(jié)果的判斷依據(jù)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

DPPH自由基清除率試驗(yàn)操作時(shí),按表3在96孔板中進(jìn)行點(diǎn)樣:對照組(AC)加入20 μL蒸餾水、180 μL DPPH(DPPH濃度:稱取1.971 6 mg DPPH,在閉光環(huán)境中用無水乙醇定容至50 mL);空白組(ACB)加入20 μL蒸餾水、180 μL乙醇;樣品組 (AS)加入20 μL不同濃度的樣品溶液、180 μL DPPH;樣品空白組 (ASB)加入20 μL不同濃度的樣品溶液、180 μL乙醇(75%);點(diǎn)樣完成后,在避光條件下,在560 nm處測定吸光度[12]。每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次,結(jié)果取平均值。

表3 DPPH自由基清除試驗(yàn)

所得數(shù)據(jù)根據(jù)公式計(jì)算DPPH自由基清除率:

式中,AC:對照組吸光度;ACB:空白組吸光度;AS:樣品組吸光度;ASB:樣品空白組吸光度。

2.3 精華液的制備

在制備過程中使用的儀器與設(shè)備均需經(jīng)過紫外線滅菌和乙醇消毒。產(chǎn)品配方參考李波等[9,13-14]人制備靈芝面膜精華液的方法(表4)。

表4 低氘水精華液的配方

1) 制備A相溶液:取甘油、黃原膠、尿囊素、1,3-丁二醇、蓖麻油,在80～90 ℃水浴條件下加熱,攪拌均勻。

2) 制備B相溶液:取適量低氘水,加入EDTA二鈉、紅參提取液,攪拌至溶解完全。

3) 將A相溶液加入B相溶液中,攪拌均勻,在80～ 90 ℃下保溫30 min,繼續(xù)攪拌10 min,冷卻后加入C相溶液,繼續(xù)攪拌5 min,即得紅參精華液。

2.4 理化指標(biāo)的測定

2.4.1 pH值測定

參考林志魁[10]的方法,取1 mL精華液,加入去離子水9 mL,充分?jǐn)嚢璨⒓訜嶂?0 ℃,放置冷卻至室溫,用pH計(jì)測定其pH值,每個(gè)樣品測定3次,取其平均值。參照GB/T 13531.1-2008《化妝品通用檢測法》,pH值在3.5～8.5均符合要求。

2.4.2 離心穩(wěn)定性測試

取5 g于10 mL離心管中,于3 000 r/min離心15 min,觀察其是否有分層、浮油、變色等現(xiàn)象[15]。

2.4.3 美白功效的評定

通過對酪氨酸酶活性的影響試驗(yàn)判定該精華液的美白功效。

參照文獻(xiàn)[16],取1 mL精華液,將其稀釋至1、1.5、2、2.5、3 mL。按表5在2 mL離心管中加入pH值6.8的PBS緩沖液、樣品溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的L-酪氨酸溶液、用磷酸鹽緩沖溶液配制的質(zhì)量濃度為200 μg/mL的酪氨酸酶溶液,每組的總反應(yīng)體系為1.4 mL。將溶液充分搖勻后,在37 ℃水浴鍋中加熱20 min。取出后,向96孔板點(diǎn)樣,每個(gè)孔中加入200 μL樣液,在475 nm處測定其吸光度。

每組稀釋樣品以同濃度VC作為陽性對照(稱取與樣品相同的質(zhì)量,定容到相同體積的容量瓶中,用與樣品的稀釋倍數(shù)相同的溶劑,稀釋成與樣品相同的濃度梯度)。

表5 抑制酪氨酸酶試驗(yàn)

根據(jù)公式計(jì)算得出樣品對酪氨酸酶的抑制率:

2.5 安全性評價(jià)

通過人體試用實(shí)驗(yàn)觀察樣品對人體皮膚的安全性,選取年齡在20～55歲的33名志愿者組成安全性評價(jià)小組。受試者直接將精華液涂抹于手背。電話隨訪受試者有無皮膚反應(yīng)或全身性不良反應(yīng)如惡心、乏力、月經(jīng)紊亂及其他不適等,觀察涂抹樣品部位皮膚反應(yīng),按表6皮膚反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)記錄結(jié)果。試用時(shí)間為8周。受試者回訪時(shí),仔細(xì)詢問、檢查并記錄受試者在使用樣品期間所發(fā)生的任何不良事件[17-18]。

表6 人體試用試驗(yàn)皮膚反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素與正交試驗(yàn)

紅參提取物具有滋養(yǎng)皮膚、防治皮膚粗糙和生成小皺紋等功效,其用量對精華液品質(zhì)的影響為:隨紅參提取物含量的增加,精華液感官評分呈先上升后下降的趨勢,在添加量為0.5%～2%時(shí),分值較高(表7)。紅參提取物呈紅褐色,添加量過多時(shí)精華液顏色過深。在一定范圍內(nèi),DPPH自由基清除率與摩爾濃度呈正相關(guān)關(guān)系[19]。經(jīng)成本、評分等多因素綜合分析,選擇0.5%、1%和2%的紅參提取物含量作進(jìn)一步的正交試驗(yàn)。

表7 紅參提取物添加量對精華液感官品質(zhì)的影響

甘油是一種常用的化妝品保濕劑,會(huì)對產(chǎn)品的黏感、厚重感、滋潤度和補(bǔ)水性起作用。但甘油具有一定的黏性,因此甘油添加量過低或過高都會(huì)對以上指標(biāo)產(chǎn)生不良影響。經(jīng)此次單因素試驗(yàn)后,選取8%、10%和12%的添加量進(jìn)行正交試驗(yàn)(表8)。

表8 甘油添加量對精華液感官品質(zhì)的影響

黃原膠又名黃桿菌膠,是一種天然食品增稠劑。黃原膠在精華液中主要作增稠劑使用[20],添加量過多會(huì)導(dǎo)致精華液過稠而厚重油膩,不易被皮膚吸收;添加量過少會(huì)導(dǎo)致精華液過稀,延展性過強(qiáng),像水一樣。因此,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,選取0.1%、0.15%和0.2%作正交試驗(yàn)(表9)。

表9 黃原膠添加量對精華液感官品質(zhì)的影響

最終選取紅參提取液0.5%、1%、2%,甘油8%、10%、12%,黃原膠0.1%、0.15%、0.2%進(jìn)行正交試驗(yàn),用以確定最終配方。

取紅參、甘油、黃原膠進(jìn)行DPPH自由基清除率試驗(yàn),結(jié)果如表10所示。

表10 低氘水精華液配方正交試驗(yàn)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知,最佳因素組合為A3B1C3,即紅參提取液2%,甘油8%,黃原膠0.2%時(shí),對DPPH的清除效果最好。其中,紅參是發(fā)揮抗氧化作用的主要成分,甘油作為保濕劑,黃原膠因其含有大量的親水基團(tuán),作為流變調(diào)節(jié)劑,并兼有抗氧化、抗衰老等功效。

3.2 理化性質(zhì)

3.2.1 pH值測定

用pH計(jì)測定樣品的pH值,3次測定結(jié)果均為5.2,符合《化妝品通用檢測法》所規(guī)定的要求。

3.2.2 離心穩(wěn)定性測試

離心管中的5 mL精華液在經(jīng)過3 000 r/min離心15 min后,并未出現(xiàn)分層、浮油、變色等現(xiàn)象,表明精華液具有良好的離心穩(wěn)定性。

3.2.3 美白功效的評定

美白過程是指抑制酪氨酸酶活性,對作用于黑色素代謝的各個(gè)階段進(jìn)行調(diào)控,從而達(dá)到抑制黑色素生成的目的。參與黑色素合成過程的一系列酶中最關(guān)鍵的是酪氨酸酶[21],研究表明酪氨酸酶活性過高會(huì)導(dǎo)致黑色素過度地生成,還會(huì)導(dǎo)致人體皮膚產(chǎn)生色素性疾病[22],對酪氨酸酶進(jìn)行活性調(diào)節(jié)是影響黑色素合成的關(guān)鍵。因此,對酪氨酸酶的抑制作用是評價(jià)美白作用的一項(xiàng)重要指標(biāo)。從試驗(yàn)結(jié)果可以看到,未稀釋的精華液對酪氨酸酶的抑制率最大,隨著精華液稀釋倍數(shù)的增加,其對酪氨酸酶的抑制率也下降。因此,通過對酪氨酸酶活性的影響試驗(yàn)可以判定該精華液的美白功效(表11)。

表11 低氘水精華液的酪氨酸酶抑制率

3.3 產(chǎn)品安全性評估

研究期間33名受試者僅1位出現(xiàn)微弱紅斑,參考表6中規(guī)定的人體試用皮膚不良反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn),評定測試樣品具有良好的安全性[23](表12)。

表12 安全性評價(jià)表

4 討論與結(jié)論

目前,市場上常見的精華液以靈芝[9]、茶葉[24]為主要的天然成分,還有不少對天然多糖類[25]和中藥材類[26]精華液的研究。而該試驗(yàn)以紅參為主要成分,以低氘水為特色成分,側(cè)重于配方優(yōu)化,后續(xù)對其功能活性進(jìn)行了研究。

紅參多糖能清除DPPH自由基和羥自由基[27],在正交試驗(yàn)中,紅參提取液清除DPPH自由基的能力隨著濃度(0.5%→2%)的增加而增強(qiáng),這與李慧萍[28]證明的紅參提取物含量與其體外抗氧化能力呈現(xiàn)一定的相關(guān)關(guān)系一致。且與袁元等[29]人的研究結(jié)果一致,但袁元等人的研究主要側(cè)重于對紅參、白參和黑參抗氧化效果的對比,黑參強(qiáng)于紅參和白參,因此,能否用黑參代替紅參作為精華液的有效成分還有待探索。

紅參提取物的添加量影響精華液的色澤和抗氧化性。甘油作為主要的保濕劑,可以保護(hù)皮膚的表皮層和真皮層的水分不流失,使肌膚保持良好狀態(tài)。黃原膠作為增稠劑,起到使產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定不分層的功效,但過量時(shí)易導(dǎo)致成品過于黏稠,功效成分無法被完全吸收。經(jīng)正交試驗(yàn)最終選定的精華液配方為:紅參提取液2%、甘油8%、黃原膠0.2%、1,3-丁二醇5%、蓖麻油1%、尿囊素0.2%、EDTA二鈉0.03%、香精0.05%,最后低氘水補(bǔ)至100 mL。

從試驗(yàn)結(jié)果來看,紅參低氘水精華液對酪氨酸酶具有顯著的抑制作用。張亞茹等[30]人研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的低氘水均能抑制酪氨酸酶活性,但他們的研究主要側(cè)重于不同ppm的低氘水對酪氨酸酶活性的影響。同時(shí),Parvez S[31]和黃寶亮等[32]人研究發(fā)現(xiàn),紅參中的熊果苷和精氨酸雙糖苷均能通過相應(yīng)的作用機(jī)制抑制酪氨酸酶的活性。這表明低氘水和紅參對酪氨酸酶活性均有抑制作用,與試驗(yàn)結(jié)果一致,但低氘水和紅參共同使用是否存在協(xié)同作用還有待進(jìn)一步探討。

除了功效外,精華液的離心穩(wěn)定性和pH值直接影響其品質(zhì)。根據(jù)《化妝品通用檢測法》,在3 000 r/min離心15 min未出現(xiàn)分層、浮油、變色等現(xiàn)象,即可表明精華液具有良好的離心穩(wěn)定性,試驗(yàn)表明該精華液具有較好的離心穩(wěn)定性,同時(shí)pH值為5.2,表明精華液溫和無刺激。

化妝品接觸性皮炎根據(jù)發(fā)病機(jī)制和誘因不同可以分為過敏性接觸性皮炎(CACD)和刺激性接觸性皮炎(CICD)。過敏性接觸性皮炎(ACD)非常常見,約5人中就有1人發(fā)生[33]。目前報(bào)道中最常見引起CACD的過敏原主要有:香料、防腐劑、染料中的對苯二胺、表面活性劑等[34]。該試驗(yàn)中引起志愿者發(fā)生微弱紅斑的可能是由青花香精、甘油或1,3-丁二醇引起的。雖然宋利萍[35]研究發(fā)現(xiàn),紅參對被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)和接觸性皮炎具有抑制作用,但王智彪[36]也報(bào)道過相關(guān)紅參過敏的案例,因此,也不排除志愿者可能對紅參過敏。

綜上所述,以紅參提取物為原材料所制成的低氘水精華液質(zhì)地均勻、性質(zhì)穩(wěn)定,溫和無刺激,具有良好的美白功效,且契合目前對化妝品“天然”的要求,為消費(fèi)者提供了一種天然健康護(hù)膚產(chǎn)品的生產(chǎn)可能。