姜酮對急性心肌梗死大鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制研究

張帆,劉江文,唐艷紅,黃從新

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是全球心血管疾病中致死率最高的疾病之一,主要是由于冠狀動脈閉塞或冠狀靜脈痙攣導(dǎo)致心肌細(xì)胞急性缺血缺氧,從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死[1]。一般將心肌梗死分為3個階段:炎性反應(yīng)期、修復(fù)期及重塑期[2]。在炎性反應(yīng)期,過強(qiáng)的炎性反應(yīng)會波及殘存的心肌細(xì)胞進(jìn)一步加劇心肌組織的壞死[3]。Marinkovic等[4]通過S100A9抑制心肌梗死早期炎性反應(yīng)可明顯逆轉(zhuǎn)心功能的衰竭。因此,早期采取抗炎措施能減少心肌組織的丟失,加快心臟的修復(fù)及重塑,緩解心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生[5]。姜除了作為常見的天然香料以外,還可用于治療多種疾病。姜的藥理活性主要?dú)w功于姜中的生物活性成分——姜酮,其具有抗氧化、抗炎及抗菌等多種藥理學(xué)特性[6]。Hsiang 等[7]通過活體小鼠發(fā)光證實(shí)姜酮可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)上調(diào)來發(fā)揮抗炎作用。除此之外,Ahmad等[8]發(fā)現(xiàn)姜酮通過增加還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性實(shí)現(xiàn)對氧化應(yīng)激的抑制。但姜酮在心血管領(lǐng)域藥用作用研究較少,本文就姜酮在急性心肌梗死大鼠模型中的作用及機(jī)制展開研究,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動物:雄性SPF級SD大鼠,體質(zhì)量(180±20)g,由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)溫度為22℃～25℃,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。試劑:姜酮(ZGR)購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;SOD、丙二醛(MDA)試劑盒購自武漢賽培生物科技有限公司;核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)、NF-κB一抗購自美國Cell Signaling公司。儀器設(shè)備:VINNO V6小動物超聲儀購自飛依諾科技股份有限公司;凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2022年7—9月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管病研究所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將30只大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分為Sham組、心肌梗死(MI)組、MI+ZGR組,每組10只。MI+ZGR組給予ZGR(6 mg·kg-1·d-1)[9]灌胃預(yù)處理14 d后造模,其余2組等量生理鹽水灌胃。MI組、MI+ZGR組模型制備:于大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)麻醉,備皮后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺,連接小動物呼吸機(jī)輔助呼吸(70次/min)。予以碘伏消毒后于大鼠胸骨左緣1 cm處剪開皮膚,分離肌肉,于第3、4 肋間鈍性開胸,充分暴露心臟后,在左心耳下緣約2 mm處用6-0眼科帶線縫合針結(jié)扎左冠狀動脈前降支,心尖部變白提示AMI造模成功。隨后擠出胸腔空氣,依次縫合肋間、肌肉和皮膚。待大鼠恢復(fù)自主呼吸后撤除呼吸機(jī)。Sham組施行相同的操作步驟但不結(jié)扎動脈。ZGR組術(shù)后繼續(xù)給藥1周,Sham組、MI組給予等量生理鹽水處理。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 超聲心動圖檢查:造模成功的第7天,使用小動物超聲儀將探頭置于大鼠左心室乳頭肌平面檢測大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。測量指標(biāo):左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室短軸縮短率(LVFS)和左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。其測量結(jié)果取5個心動周期中的平均測量值。

1.3.2 組織病理學(xué)檢查:于大鼠腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉,麻醉完成后固定于手術(shù)臺后開胸。使用真空采血管于腹主動脈取血1 ml,迅速剪取心臟并分離保存于4%多聚甲醛中固定。進(jìn)行包埋、切片、脫蠟、脫水、沖洗,使用蘇木素—伊紅(HE)染色。通過顯微鏡觀察組織的病理變化。

1.3.3 ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α及心肌組織SOD、MDA水平:將此前采集的血樣于室溫存放60 min,使用離心機(jī)離心獲取血清。取大鼠心肌組織,使用研磨儀研磨成勻漿。按照試劑盒說明書操作流程分別檢測血清炎性因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平及心肌SOD、MDA水平。

1.3.4 Western-blot檢測大鼠心肌組織HO-1、Nrf2、NF-κB蛋白的表達(dá)水平:取大鼠心肌梗死周邊組織,加RIPA裂解液,置于研磨儀中裂解。離心后取上清提取總蛋白,使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量。隨后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,電泳結(jié)束后對蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉。與Nrf2、HO-1、NF-κB一抗在4℃下孵育過夜,再與二抗孵育1 h。孵育完成后通過ECL試劑進(jìn)行顯影,使用掃描儀進(jìn)行條帶掃描,Image J軟件用于條帶的分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠超聲心動圖結(jié)果比較 心臟超聲檢查結(jié)果顯示,與Sham組比較,MI組大鼠的LVEDD、LVESD均顯著增大(P<0.01),LVEF、LVFS顯著降低(P<0.01)。而與MI組比較,MI+ZGR組大鼠的LVEDD、LVESD降低(P<0.05或P<0.01),LVEF、LVFS升高(P<0.05),見表1。

2.2 各組大鼠心肌組織病理改變比較 病理學(xué)結(jié)果顯示,Sham組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,結(jié)構(gòu)正常,未見炎性細(xì)胞浸潤。而MI組大鼠視野可見明顯炎性細(xì)胞浸潤,間質(zhì)水腫及心肌細(xì)胞壞死。與MI組比較,ZGR處理可以顯著減輕AMI大鼠炎性細(xì)胞的浸潤,改善細(xì)胞腫脹程度,見圖1。

2.3 ZGR對AMI大鼠血清IL-6、TNF-α及心肌組織SOD、MDA的影響 與Sham組比較,MI組大鼠血清IL-6、TNF-α顯著上調(diào)(P<0.01),心肌組織中的SOD顯著下降(P<0.01),MDA顯著上升(P<0.01)。與MI組比較,MI+ZGR組大鼠血清IL-6、TNF-α顯著降低(P<0.01),心肌組織SOD顯著上調(diào)(P<0.01),MDA顯著下降(P<0.01),見表2。

表1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較

圖1 ZGR對AMI大鼠心肌組織病理變化的影響(HE染色,×200)

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α及心肌組織SOD、MDA表達(dá)比較

注:與Sham組比較,aP<0.01;與MI組比較,bP<0.01。

2.4 ZGR對AMI大鼠心肌組織Nrf2、HO-1及NF-κB蛋白表達(dá)的影響 與Sham組比較,MI組大鼠的心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著降低,NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與MI組比較,MI+ZGR組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),NF-κB蛋白水平顯著降低(P<0.01),見圖2。

3 討 論

心肌梗死誘發(fā)的心臟損傷可導(dǎo)致無菌性炎性反應(yīng),成纖維細(xì)胞首先受到缺血和缺氧的影響,其通過上調(diào)TLR-NF-κB途徑促進(jìn)pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄及翻譯[10],激活NLRP3炎性小體后切割pro-IL-1β活化IL-1β,最終釋放IL-1β[11]。IL-1β在心肌梗死的炎性反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其可誘導(dǎo)最初的促炎反應(yīng)和細(xì)胞因子/趨化因子的釋放,并招募和激活炎性細(xì)胞[12]。

在心肌線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的能量代謝過程中會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS),通常情況下活性氧的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡之中[13]。在生理狀態(tài)下,其對調(diào)節(jié)心臟發(fā)育、收縮及能量代謝均有著重要意義[14]。然而在缺血、缺氧等病理狀態(tài)下,活性氧水平異常升高會使心肌進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。大量活性氧的堆積會損傷DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì),同時引起線粒體的損傷,導(dǎo)致心肌功能異常及心肌細(xì)胞死亡。這一過程常見于心力衰竭及心肌缺血等病理狀態(tài)中。氧化應(yīng)激同樣對IL-1β的激活起到了重要作用[15]。在心肌梗死發(fā)生之后,巨噬細(xì)胞中線粒體的活性氧積累顯著增加,導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1β的大量表達(dá)[16]。而心肌梗死后炎性反應(yīng)的加重、延長或擴(kuò)大會導(dǎo)致心肌梗死后更嚴(yán)重的心肌重塑和功能障礙[17-18]。通過適當(dāng)?shù)目寡字委熆蓽p少心肌纖維化并改善心臟重塑[19]。

姜酮是一種天然提取的生物活性物質(zhì),姜酮已被證實(shí)可激活A(yù)MPK/Nrf2/HO-1緩解哮喘中的炎性反應(yīng)[6,20]。在肺纖維化中,姜酮也展現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激及抗炎性反應(yīng)作用[21]。Zhu等[22]的研究顯示,姜酮可以通過誘導(dǎo)活化Nrf2,使得中性粒細(xì)胞中的活性氧水平下降。既往研究表明,Nrf2的激活能顯著改善心肌梗死的炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平[23]。因此,認(rèn)為姜酮可通過改變Nrf2、NF-κB發(fā)揮抗炎及抗氧化應(yīng)激作用。在本次研究中,發(fā)現(xiàn)姜酮可顯著改善心功能,并且減少炎性細(xì)胞在心肌組織中的浸潤。通過檢測各組大鼠血清指標(biāo),姜酮可顯著減輕血清中炎性指標(biāo)及心肌組織中氧化應(yīng)激的水平,并上調(diào)抗氧化應(yīng)激分子水平。

NF-κB是關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號分子,在心肌梗死的狀態(tài)下,存在眾多信號通路使其活化,從而驅(qū)動TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18等促炎基因的表達(dá)[24],同時通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NF-κB的持續(xù)活化會加劇心臟重塑,而在缺血—再灌注期間抑制NF-κB的表達(dá)有助于減輕心肌炎性反應(yīng),減小梗死面積[25]。Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子,它可以通過調(diào)節(jié)一系列抗氧化酶和抗炎因子的基因表達(dá)來減輕細(xì)胞損傷,如促進(jìn)HO-1的表達(dá)。HO-1具有酶活性,可以降解血紅素并產(chǎn)生低濃度一氧化碳。少量的一氧化碳可以促進(jìn)線粒體的合成[26]。通過人為誘導(dǎo)Nrf2的表達(dá)有助于在缺血條件下減少心肌梗死的面積,保護(hù)左心室功能及減少心律失常等不良事件的發(fā)生[27]。在本研究中,通過蛋白免疫印跡技術(shù),發(fā)現(xiàn)姜酮能通過降低NF-κB水平、激活Nrf2/HO-1的表達(dá)來發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用。心臟超聲及心肌組織病理也證實(shí),其可以改善心肌梗死大鼠的心臟功能狀態(tài)。

綜上所述,姜酮可通過抑制炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)來保護(hù)心肌梗死后的心功能,但是其作用的詳細(xì)機(jī)制及臨床應(yīng)用需要進(jìn)一步的研究去驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張帆:設(shè)計研究方案,實(shí)施研究過程,分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),論文撰寫;劉江文:提出研究思路,資料搜集整理,論文修改;唐艷紅:論文審核;黃從新:課題設(shè)計,論文審核