肛周膿腫組織SBP1、IL-17表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

羅蕾,黃鴻翔,莊怡青,唐英

肛周膿腫為臨床常見的肛腸疾病,主要是由于細(xì)菌入侵導(dǎo)致肛管直腸周圍軟組織內(nèi)或其周圍間隙內(nèi)的急性化膿性感染[1]。部分患者切開引流術(shù)后出現(xiàn)肛瘺或膿腫復(fù)發(fā),給患者的身心、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)帶來(lái)嚴(yán)重影響[2]。因此了解影響肛周膿腫患者預(yù)后的因素有利于及時(shí)進(jìn)行干預(yù),并提高患者的治愈率。研究顯示,肛周膿腫組織中炎性分子的表達(dá)在肛周膿腫的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮重要作用[3-4]。硒結(jié)合蛋白1(selenium-binding protein1,SBP1)可通過一種未知的機(jī)制與硒結(jié)合,介導(dǎo)疾病的炎性反應(yīng)狀態(tài)而影響患者病情進(jìn)展[5]。白介素-17(interleukin-17,IL-17)是一種促炎性細(xì)胞因子,主要誘導(dǎo)炎性因子的表達(dá)和誘發(fā)自身免疫病的炎性反應(yīng),在多種病原微生物所致的感染性疾病中起著重要作用[6]?，F(xiàn)分析肛周局部組織中SBP1、IL-17表達(dá)與肛周膿腫患者臨床病理特征的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響,旨在為肛周膿腫患者的治療及預(yù)后評(píng)估提供參考,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021月12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院日間病房手術(shù)治療肛周膿腫患者120例作為肛周膿腫組,其中男87例,女33例,年齡24～60(39.01±4.87)歲;病程2～18(8.26±2.15)月;克羅恩病形成的肛周膿腫33例,伴發(fā)糖尿病48例,結(jié)核性膿腫18例,肛周壞死性筋膜炎7例,其他14例。另選取同期收治的無(wú)感染混合痔患者120例作為對(duì)照組,其中男89例,女31例,年齡25～55(38.63±4.29)歲;病程6～20(8.58±2.37)月;因感染形成痔71例,因飲食因素形成痔23例,因疾病因素形成痔15例,其他11例。2組患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SJHS2019-11042),全部受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 肛周膿腫病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合“肛周膿腫臨床診治中國(guó)專家共識(shí)”[7]有關(guān)肛周膿腫的診斷標(biāo)準(zhǔn);②肛周部位出現(xiàn)紅腫包塊等;③術(shù)前評(píng)估無(wú)手術(shù)禁忌證,并行切開引流術(shù)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有嚴(yán)重全身性疾病者;②外傷所致肛周膿腫患者;③瘢痕體質(zhì)、過敏性體質(zhì)、凝血功能障礙患者;④肛門狹窄或功能障礙患者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 SBP1、IL-17 mRNA表達(dá)檢測(cè):留取2組患者病變組織標(biāo)本,將冷凍的病理石蠟組織標(biāo)本解凍,Trizol試劑一步法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR),反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性1 min、94℃變性1 min、56℃退火1 min、72℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參。每個(gè)樣品均重復(fù)檢測(cè)3次,取平均值,運(yùn)用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,引物序列信息見表1。

表1 SBP1、IL-17 mRNA引物序列

1.3.2 免疫組化法檢測(cè)SBP1、IL-17蛋白表達(dá):病變組織標(biāo)本以4%多聚甲醛固定24 h,脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋,切片厚度4 μm。切片脫蠟、水合后經(jīng)檸檬酸鈉抗原修復(fù),滴加特異性一抗,4℃孵育過夜,加入二抗孵育1 h,自來(lái)水沖洗,復(fù)染、脫水、透明、封固,于CX23BGUV熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察局部組織中蛋白表達(dá)情況。結(jié)果判定:以細(xì)胞(細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì))中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒,呈均勻染色為陽(yáng)性表達(dá);計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞百分比<1%為0分,1%～5%為1分,6%～25%為2分,26%～75%為3分,>75%為4分;染色強(qiáng)度無(wú)色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積≥2分為陽(yáng)性。

1.3.3 隨訪及預(yù)后評(píng)估:肛周膿腫患者出院后以電話或門診復(fù)診的方式隨訪6個(gè)月,隨訪截止日期為2022年6月。6個(gè)月內(nèi)患者肛周膿腫未復(fù)發(fā)或未形成肛瘺為預(yù)后良好,反之為預(yù)后不良。

2 結(jié) 果

2.1 2組肛周組織SBP1、IL-17表達(dá)比較 肛周膿腫組SBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均低于對(duì)照組(P<0.01),IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組(P<0.01),見表2。

2.2 不同預(yù)后肛周膿腫患者肛周局部組織中SBP1、IL-17表達(dá)比較 預(yù)后不良亞組患者肛周局部組織中SBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均低于預(yù)后良好亞組(P<0.05),而IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于預(yù)后良好亞組(P<0.05),見表3。

2.3 SBP1、IL-17表達(dá)在不同臨床/病理特征中的差異 肛周局部組織中SBP1、IL-17表達(dá)在不同性別、年齡、膿腫位置、感染類型、病程中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而在膿腫≥5 cm、術(shù)后愈合時(shí)間≥4周患者中SBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽(yáng)性率低于膿腫<5 cm、術(shù)后愈合時(shí)間<4周患者,IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽(yáng)性率高于膿腫<5 cm、術(shù)后愈合時(shí)間<4周患者(P<0.05),見表4。

表2 對(duì)照組與肛周膿腫組SBP1、IL-17表達(dá)比較

2.4 影響肛周膿腫患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 以患者預(yù)后為因變量(預(yù)后良好=0,預(yù)后不良=1),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目(膿腫大小、術(shù)后愈合時(shí)間及SBP1、IL-17表達(dá))為自變量,均為原值輸入,進(jìn)行Logistic多因素回歸分析。結(jié)果顯示,術(shù)后愈合時(shí)間≥4周、SBP1表達(dá)降低、IL-17表達(dá)升高是影響肛周膿腫患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表5。

2.5 SBP1、IL-17 mRNA對(duì)肛周膿腫患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制SBP1、IL-17 mRNA對(duì)肛周膿腫患者預(yù)后的ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,SBP1、IL-17 mRNA及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)肛周膿腫的AUC分別為0.888、0.890、0.933,二者聯(lián)合優(yōu)于各自單獨(dú)預(yù)測(cè)效能(Z=3.583,4.252,P均<0.001),見表6、圖1。

表3 預(yù)后良好亞組與預(yù)后不良亞組肛周膿腫患者SBP1、IL-17表達(dá)比較

表4 肛周局部組織中SBP1、IL-17表達(dá)在不同臨床/病理特征中的差異

表5 影響肛周膿腫患者預(yù)后的Logistic多因素回歸分析

表6 SBP1、IL-17 mRNA水平對(duì)肛周膿腫患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖1 SBP1、IL-17 mRNA表達(dá)對(duì)肛周膿腫患者預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

目前,學(xué)者認(rèn)為肛周膿腫是細(xì)菌感染引起的疾病,患者免疫力降低無(wú)法阻止炎性反應(yīng)擴(kuò)散也是其致病因素之一,故炎性反應(yīng)參與了肛周膿腫疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。切開引流是外科治療肛周膿腫的常用方案,可以充分引流膿腔內(nèi)分泌的滲血、滲液,緩解術(shù)后疼痛和紅腫,保護(hù)肛門括約肌功能,但也存在復(fù)發(fā)及預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)[9-11]。因此,積極尋找可靠的分子標(biāo)志物,明確其與臨床病理特征的相關(guān)性及預(yù)測(cè)術(shù)后轉(zhuǎn)歸的價(jià)值對(duì)指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

SBP1是構(gòu)成物種間高度保守的蛋白質(zhì),生理功能包括細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)降解、高爾基體內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和氧化還原調(diào)節(jié),其表達(dá)受到缺氧的強(qiáng)烈影響,反映了硒代謝和免疫細(xì)胞激活之間的新聯(lián)系。由于硒狀態(tài)受到炎性反應(yīng)和缺氧的影響,SBP1主要被認(rèn)為是一種參與硒代謝和氧化還原控制的細(xì)胞內(nèi)蛋白[12]。本研究結(jié)果顯示,肛周膿腫組中SBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽(yáng)性率低于對(duì)照組,與膿腫大小、術(shù)后愈合時(shí)間有顯著相關(guān)性,預(yù)后不良亞組患者肛周局部組織中SBP1蛋白陽(yáng)性率、mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于預(yù)后良好亞組。金黃色葡萄球菌是最常見的外源性致病菌,也是膿腫感染和肛瘺復(fù)發(fā)的根本條件[13],本研究推測(cè)SBP1可能是以硒元素依賴性的方式發(fā)揮抵御肛周膿腫細(xì)菌感染作用,降低預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn),其可能原因?yàn)?(1)硒可以促進(jìn)金黃色葡萄球菌感染的巨噬細(xì)胞自噬,緩解自噬流的阻斷,降低細(xì)菌的胞內(nèi)存活,從而參與調(diào)節(jié)和改善感染金黃色葡萄球菌[14];(2)硒可以抑制髓過氧化物酶活性,抑制炎性細(xì)胞因子基因表達(dá),保護(hù)組織免受過度炎性反應(yīng)造成的損傷[15];(3)硒可以通過抑制信號(hào)通路改善金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[16-17]。

不同的輔助T細(xì)胞亞群有助于調(diào)節(jié)對(duì)病原體的免疫反應(yīng)。IL-17由T輔助細(xì)胞17分泌,可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的分泌,且具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的作用,能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的成熟,在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,通過促細(xì)胞分裂原活化蛋白激酶、髓過氧化物酶活性、核因子κB信號(hào)通路激活中性粒細(xì)胞,調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫在細(xì)菌感染中發(fā)揮重要作用[18-20]。IL-17介導(dǎo)炎性反應(yīng)增加機(jī)體對(duì)革蘭陰性菌和真菌感染。細(xì)胞因子還通過維持局部黏膜屏障的完整性來(lái)保護(hù)身體免受病毒感染。IL-17與細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用后便具備募集中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的能力,從而引起局部炎性反應(yīng)[21]。在本研究中,預(yù)后不良亞組局部組織中IL-17蛋白陽(yáng)性率、mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于預(yù)后良好亞組,且IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽(yáng)性率與患者膿腫大小、術(shù)后愈合時(shí)間具有相關(guān)性,故推測(cè)IL-17表達(dá)上調(diào)可能通過加重炎性反應(yīng)途徑參與肛周膿腫的發(fā)生進(jìn)展過程,IL-17表達(dá)上升提示炎性反應(yīng)未完全控制,進(jìn)一步造成局部組織損害,病情遷延不愈,增加了預(yù)后不良的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究Logistic多因素回歸分析顯示,SBP1表達(dá)降低、IL-17表達(dá)升高、術(shù)后愈合時(shí)間≥4周是影響肛周膿腫患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,這進(jìn)一步說(shuō)明肛周局部組織SBP1、IL-17水平與肛周膿腫患者的預(yù)后不良關(guān)系密切。

本研究經(jīng)ROC曲線分析顯示,肛周膿腫局部組織SBP1、IL-17水平預(yù)測(cè)患者預(yù)后的 AUC分別為0.888和0.890(均大于0.8),說(shuō)明2項(xiàng)指標(biāo)對(duì)于預(yù)后的預(yù)測(cè)均有一定準(zhǔn)確性,二者單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)的敏感度分別為0.802、0.835、0.927,特異度分別為0.733、0.667、0.800,提示二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)肛周膿腫患者預(yù)后的價(jià)值高于任一單獨(dú)檢測(cè)。

綜上所述,肛周膿腫患者局部組織中SBP1、IL-17表達(dá)異常,且與肛周膿腫大小、愈合時(shí)間及患者預(yù)后相關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

羅蕾:實(shí)施研究過程,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文撰寫與修改;莊怡青:數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;唐英:實(shí)施研究過程,資料搜集與整理;黃鴻翔:提出研究思路,設(shè)計(jì)研究方案,論文審核