新生兒膿毒血癥血清miR-141、miR-181a水平及對病情嚴重程度的影響

劉延霞,麥菁蕓,林則彬,蒙晶

新生兒膿毒血癥是指細菌、真菌等微生物在新生兒血液中異常增殖并分泌毒素產(chǎn)生全身炎性反應的一種綜合征[1]。臨床多表現(xiàn)為感染性休克和多器官功能障礙,嚴重者會迅速死亡[2]。研究表明,新生兒膿毒血癥的病死率可高達50%[3]。因此,需要找到能預測膿毒血癥病情嚴重程度的指標,從而早期干預,防止病情惡化。研究表明,C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)和降鈣素原(procalcitonin,PCT)等炎性指標對膿毒血癥有較好的診斷價值,但對病情變化的預測不理想[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-141、miR-181a廣泛參與炎性反應,對胃炎、類風濕關節(jié)炎等疾病有較好的預測價值[5-6],但目前尚無二者與膿毒血癥嚴重程度有關的報道。現(xiàn)分析血清miR-141、miR-181a水平對新生兒膿毒血癥病情嚴重程度的影響,建立新的預測指標體系,及時判斷膿毒血癥病情變化,從而盡早優(yōu)化治療方案,防止病情惡化,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年6月—2022年8月海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院新生兒科收治膿毒血癥患兒50例為研究對象。根據(jù)患兒的序貫器官衰竭評分(sequential organ failure assessment, SOFA)分為輕癥組27例和重癥組23例。2組患兒在性別、胎齡、出生體質(zhì)量、發(fā)病日齡、感染部位比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(HL2021013),患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1) 診斷標準:參照“中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)”[7]制定:①白細胞水平異常(所有白細胞或中性粒細胞水平變化>10%);②直腸、膀胱、口腔或中心靜脈導管測量體溫異常(>38.5℃或<36℃);③心率>同年齡組2個標準差,持續(xù)加快超過30 min且無明確病因,或心率<同年齡組第10百分位,持續(xù)減慢超過30 min且無明確病因;④呼吸頻率>同年齡組2個標準差,或需要機械通氣。以上4項需包含2項以上,且必須包含①或②項。(2)納入標準:①符合新生兒膿毒血癥診斷;②發(fā)病48 h內(nèi);③之前未接受藥物或其他措施治療 。(3)排除標準:①合并先天性心臟病;②合并血液系統(tǒng)疾病;③合并先天性畸形;④合并新生兒黃疸;⑤合并肝腎功能不全;⑥臨床資料不完整。

表1 輕癥組、重癥組患兒臨床資料比較

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-141和miR-181a表達檢測: 抽取患兒空腹靜脈血3 ml,離心留取上層血清。采用miRNA提取分離試劑盒[凱杰生物工程(深圳)有限公司]提取血清miRNA,采用miRNA的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)miRNA熒光定量檢測試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系,將配置好的體系放入Aplied Biosystems的實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應程序為:95℃加熱1 min,95℃變性30 s、58℃退火40 s、72℃延伸30 s,最后72℃加熱5 min充分反應,共進行40個循環(huán)。miR-141和miR-181a的引物由上海生物工程公司合成,miR-141上游引物:5’-GTACCCTCTAGAAGTCGCGCCA-3’,下游引物:5’-AGTCACTACTGAAGATCTG-3’; miR-181a上游引物:5’-CTCGGCTCTGGCAGTCTATCT-3’,下游引物:5’-TCGTTCTCGACCTGCCGGAT-3’;內(nèi)參采用U6基因,上游引物:5’-GACTGATGCTCTGGCCGA-3’,下游引物:5’-GTCGGGTCGAAGCATGG-3’。采用2-△△Ct法計算miR-141和miR-181a的表達量。

1.3.2 血清CRP和PCT水平檢測:上述血清采用酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測(北京普利萊基因技術有限公司)。準備酶標板,每孔分別滴加血清和標準品25 μl,37℃孵育15 min,再滴加酶底物100 μl,反應20 min,加入顯色液,避光15 min,最后滴加終止液。將酶標板放入酶標儀(山東云唐科技有限公司,型號:YT-MB96A)中,于450 nm波長處檢測溶液吸光度,計算CRP、PCT水平。

1.3.3 急性生理與慢性健康評分:急性生理與慢性健康評分(acute physiology and chronic health evaluation-Ⅱ,APACHE-Ⅱ)測量包含3部分:(1)生理狀態(tài)評分:體溫、脈搏、呼吸、血壓、血細胞分析、肝腎功能、血氣分析、格拉斯哥評分等12個項目;(2)年齡評分:為0～6分;(3)慢性病狀態(tài)評分:擇期手術2分,其余情況5分。將以上三項分數(shù)相加,即為總評分。分數(shù)越高,患者預后越差,死亡風險越大。

2 結 果

2.1 2組血清miR-141、miR-181a、 CRP、PCT水平比較 重癥組血清miR-141和miR-181a水平低于輕癥組, CRP、PCT水平高于輕癥組,差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01),見表2。

表2 輕癥組與重癥組患者血清miR-141、miR-181a、 CRP、PCT水平比較

2.2 2組APACHE-Ⅱ評分比較 重癥組APACHE-Ⅱ評分為(32.58±6.47)分,高于輕癥組的(21.72±4.35)分(t/P=7.054/<0.001)。

2.3 血清miR-141、miR-181a與APACHE-Ⅱ評分、CRP、PCT的相關性 膿毒血癥患兒血清miR-141、miR-181a均與APACHE-Ⅱ評分、CRP、PCT呈明顯負相關(P均<0.01),見表3。

表3 膿毒血癥患兒血清miR-141、miR-181a與APACHE-Ⅱ評分、CRP、PCT的相關性

2.4 膿毒血癥患兒病情加重的多因素Logistic回歸分析 以新生兒膿毒血癥病情嚴重程度為因變量,以上述結果中P<0.05項目為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,血清miR-141高和miR-181a高為膿毒血癥患兒病情加重的保護因素(P均<0.01),APACHE-Ⅱ評分高、CRP高和PCT高為病情加重的危險因素(P均<0.01),見表4。

表4 膿毒血癥患兒病情加重的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清miR-141、miR-181a對膿毒血癥患兒病情變化的ROC曲線分析 繪制血清miR-141、miR-181a水平預測新生兒膿毒血癥病情嚴重程度的效能ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示,血清miR-141、miR-181a及二者聯(lián)合預測新生兒膿毒血癥病情嚴重程度的AUC分別為0.936、0.856、0.959 ,二者聯(lián)合檢測優(yōu)于各自單獨預測效能(Z=5.318、9.652,P<0.001),見表5、圖1。

3 討 論

膿毒血癥是新生兒常見的死亡原因,發(fā)病率逐年增長[8]。肺部、胃腸道等是膿毒血癥最常發(fā)生的部位,臨床表現(xiàn)為重癥肺炎、急性肺損傷、腸道功能紊亂,甚至多器官功能障礙,導致死亡[9]。發(fā)病機制包括感染引起的血管內(nèi)皮受損、炎性因子升高、代謝功能異常等,其中炎性因子與感染后病情加重存在密切關聯(lián)[10]。機體產(chǎn)生的內(nèi)毒素會誘導caspase活化,增強鞘氨醇-磷酸2受體信號,導致其對炎性小體敏感性增加,激活細胞凋亡途徑,從而導致臨近組織細胞發(fā)生炎性反應,產(chǎn)生細胞損傷,導致膿毒癥發(fā)生,當炎性反應長時間持續(xù)時,會嚴重抑制免疫功能,引起膿毒癥休克,甚至死亡[11]。因此,尋找到能準確預測膿毒血癥預后的指標很關鍵。

表5 血清miR-141、miR-181a預測膿毒血癥患兒病情變化的價值比較

圖1 血清miR-141、miR-181a及二者聯(lián)合預測膿毒血癥患兒病情程度的ROC曲線

CRP是產(chǎn)自肝細胞中的一種急性期蛋白,與非特異性免疫有關,其水平能指示炎性反應程度,然而其在早期升高不明顯,通常在嚴重感染后18 h才顯著上升,在炎性反應消退后1～3 d才恢復至正常水平,因此其對于預測炎性疾病的預后價值有限[12]。PCT在正常人體內(nèi)水平較低,當出現(xiàn)膿毒血癥時,血清水平迅速增加,在感染早期即可有明顯上升,然而其峰值持續(xù)時間過長,不能及時隨機體感染好轉(zhuǎn)而下降,因此對于疾病的預后預測價值不理想[13]。APACHE-Ⅱ評分廣泛應用于膿毒血癥等嚴重感染性疾病的評估,但是其主觀性較強,存在評價者個體差異問題,因此預后價值不高[14]。近年來發(fā)現(xiàn),許多miRNA均參與炎性反應,其表達水平與感染的嚴重程度和預后有關,其中miR-141和miR-181a在肺炎、類風濕關節(jié)炎等炎性疾病的嚴重程度預測方面都有很好的價值,但是對新生兒膿毒血癥病情變化的影響尚無報道[15-16]。因此,本研究分析了新生兒膿毒血癥血清miR-141和miR-181a表達水平,比較了二者與以往研究指標APACHE-Ⅱ評分、CRP和PCT的作用大小,從而有力證明了血清miR-141和miR-181a對病情變化的預測價值。

miR-141是miR-200家族(miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c及miR-429)成員之一,是一個成熟的序列,全長共22 個核苷酸[17]。miR-141可以通過結合不同靶點經(jīng)多條通路調(diào)節(jié)一系列的生理過程,可在細胞生長和凋亡、新陳代謝、炎性反應、血管新生等多個生物學過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[18]。本研究結果提示,miR-141對于新生兒膿毒血癥具有很好的預后預測價值。李靜等[19]發(fā)現(xiàn),miR-141水平升高,能抑制脂多糖誘導的肺上皮細胞中IL-6和IL-1β的表達,從而減輕上皮細胞損傷。臧雪風等[20]測量了167例高血壓性腦出血患者血清miR-141水平,發(fā)現(xiàn)其與TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈負相關,miR-141是高血壓腦出血的預后保護因素,這與本研究結果一致。陳勝樂等[21]研究表明,miR-141抑制炎性反應的機制可能是通過抑制NF-κB信號通路,阻斷IκB激酶α、磷酸化IκB激酶α等因子的信號轉(zhuǎn)導,從而降低IL-1、IL-10、TNF-α等炎性因子水平,從而促進炎性細胞凋亡,緩解炎性反應。然而,也有少數(shù)研究認為miR-141與炎性反應可能存在相互促進的關系,陳筱濤等[22]采集108例尿毒癥患者外周血,發(fā)現(xiàn)miR-141高表達與微炎性狀態(tài)有關,與本研究結果存在爭議,原因可能是由于尿毒癥患者存在嚴重腎功能損害,引起血清miR-141異常升高所致。

miR-181a作為一種重要的miRNA,其包含2條前體序列:其中1條前體序列位于1號染色體反義鏈,另1條位于9號染色體正義鏈,2條序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄后再進一步加工為成熟序列,長度為23 nt,參與調(diào)控靶基因表達[23]。作為miR-181家族成員,miR-181a種子區(qū)域高度保守,其不僅參與細胞的分化發(fā)育,還在介導腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及炎性反應等方面發(fā)揮重要作用[24]。本研究結果提示,miR-181a對于新生兒膿毒血癥具有較好的預后價值。楊曉娜等[25]發(fā)現(xiàn),慢性阻塞性肺疾病患者血清miR-181a低于健康對照組,miR-181a水平與IL-1β、hs-CRP等炎性因子呈負相關。李強等[26]檢測了50例冠心病患者和50例健康人的miR-181a水平,發(fā)現(xiàn)miR-181a在冠心病患者中低表達,以上研究與本研究結果一致。陶鳳姣等[27]研究表明,miR-181a可能是通過抑制TLR4/MyD88信號通路,減輕嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤,從而減輕炎性反應。但是也有少數(shù)研究結果存在爭議,古裕鳥等[28]發(fā)現(xiàn)新生兒呼吸窘迫綜合征血清miR-181a升高與病情嚴重程度呈正相關,這與本研究結果不一致,原因可能是該研究各組間樣本量不均衡(非危重組53例、危重組24例、極危重組15例),可能會導致組間測量結果不穩(wěn)定,同時單組樣本量過少(極危重組15例)會降低統(tǒng)計效能。

本研究的優(yōu)點在于通過相關分析表明了miR-141、miR-181a與多種炎性因子的相關性強度,采用多因素Logistic回歸分析得出miR-141、miR-181a對病情嚴重程度的預測作用大小,通過ROC曲線得出了miR-141、miR-181a的預測準確率,通過多個定量結果證明了二者對病情的預測價值。本研究不足之處在于僅研究了患兒病情輕重這一個因素,在以后的研究中,可以考慮對患兒進行長期隨訪,采用生存分析研究miR-141、miR-181a的遠期預后價值。

綜上所述,血清miR-141和miR-181a在新生兒膿毒血癥中低表達,與APACHE-Ⅱ評分、CRP和PCT呈負相關,其水平升高是膿毒血癥患兒病情嚴重程度的保護因素,對新生兒膿毒血癥病情變化有很好的預測價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉延霞:設計研究方案,論文撰寫;麥菁蕓:分析試驗數(shù)據(jù),論文修改;林則彬:實施研究過程,資料搜集整理;蒙晶:提出研究思路,論文審核