奇楠沉香葉的有效成分含量測定及其生物活性評價(jià)

林思琦， 招志輝， 司徒杰

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

沉香為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含有樹脂的木材，擅長“行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘”，中醫(yī)臨床常用于“胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急”諸證[1]；現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳平喘、抗菌、抗腫瘤和改善心肌缺血等作用[2]。由于沉香成藥時(shí)間長、產(chǎn)量低，兼具收藏價(jià)值，因此市場價(jià)格一直居高不下[3]。資源的稀缺，市場的需求，使得沉香樹其他部位（如葉子），在近幾年來逐漸成為研發(fā)熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，沉香葉中含有多糖、鞣質(zhì)、黃酮、氨基酸、揮發(fā)油等多種成分[4]，具有抗氧化、降血糖、降血脂、平喘、抑菌等生物活性[5]。在2018年，國家衛(wèi)計(jì)委將白木香葉列入終止審查新食品原料目錄，以地方特色食品進(jìn)行管理[6]；同年，廣東省衛(wèi)健委制定并實(shí)施了《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)白木香葉》（DBS44/011-2018）[7]，極大地推動了白木香葉產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展?，F(xiàn)已開發(fā)出沉香葉茶飲品等產(chǎn)品[8-9]。

奇楠沉香，是經(jīng)過野生分化變異和自然條件選育出的多個(gè)沉香品種中品質(zhì)最高的一種，其油脂豐富、芳香優(yōu)雅、回味悠長，關(guān)鍵指標(biāo)色酮類成分含量高，同時(shí)具備“生長快、結(jié)香久、抗病害強(qiáng)”的種植優(yōu)勢，正被大力推廣種植[10-11]。目前，關(guān)于奇楠沉香葉的研究甚少。本研究選取奇楠沉香葉為研究對象，采用不同提取方法，對其總黃酮、總多糖、鞣質(zhì)含量測定以及體外抗氧化、抗菌、抗炎活性評價(jià)展開系統(tǒng)研究，以期為奇楠沉香葉產(chǎn)品的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器SQP分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；GZX-9076 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；OSB-2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；UV-1700 型紫外-可見光光度計(jì)（日本島津公司）；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；DW 調(diào)溫電熱器（上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化科技設(shè)備有限公司）；LX-B50L 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華素醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.2 樣品與試劑奇楠沉香葉于2020 年11 月采摘于廣東省陽江市陽西縣阿拉丁沉香種植基地，由廣東藥科大學(xué)李鐘副教授鑒定基源為白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg]，且符合奇楠沉香植物特征。

沒食子酸（批號：110831-200803，含量99%），中國藥品生物制品檢定所； 蘆?。ㄅ枺篖D200119-08，含量99%），Stanford Analytical Chemicals Co.， Ltd.； D- 無 水 葡 萄 糖（批 號：20180111），中國食品藥品檢定研究院；抗壞血酸（VC，批號：20180110），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·），上海麥克林生物有限公司；2，2’-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS+·），上海麥克林生物有限公司；其他試劑均為分析純，水為純水。

1.3 培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：1094671）、Mueller-Hinton 瓊脂培養(yǎng)基（批號：1095901），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 菌種金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、表皮葡萄球菌（ATCC 1228）、銅綠假單胞菌（ATCC 49103）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、變形桿菌（ATCC 49103）、沙門氏菌（ATCC 14028）、福氏痢疾桿菌（ATCC 43300）、大腸桿菌（ATCC 8739），均由廣東省微生物研究所提供。

1.5 動物SPF 級昆明種小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002。實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件：室溫20 ～25 ℃，日溫差≤3 ℃，濕度40%～70%。

2 方法與結(jié)果

2.1 奇楠沉香葉提取物制備

（1）水提法：取200 g奇楠沉香葉粗粉，第1次加入12 倍純水，浸泡0.5 h，加熱回流提取2 h，200目篩網(wǎng)過濾；藥渣繼續(xù)加入12倍純水加熱回流提取2 h，200 目篩網(wǎng)過濾；合并濾液，75 ℃減壓濃縮至質(zhì)量濃度為1.0 g（藥材）/mL的水提物溶液。

（2）醇提法：取200 g奇楠沉香葉粗粉，以70%乙醇溶液為溶劑，其余條件參數(shù)按照“水提法”制備方法進(jìn)行提取，最終制備成質(zhì)量濃度為1.0 g（藥材）/mL的70%醇提物溶液。

2.2 總黃酮含量測定[12]

2.2.1 溶液的制備

（1）對照品溶液：取蘆丁對照品約7.5 mg，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，加入適量60%乙醇，超聲溶解后繼續(xù)加入60%乙醇定容成0.30 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

（2）供試品溶液：分別吸取1.0 g/mL 的奇楠沉香葉水提物、70%醇提物0.5 mL，精密稱定，置于100 mL 容量瓶中，分別加入適量60%乙醇超聲溶解，再定容成5.0 mg/mL 的水提物供試品溶液、70%醇提物供試品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 蘆丁對照品溶液于試管中，分別補(bǔ)足純水至5.0 mL；再加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，室溫靜置6 min；繼續(xù)加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，室溫靜置6 min；最后加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，室溫靜置15 min。應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)于510 nm波長處測定吸光度（OD）值。以純水為空白對照。以O(shè)D 為縱坐標(biāo)（y），蘆丁對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=11.993 2x-0.460 8（R2=0.9960）。結(jié)果表明，蘆丁對照品在0.06 ～0.12 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 .3 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取6 份蘆丁對照品溶液2.5 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法測定OD（510 nm）值，計(jì)算出平均吸光度（AOD）值為0.461、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.57%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取水提物供試品溶液3.0 mL，同法進(jìn)行反應(yīng)0、30、60、90、120 min后測定OD（510 nm）值，平行3 份，計(jì)算出AOD 值為0.448、RSD為0.74%，表明該樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取水提物供試品溶液3.0 mL，同法反應(yīng)后測定OD（510 nm 值），平行3 份，計(jì)算出AOD 值為0.445、RSD 為1.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 吸取已知含量的水提物供試品溶液1.5 mL，加入蘆丁對照品溶液1.25 mL，同法反應(yīng)后測定OD（510 nm）值，平行3 份，計(jì)算出平均回收率為108.89%，表明該測定方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.7 樣品含量測定 吸取“2.2.1”項(xiàng)下水提物供試品溶液、70%醇提物供試品溶液各3.0 mL，同法反應(yīng)測定OD（510 nm）值，平行3 份，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出奇楠沉香葉中總黃酮含量分別為（5.04±0.011）%（水提法）、（3.78±0.020）%（醇提法）。

2.3 總多糖含量測定[13]

2.3.1 溶液的制備

（1）對照品溶液：取D-無水葡萄糖對照品約10.0 mg，精密稱定，置于100 mL 容量瓶中，加入適量純水溶解，同時(shí)定容成0.10 mg/mL 的D-無水葡萄糖對照品溶液。

（2）供試品溶液：分別吸取1.0 g/mL 的奇楠沉香葉水提物、70%醇提物溶液0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入適量純水溶解，同時(shí)定容成1.0 mg/mL的水提物供試品溶液、70%醇提物供試品溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的D-無水葡萄糖對照品溶液于試管中。分別加入純水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后加入濃硫酸溶液5.0 mL，90 ℃水浴20 min，取出冰浴冷卻至室溫，應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)于490 nm波長處測定OD值。以純水為空白對照。以O(shè)D 為縱坐標(biāo)（y），D-無水葡萄糖對照品濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.067 7x+0.079 5（R2=0.995 2）。結(jié)果表明，D-無水葡萄糖在1.43 ～14.31 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取6 份D-無水葡萄糖對照品溶液0.6 mL，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法測定OD（490 nm）值，計(jì)算出AOD 值為0.685、RSD 為0.76%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取水提物供試品溶液0.5 mL，同法進(jìn)行反應(yīng)0、30、60、90、120 min后測定OD（490 nm）值，平行3 份，計(jì)算出AOD 值為0.419、RSD為1.29%，表明該樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取水提物供試品溶液0.5 mL，同法反應(yīng)后測定OD（490 nm）值，平行3 份，計(jì)算出AOD 值為0.407、RSD 為1.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 吸取已知含量的水提物供試品溶液0.25 mL，加入D-無水葡萄糖對照品溶液0.17 mL，同法反應(yīng)后測定OD（490 nm）值，平行3 份，計(jì)算出平均回收率為106.88%，表明該測定方法準(zhǔn)確可靠。

2.3.7 樣品含量測定 吸取“2.3.1”項(xiàng)下水提物供試品溶液、70%醇提物供試品溶液各0.5 mL，同法反應(yīng)測定OD（490 nm）值，平行3 份，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出奇楠沉香葉中總多糖含量分別為（6.86±0.11）%（水提法）、（3.09±0.27）%（醇提法）。

2.4 鞣質(zhì)含量測定[14]

2.4.1 溶液的制備

（1）對照品溶液：取沒食子酸對照品約5.0 mg，精密稱定，置于100 mL 容量瓶中，加入適量純水，超聲溶解后繼續(xù)加入純水定容成0.050 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。

（2）供試品溶液：分別吸取1.0 g/mL 的奇楠沉香葉水提物、70%醇提物溶液0.5 mL，精密稱定，置于100 mL 容量瓶中。分別加入適量純水、70%乙醇，超聲溶解，再定容成5.0 mg/mL 的水提物供試品溶液、70%醇提物供試品溶液。

2.4.2 總酚含量測定

2.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 沒食子酸對照品溶液于試管中。分別加入純水至4.8 mL，再加入0.4 mL 磷鉬鎢酸溶液，混勻后加入10%碳酸鈉溶液稀釋至10.0 mL，避光靜置30 min。應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)于760 nm波長處測定OD值。以純水為空白對照。以O(shè)D為縱坐標(biāo)（y），沒食子酸對照品濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.093 8x+0.043 8（R2=0.994 8）。結(jié)果表明，沒食子酸在0.99 ～9.90 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2.2 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取6 份沒食子酸對照品溶液0.8 mL，按照“2.4.2”項(xiàng)下方法測定OD（760 nm）值，計(jì) 算 出AOD 值 為0.366、RSD 為0.93%，表明儀器精密度良好。

2.4.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取水提物供試品溶液0.2 mL，同法進(jìn)行反應(yīng)0、30、60、90、120 min后測定OD（760 nm）值，平行測定3份，計(jì)算出AOD值為0.452、RSD為1.02%，表明該樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取水提物供試品溶液0.2 mL，同法反應(yīng)后測定OD（760 nm）值，平行3 份，計(jì)算出AOD 值為0.440、RSD 為0.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 吸取已知含量的水提物供試品溶液0.1 mL，加入沒食子酸對照品溶液0.4 mL，同法反應(yīng)后測定OD（760 nm）值，平行3 份，計(jì)算出平均回收率為96.46%，表明該測定方法準(zhǔn)確可靠。

2.4.2.6 樣品含量測定 吸取“2.4.1”項(xiàng)下水提物供試品溶液、70%醇提物供試品溶液各0.2 mL，同法反應(yīng)測定OD（760 nm）值，平行3 份，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總酚含量。

2.4.3 不被吸附多酚含量測定 分別吸取“2.4.1”項(xiàng)下水提物供試品溶液、70%醇提物供試品溶液10.0 mL 及20.0 mL 純水，加至已加入0.6 g 干酪素的100 mL 具塞錐形瓶中，置于30 ℃水浴中保溫1.0 h，時(shí)時(shí)振搖。取出過濾，先棄去初濾液，再吸取1.0 mL續(xù)濾液于10 mL試管中。按照“2.4.2.1”項(xiàng)下方法，加入3.8 mL 純水及0.4 mL 磷鉬鎢酸溶液，再用10%的碳酸鈉溶液稀釋到10.0 mL，避光靜置30 min。測定OD（760 nm）值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不被吸附多酚含量。

2.4.4 樣品鞣質(zhì)含量測定 根據(jù)以下公式計(jì)算：鞣質(zhì)含量=（m總酚-m多酚）/m沉香葉×100%。奇楠沉香葉中鞣質(zhì)含量分別為（2.16 ± 0.012）%（水提法）、（1.81±0.012）%（醇提法）。

2.5 抗氧化活性評價(jià)參考文獻(xiàn)方法[15-16]進(jìn)行操作并做適當(dāng)改變。

2.5.1 DPPH·清除率測定 分別準(zhǔn)確吸取：①0.1 mg/mL 的VC 溶 液：0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL；②2.50 mg/mL 的水提物溶液：0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL；③2.49 mg/mL 的70%醇提物溶液：0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL。各加入95%乙醇溶液至2.0 mL，再加入6.5×10-5mol/L 的DPPH·溶液2.0 mL，室溫避光反應(yīng)30 min，以95%乙醇溶液調(diào)零，應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)于517 nm波長處測定OD 值（ODi）。同法測定95%乙醇2.0 mL與水提物/70%醇提物供試品溶液2.0 mL 混合后的OD 值（ODj），以及DPPH·溶液2.0 mL 與95%乙醇2.0 mL 混合后的OD 值（OD0）。計(jì)算公式如下：DPPH·清除率（%）=[1-（ODi-ODj）]/OD0×100%。

實(shí)驗(yàn)測得VC，奇楠沉香葉水提物、70%醇提物對DPPH·的IC50分別為0.019、0.31、0.37 mg/mL，圖1、圖2 可見清除率均隨著藥物濃度的增加而提高。相比之下，奇楠沉香葉水提物、70%醇提物的IC50之間無顯著性差異，但均明顯高于VC，表明奇楠沉香葉水提物、70%醇提物對DPPH·的清除能力均弱于VC，且水提法略優(yōu)于醇提法。

圖1 不同濃度抗壞血酸（VC）對DPPH·清除率的影響Figure 1 Effect of different concentrations of VC on DPPH·clearance rate

圖2 不同濃度奇楠沉香葉提取物對DPPH·清除率的影響Figure 2 Effect of different concentrations of extract of Aquilaria sinensis leaves on DPPH·clearance rate

2.5.2 ABTS+·自由基清除作用測定 分別準(zhǔn)確吸?。孩?.1 mg/mL 的VC 溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL；②2.50 mg/mL 的水提物溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL；③2.49 mg/mL 的70%醇提物溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL。各加入純水至1.0 mL，再加入ABTS+·溶液3.9 mL，室溫反應(yīng)6 min，應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)于734 nm 波長處測定ODE。同時(shí)吸取ABTS+·溶液3.9 mL，加入70%的乙醇溶液0.1 mL 測定ODB。計(jì)算公式如下：ABTS+·清除率（%）=（ODB-ODE）/ODB×100%。

實(shí)驗(yàn)測得VC，奇楠沉香葉水提物、70%醇提物對ABTS+·的IC50分別為0.004、0.12、0.16 mg/mL，圖3、圖4 可見清除率均表現(xiàn)出隨著藥物濃度的增加而提高。相比之下，奇楠沉香葉水提物、70%醇提物的IC50之間無顯著性差異，但均明顯高于VC，表明奇楠沉香葉水提物、70%醇提物對ABTS+·的清除能力弱于VC，且水提法略優(yōu)于醇提法。

圖3 不同濃度抗壞血酸（VC）對ABTS+·清除率的影響Figure 3 Effect of different concentrations of VC on ABTS+·clearance rate

圖4 不同濃度奇楠沉香葉提取物對ABTS+·清除率的影響Figure 4 Effect of different concentrations of Aquilaria sinensis leaves extract on ABTS+·clearance rate

2.5.3 ·OH 清除率測定 分別準(zhǔn)確吸?。孩?.1 mg/mL 的VC 溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL；②1.67 mg/mL 的水提物溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mL；③1.67 mg/mL 的70%醇提物供試品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL。各加入純水至1.0 mL，再分別加入1 mL 的6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液和6 mmol/L 過氧化氫溶液，室溫反應(yīng)5 min。繼續(xù)加入1 mL 的6 mmol/L 水楊酸溶液，室溫反應(yīng)30 min，應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)于510 nm波長處測定OD 值（ODi）。以純水代替水楊酸溶液同法測定OD值（ODj）。以純水代替樣品溶液為空白對照同法測定OD 值（OD0）。計(jì)算公式如下：·OH 清除率（%）=[OD0-（ODi-ODj）]/OD0×100%。

實(shí)驗(yàn)測得VC，奇楠沉香葉水提物、70%醇提 物 對ABTS+·的IC50分 別 為0.007 8、0.069、0.074 mg/mL，圖5、圖6 可見清除率均表現(xiàn)出隨著藥物濃度的增加而提高。相比之下，奇楠沉香葉水提物、70%醇提物的IC50之間無顯著性差異，但均明顯高于VC，表明奇楠沉香葉水提物、70%醇提物對·OH 的清除能力弱于VC，且水提法優(yōu)于醇提法。

圖5 不同濃度抗壞血酸（VC）對·OH清除率的影響Figure 5 Effect of different concentrations of VC on·OH clearance rate

圖6 不同濃度奇楠沉香葉提取物對·OH清除率的影響Figure 6 Effect of different concentrations of Aquilaria sinensis leaves extract on ·OH clearance rate

圖7 不同濃度抗壞血酸（VC）對清除率的影響Figure 7 Effect of different concentrations of VC onclearance rate

圖8 不同濃度奇楠沉香葉提取物對清除率的影響Figure 8 Effect of different concentrations of Aquilariasinensis leaves extract on clearance rate

2.5.5 總還原力測定 分別準(zhǔn)確吸?。孩?.1 mg/mL的VC溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL；②5.0 mg/mL的水提物溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL；③5.0mg/mL的70%醇提物溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL。加入純水至0.5 mL，再加入0.2 mmol 的pH6.6 磷酸鹽緩沖液2.5 mL 和1%鐵氫化鉀溶液2.5 mL，50 ℃反應(yīng)20 min，冰水降溫；繼續(xù)加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻后以3 000 r/min 離心10 min；取上清液2.5 mL，加入純水2.5 mL 和0.1%氯化鐵溶液1.0 mL。應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)于700 nm 波長處測定OD值。

在同樣的質(zhì)量濃度下，OD 值越大，即對Fe3+的還原能力越強(qiáng)，表明抗氧化能力越好。由圖9、圖10 可知，在同一濃度下，奇楠沉香葉的水提物OD 值比70%醇提物稍大，但均小于VC 的OD 值，表明奇楠沉香葉水提物、70%醇提物對Fe3+的總還原力均弱于VC，且水提法略優(yōu)于醇提法。

圖9 不同濃度抗壞血酸（VC）對Fe3+還原力的影響Figure 9 Effect of different concentrations of VC on the reducing power of Fe3+

圖10 不同濃度奇楠沉香葉提取物對Fe3+還原力的影響Figure 10 Effect of different concentrations of Aquilaria sinensis leaves extract on the reducing power of Fe3+

2.6 抗菌活性評價(jià)

2.6.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌等受試菌種于MH 瓊脂板上劃線復(fù)蘇培養(yǎng)24 h，挑選生長良好的單菌落于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h，采用麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行校正，并稀釋成濃度為1×106CFU/mL 的菌懸液。

2.6.2 MIC測定

采用微量二倍稀釋法[17]。于96 培養(yǎng)孔板每排第1 ～12 孔各加入100 μL 的1 × 106CFU/mL 菌懸液，再按濃度由高至低依次往每排第1 ～11孔各加入100 μL 的系列濃度（1 000.0 ～0.98 mg/mL）水提物溶液、70%醇提物溶液，第12 孔只加入純水作為空白對照。將96 孔培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)20 h，吸取10 μL 混合培養(yǎng)液涂板后37 ℃培養(yǎng)20 h，以菌落數(shù)少于5個(gè)者為MIC。

由表1結(jié)果可知，奇楠沉香葉水提物對不同致病菌的抑制作用由強(qiáng)至弱依次是：銅綠假單胞菌=變形桿菌（15.63 mg/mL）＞沙門氏菌＞表皮葡萄球菌＞金黃色葡萄球菌＞福氏痢疾桿菌＞肺炎克雷伯菌=大腸桿菌（＞500.0 mg/mL）；70%醇提物則是：銅綠假單胞菌=變形桿菌（31.25 mg/mL）＞沙門氏菌＞表皮葡萄球菌=金黃色葡萄球＞福氏痢疾桿菌＞肺炎克雷伯菌=大腸桿菌（＞500.0 mg/mL）。表明奇楠沉香葉水提物、70%醇提物均對銅綠假單胞菌、變形桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，同時(shí)水提法優(yōu)于醇提法。

表1 奇楠沉香葉提取物對不同致病菌的MICTable 1 MICs of Aquilaria sinensis leaves extract against different pathogenic bacteria

2.7 抗炎活性評價(jià)[18]

將小鼠隨機(jī)分組：空白對照組，奇楠沉香葉水提物高、中、低劑量組（生藥3.33、1.67、0.83 g·kg-1），奇楠沉香葉70%醇提物高、中、低劑 量 組（生 藥3.33、1.67、0.83 g·kg-1），每 組10 只，雌雄各半?？瞻讓φ战M按20 mL·kg-1給予生理鹽水灌胃，水提物組、70%醇提物組分別給予不同劑量藥物灌胃，1 次/d，連續(xù)7 d。于實(shí)驗(yàn)第7 天灌胃給藥1 h 后，吸取50 μL 的二甲苯溶液均勻涂抹小鼠右耳正反兩面，致炎20 min 后處死，剪下右耳，用打孔器打出直徑為6 mm 的圓耳片，稱質(zhì)量（m），以左耳為空白對照。計(jì)算公式如下：耳廓腫脹度=m右-m左。

由圖11 可知：與空白對照組相比，奇楠沉香葉水提物高、中劑量組及70%醇提物高、中劑量組小鼠耳廓腫脹度降低均具有非常顯著性差異（P＜0.01），水提物低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），而70%醇提物低劑量組則無顯著性差異（P＞0.05）；同一劑量水平，水提物組與70%醇提物組相比未見顯著性差異（P＞0.05）。表明水提法與醇提法的抗炎效果相同或近似。

圖11 不同劑量奇楠沉香葉提取物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響Figure 11 Effect of different doses of Aquilaria sinensis leaves extract on xylene-induced auricular swelling in mice

3 討論

本研究測得奇楠沉香葉中總黃酮、總多糖、鞣質(zhì)含量分別為：①水提法：5.04%、6.86%、2.16%；②醇提法：3.78%、3.09%、1.81%。結(jié)果表明，奇楠沉香葉中含量最高的是總多糖，其次是總黃酮，最低是鞣質(zhì)。兩法相比，水提法所得有效成分含量均高于醇提法，分別是其1.33、2.22、1.19 倍，以多糖的差異量最大?？紤]以水為溶劑的提取物中由不同分子量組成的水溶性多糖較多，且大分子量多糖更多，而以70%乙醇為溶劑提取得到的多糖，分子量則較為集中，致醇提法多糖含量低于水提法。

測得奇楠沉香葉對DPPH·、ABTS+·、·OH、的IC50分別為：①水提法：0.31、0.12、0.069、0.71 mg/mL； ②醇 提 法： 0.37、 0.16、 0.074、1.17 mg/mL。結(jié)果表明，沉香葉對·OH 的清除作用最強(qiáng)，其次是ABTS+·、DPPH·，最弱是。兩法相比，水提法所得物質(zhì)的IC50均低于醇提法，分別是其0.84、0.75、0.93、0.61 倍，對清除能力的差異性最大。其原因可能與其黃酮、多糖、鞣質(zhì)含量較高有關(guān)[19-20，14]。

測得奇楠沉香葉對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、沙門氏菌、福氏痢疾桿菌、大腸桿菌的MIC范圍分別為：①水提法：15.63～＞500.0 mg/mL；②醇提法：31.25～＞500.0 mg/mL。結(jié)果表明，奇楠沉香葉對革蘭氏陰性菌的作用明顯強(qiáng)于革蘭氏陽性菌，特別是對銅綠假單胞菌、變形桿菌的作用最強(qiáng)。兩法相比，水提法所得物質(zhì)的MIC 均低于或等于醇提法，分別是其1.0、0.5、1.0、0.5、0.5、0.5、1.0、1.0 倍，其原因可能與其黃酮、鞣質(zhì)含量較高有關(guān)[21-22]。

測得奇楠沉香葉高、中、低劑量組小鼠耳廓腫脹度分別為：①水提法：13.0、15.2、16.3 mg；②醇提法：13.6、15.5、16.8 mg。結(jié)果表明，奇楠沉香葉對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹具有顯著性抑制作用，尤其是高、中劑量。兩法相比，水提法略優(yōu)于醇提法，主要表現(xiàn)為水提法的低劑量組與空白對照組相比，耳廓腫脹度具有顯著性差異，而醇提法的低劑量組則無顯著性差異，但水提法與醇提法的相同劑量組間比較卻無明顯差異性。其原因可能是提取物在進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，機(jī)體對有效成分的吸收、代謝有限，略微的含量差異，無法在活性表達(dá)上顯現(xiàn)出不同。

綜上所述，奇楠沉香葉中含有較多的總黃酮、總多糖和鞣質(zhì)成分，同時(shí)具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌、抗炎活性，且成分含量與生物活性基本呈現(xiàn)正相關(guān)性。相比醇提法，水提法制備的奇楠沉香葉提取物具有更多的有效成分和更強(qiáng)的生物活性。