基于Nrf2/HO-1信號通路研究白藜蘆醇在小鼠卵巢冷凍復(fù)蘇中的保護(hù)作用及機(jī)制

張珦， 李惠， 章宜芬， 鄭燕影， 孫怡， 陳劼， 儲樂樂， 應(yīng)葳， 李長印， 鄭艷莉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，江蘇南京 210000）

腫瘤放化療作為癌癥的主要治療手段，對女性卵巢功能的損害主要是會引起卵泡凋亡和卵巢間質(zhì)損傷[1]。育齡女性腫瘤患者放化療后的生育能力保存一直是生殖領(lǐng)域被關(guān)注的熱點之一。卵巢皮質(zhì)冷凍復(fù)蘇經(jīng)原位移植后，卵泡可以自然發(fā)育并排卵。因此，卵巢皮質(zhì)冷凍在生育力保存中的重要性正在受到越來越多生殖專家的關(guān)注。然而卵巢皮質(zhì)冷凍技術(shù)還需要進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化，如何在卵巢組織冷凍復(fù)蘇和移植過程中減少原始卵泡的損失，提高移植后卵泡的存活率，對女性生育力保存技術(shù)的發(fā)展具有重要意義[2]。

白藜蘆醇是一種植物抗毒素，屬于多酚類化合物，存在于葡萄、虎杖、花生等植物中，研究表明，白藜蘆醇具有抗炎、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗病毒、抗氧化等藥理活性[3]。白藜蘆醇作為一種作用較強(qiáng)的天然抗氧化劑，在多種組織和器官中發(fā)揮著抗凋亡作用，既往研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過影響核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（hemeoxygenase 1，HO-1）信號通路，增強(qiáng)Nrf2 蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[4]，但這種保護(hù)作用在卵巢冷凍復(fù)蘇中是否存在，還需要進(jìn)一步證實。

本研究采用新生小鼠卵巢冷凍復(fù)蘇移植為模型，在冷凍復(fù)蘇液中加入白藜蘆醇，通過檢測復(fù)蘇后卵巢組織凋亡，觀察移植后小鼠各級卵泡數(shù)量及卵巢組織形態(tài)變化及卵巢組織中剪切型多聚ADP 核糖多聚糖（Cleaved-PARP）、Nrf2/HO-1信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化，探討白藜蘆醇減少卵巢冷凍復(fù)蘇損傷的作用機(jī)制，以期為白藜蘆醇在卵巢冷凍復(fù)蘇中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物取31 只SPF 級5 日齡雌性CD-1小鼠，10 只SPF 級6 周齡雌性CD-1 小鼠，體質(zhì)量20 ～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。實驗動物飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心，晝夜節(jié)律12 h/12 h，環(huán)境溫度（25±2）℃，相對濕度（50±5）%。動物實驗研究內(nèi)容經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審核通過，倫理編號：1811040。

1.2 主要試劑與儀器L15 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；MEM-α（美國Gibco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，廣州潔特生物過濾股份有限公司）；卵巢冷凍液、卵巢復(fù)蘇液（日本KITAZATO BioPharma 公司）；Nrf2抗體（美國Proteintech 公司）；HO-1抗體（美國Abcam 公 司）；Cleaved-Caspase-3 抗 體、PARP抗體、Cleaved-PARP 抗體（美國CST 公司）；β-tubulin（南京翼飛雪生物科技有限公司）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記（TUNEL）異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；山羊血清、免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、山羊抗小鼠IgG（H+L）-辣根過氧化物酶（HRP）二抗、山羊抗兔IgG（H+L）-HRP 二抗（南京翼飛雪生物科技有限公司）。倒置顯微鏡（日本Nikon 公司，型號：TS100）；體式顯微鏡（日本Nikon公司，型號：SMZ1000）；數(shù)碼化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海Tanon公司，型號：4500SF）；37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司，型號：150i）；低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號：5702R）。

1.3 新生小鼠卵巢分離、冷凍、復(fù)蘇選取5 日齡CD-1雌性小鼠13只，處死后酒精消毒，背部取出雙側(cè)卵巢（共26 只卵巢）用于冷凍復(fù)蘇后進(jìn)行TUNEL 和Cleaved-Caspase-3 免疫組織化學(xué)染色。將卵巢分為空白對照組，模型對照組，白藜蘆醇0.5、2.5、5 μmol·L-1組共5組，每組5只。白藜蘆醇3 個劑量組卵巢在冷凍前用含有0.5、2.5、5 μmol·L-1白藜蘆醇的MEM-α 體外培養(yǎng)1 h，隨后置于含有相同劑量的白藜蘆醇的冷凍液中液氮冷凍，模型對照組卵巢置于空白冷凍液中進(jìn)行液氮冷凍，4 組均液氮中保存。5 d 后取出組織，模型對照組置于空白復(fù)蘇液中進(jìn)行復(fù)蘇，白藜蘆醇3個劑量組分別置于含有0.5、2.5、5 μmol·L-1白藜蘆醇的復(fù)蘇液中復(fù)蘇?？瞻讓φ战M不做冷凍復(fù)蘇處理。根據(jù)TUNEL染色結(jié)果選擇白藜蘆醇劑量5 μmol·L-1，并取空白對照組、模型對照組及白藜蘆醇5 μmol·L-1組卵巢組織切片進(jìn)行Cleaved-Caspase-3 免疫組織化學(xué)染色及后續(xù)實驗。

另取8只5日齡CD-1雌性小鼠，背部取出雙側(cè)卵巢（共16 只卵巢）用于Western Blot蛋白檢測，分為空白對照組、模型對照組及白藜蘆醇5 μmol·L-1組，每組5只卵巢，空白對照組不進(jìn)行冷凍復(fù)蘇直接提取蛋白，模型對照組及白藜蘆醇組同上處理。

剩余10 只5 日齡CD-1 雌性小鼠卵巢用于冷凍復(fù)蘇后腎被膜移植實驗。將來源于同只小鼠的雙側(cè)卵巢，一側(cè)卵巢置于空白培養(yǎng)基中，為模型對照組，另一側(cè)卵巢置于含有5 μmol·L-1白藜蘆醇的培養(yǎng)基中設(shè)為白藜蘆醇組，培養(yǎng)1 h 后取出卵巢組織。模型對照組卵巢放置于空白冷凍液中冷凍，白藜蘆醇組卵巢放置于含有5 μmol·L-1白藜蘆醇的冷凍液中冷凍后，2 組均置于液氮中保存。5 d后取出組織，模型對照組卵巢置于空白復(fù)蘇液中進(jìn)行復(fù)蘇，白藜蘆醇卵巢組置于含有5 μmol·L-1白藜蘆醇的復(fù)蘇液中復(fù)蘇后立即進(jìn)行移植。

1.4 新生小鼠卵巢異體腎被膜下移植選取6 周齡CD-1雌鼠10只作為受體鼠，腹腔注射240 mg/kg阿弗丁給小鼠進(jìn)行麻醉，將復(fù)蘇后的同1只小鼠的卵巢組織（1只卵巢為模型對照組，另1只卵巢為白藜蘆醇組）分別移到受體鼠的兩側(cè)腎被膜下，同時摘除受體鼠雙側(cè)卵巢[5]。送回動物中心飼養(yǎng)，于移植后第5天取材5 只，移植后第14天取材5 只，取出移植卵巢，采用中性福爾馬林溶液固定卵巢組織后石蠟包埋切片（厚5 μm）。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 TUNEL FITC 染色法觀察卵巢組織細(xì)胞凋亡 按照TUNEL FITC 諾維贊A111-01 說明書操作染色，熒光顯微鏡下拍照。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測卵巢組織Cleaved-Caspase-3 表達(dá) 將石蠟組織切片于65 ℃烘箱中烘干后，放置于二甲苯、梯度乙醇中各2 min，單蒸水清洗2 次，采用3%過氧化氫-甲醇去除內(nèi)源性過氧化物。然后在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中煮沸15 min，山羊血清室溫封閉。加入Cleaved-Caspase-3抗體，4 ℃濕盒過夜，TBS清洗，加入二抗孵育1 h，TBS 清洗，加入三抗孵育1 h 后，清洗。DAB顯色后蘇木素染色，正置顯微鏡下拍照。

1.5.3 小鼠卵巢組織連續(xù)切片后卵泡總數(shù)及各級卵泡數(shù)的記錄 異體移植后的卵巢組織連續(xù)切片后，進(jìn)行HE 染色，置于顯微鏡下觀察，統(tǒng)計各級卵泡數(shù)量。根據(jù)文獻(xiàn)研究[5]標(biāo)準(zhǔn)，按照細(xì)胞核計數(shù)，扁平顆粒細(xì)胞為原始卵泡，一層立方形顆粒細(xì)胞為初級卵泡，一層以上立方形顆粒細(xì)胞為次級卵泡，出現(xiàn)腔隙為有腔卵泡。正常卵泡呈圓形，顆粒細(xì)胞分布均勻。異常卵泡卵母細(xì)胞不完整或消失，顆粒細(xì)胞排列不規(guī)則，部分脫落，部分可見卵母細(xì)胞核固縮或皺縮[6]。

1.5.4 Western Blot法檢測復(fù)蘇卵巢中蛋白表達(dá)的變化 提取卵巢組織總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定樣本的蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，聚偏氟乙烯（PVDF）轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后，加入兔源Nrf2 抗體（1∶800 稀 釋）、HO-1 抗 體（1∶800 稀 釋）、Cleaved-Caspase-3 抗體（1∶800 稀釋）、PARP 抗體（1∶800 稀釋）、Cleaved-PARP（1∶800 稀釋）以及β-tubulin 抗體（1∶2 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入二抗孵育1 h后，加入ECL發(fā)光液顯影。采用圖像分析軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，量化目的蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計方法采用Graphpad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對冷凍復(fù)蘇后卵巢組織中細(xì)胞凋亡的影響圖1結(jié)果顯示，冷凍復(fù)蘇處理后的卵巢組織（模型對照組）出現(xiàn)TUNEL 熒光信號強(qiáng)度，隨著白藜蘆醇處理濃度（0.5、2.5、5 μmol·L-1）的增加，TUNEL 熒光信號強(qiáng)度逐漸降低，表明白藜蘆醇可以降低冷凍復(fù)蘇后卵巢組織中的細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴性，確定后續(xù)實驗的白藜蘆醇處理濃度為5 μmol·L-1。

圖1 TUNEL熒光染色檢測卵巢組織細(xì)胞凋亡結(jié)果Figure 1 Results of TUNEL fluorescence staining detecting apoptosis in ovarian tissue

2.2 白藜蘆醇對冷凍復(fù)蘇后卵巢組織中凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3表達(dá)的影響圖2結(jié)果顯示，冷凍復(fù)蘇處理后的卵巢組織（模型對照組）出現(xiàn)凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）。加入5 μmol·L-1白藜蘆醇處理后，白藜蘆醇組凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)較模型對照組顯著減少（P＜0.01），表明冷凍復(fù)蘇對新生小鼠卵巢組織造成了凋亡損傷，白藜蘆醇可以抑制冷凍復(fù)蘇過程中卵巢組織凋亡。

圖2 卵巢組織Cleaved-Caspase-3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Figure 2 Immunohistochemical staining results of ovarian tissue for Cleaved-Caspase-3

2.3 白藜蘆醇對冷凍復(fù)蘇后卵巢組織中卵泡存活的影響圖3、表1 和圖4、表2 結(jié)果顯示，白藜蘆醇5 μmo·L-1組卵巢移植5、14 d 后的卵泡總存活率較模型對照組均明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。移植5 d后進(jìn)行卵泡計數(shù)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇5 μmol·L-1組原始卵泡存活率較模型對照組均明顯改善（P＜0.05）。移植14 d 后各級卵泡計數(shù)顯示，白藜蘆醇5 μmol·L-1組初級卵泡、竇卵泡存活率較模型對照組均明顯增加（P＜0.05）。表明白藜蘆醇可以增加冷凍復(fù)蘇后卵巢組織中卵泡的數(shù)量，減少冷凍復(fù)蘇中卵泡的丟失，改善移植卵巢組織卵泡的存活率，卵泡后期發(fā)育情況優(yōu)于模型對照組。

圖3 卵巢移植5 d后HE染色結(jié)果（×20）Figure 3 HE staining results at 5 days after ovarian transplantation（×20）

圖4 卵巢移植14 d后HE染色結(jié)果Figure 4 HE staining results at 14 days after ovarian transplantation

表1 卵巢移植5 d后各級卵泡計數(shù)結(jié)果Table 1 Follicle count results at all levels at 5 days after ovarian transplantation（±s，n=5）

注：卵泡存活率=存活卵泡數(shù)/總卵泡數(shù)×100%。①P＜0.05，與模型對照組比較

?

表2 卵巢移植14 d后各級卵泡計數(shù)結(jié)果Table 2 Follicle count results at 14 days after ovarian transplantation （±s，n=5）

表2 卵巢移植14 d后各級卵泡計數(shù)結(jié)果Table 2 Follicle count results at 14 days after ovarian transplantation （±s，n=5）

注：卵泡存活率=存活卵泡數(shù)/總卵泡數(shù)×100%。①P＜0.05，與模型對照組比較

?

2.4 白藜蘆醇對冷凍復(fù)蘇后卵巢組織中Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達(dá)的影響圖5結(jié)果顯示，新鮮的小鼠卵巢組織經(jīng)過冷凍復(fù)蘇損傷后，模型對照組凋亡蛋白Cleaved-PARP/PARP 比值明顯增加，抗氧化蛋白Nrf2、HO-1 表達(dá)水平顯著降低，與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。卵巢組織經(jīng)過冷凍復(fù)蘇并移植5 d后，白藜蘆醇處理組抗氧化蛋白Nrf2 表達(dá)水平明顯升高，凋亡蛋白Cleaved-PARP/PARP 比值明顯減低，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），HO-1 表達(dá)水平升高，但與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明白藜蘆醇可以通過Nrf2/HO-1 信號通路減輕冷凍復(fù)蘇后卵巢組織氧化應(yīng)激損傷。

圖5 各組卵巢組織Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Figure 5 Determination results of Nrf2/HO-1 signaling pathway related proteins in ovarian tissue

3 討論

生殖醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展促進(jìn)了各種生育力保存技術(shù)的進(jìn)步。胚胎、卵母細(xì)胞和卵巢皮質(zhì)的冷凍保存可以使女性腫瘤患者在癌癥治愈后繼續(xù)生育[7]。但胚胎冷凍法在青春期前和無配偶的女性腫瘤患者中應(yīng)用，卵母細(xì)胞冷凍也還尚未完全成熟。成熟卵母細(xì)胞在冷凍復(fù)蘇過程中存在著細(xì)胞紡錘體、細(xì)胞骨架和透明帶的損傷，存在潛在的子代遺傳安全隱患[8]。冷凍卵巢組織經(jīng)復(fù)蘇處理后可以通過原位或異位移植重建卵巢功能。卵巢皮質(zhì)冷凍復(fù)蘇移植后，卵泡可以自然發(fā)育并排卵。截至2017 年，全世界已經(jīng)有80 多例應(yīng)用該方法的嬰兒出生[9]。然而，卵巢皮質(zhì)冷凍技術(shù)存在一定的技術(shù)難度，并未得到廣泛應(yīng)用。同時，在皮質(zhì)復(fù)蘇和移植過程中會損失大量的原始卵泡，影響治療效果[10]。卵巢組織復(fù)蘇移植過程中，復(fù)蘇回移的組織中會產(chǎn)生大量的氧自由基，引起卵泡的閉鎖和卵巢間質(zhì)細(xì)胞的大量損傷。此外，移植后新生血管再灌注也會促使移植卵巢組織中產(chǎn)生氧自由基、炎癥遞質(zhì)等，進(jìn)一步造成卵泡與卵巢間質(zhì)細(xì)胞的凋亡[11]。因此，如何降低回移卵巢組織的氧化應(yīng)激十分重要。

Nrf2是一種廣泛存在于各種組織細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)水平與氧化應(yīng)激水平有關(guān)，能夠調(diào)節(jié)炎癥與氧化應(yīng)激基因的表達(dá)，在機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷中起著重要的作用；HO-1 是血紅素分解代謝過程中的限速酶，可降解血紅素為一氧化碳、膽綠素和亞鐵離子，是Nrf2 發(fā)揮抗炎和抗氧化作用的關(guān)鍵分子[12]。Nrf2/HO-1 途徑是機(jī)體氧化應(yīng)激調(diào)控的重要信號通路，活性氧（ROS）的大量產(chǎn)生可使損傷組織Nrf2 表達(dá)升高，激活下游抗氧化基因HO-1 表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力[13]。動物實驗表明，Nrf2/HO-1 級聯(lián)反應(yīng)對缺血再灌注損傷過程中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)均具有顯著的抑制效果，當(dāng)Nrf2/HO-1 表達(dá)上調(diào)時，ROS 水平降低，炎癥因子的產(chǎn)生顯著減少[14]。

白藜蘆醇為含有二苯乙烯結(jié)構(gòu)的多酚類化合物，其在神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、腫瘤、炎癥等方面均有廣闊的應(yīng)用前景[3]。近年來白藜蘆醇在生殖力保存中，也有廣泛的報道。在精液冷凍保護(hù)液中添加白藜蘆醇可以通過降低精子內(nèi)ROS 水平減少精子冷凍損傷，從而改善解凍后精子的質(zhì)量和功能[15]。在凍融小鼠卵巢組織自體移植中，白藜蘆醇可以通過下調(diào)NF-κB，從而減少炎癥因子IL-6 的產(chǎn)生，減少卵巢組織自體移植的卵泡丟失，白藜蘆醇還可以通過增加超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá)、減少丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化對卵母細(xì)胞的損傷[16]。在胚胎玻璃化冷凍復(fù)蘇中，白藜蘆醇可以改善玻璃化冷凍-解凍后胚胎線粒體分布異常和功能損傷[17]。此外，白藜蘆醇還可以通過增加線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)和ATP 含量改善卵母細(xì)胞成熟率、受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率[18]。但是，白藜蘆醇對新生小鼠卵巢冷凍復(fù)蘇的保護(hù)作用及其對Nrf2/HO-1 通路的調(diào)控作用尚未見報道。為了研究白藜蘆醇處理的冷凍復(fù)蘇新生小鼠卵巢中卵泡的長期發(fā)育情況，需要將新生小鼠卵巢組織進(jìn)行異體移植后體內(nèi)發(fā)育。由于新生小鼠卵巢組織較小，無法進(jìn)行卵巢組織原位移植，而腎被膜下血管豐富，移植卵巢活動區(qū)域較為局限，手術(shù)切口損傷小，被認(rèn)為是動物卵巢移植的適宜部位之一[19]。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，白藜蘆醇處理組的冷凍復(fù)蘇卵巢中細(xì)胞凋亡明顯減少，卵泡存活率增加，凋亡標(biāo)志蛋白Cleaved-PARP 及Cleaved-Caspase-3 表達(dá)明顯降低，證明白藜蘆醇可以通過降低卵巢組織的凋亡水平來提高冷凍復(fù)蘇后卵泡的存活率。Western Blot 結(jié)果證實，抗氧化蛋白Nrf2、HO-1 表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示卵巢組織的抗凋亡保護(hù)作用與Nrf2/HO-1 信號通路有密切的關(guān)系。

綜上所述，在卵巢冷凍前用白藜蘆醇對卵巢組織進(jìn)行預(yù)處理，并在卵巢冷凍液及復(fù)蘇液中同時加入白藜蘆醇后，異體移植的冷凍復(fù)蘇卵巢組織凋亡水平降低，卵泡存活率增加。本研究成果可為白藜蘆醇作為臨床中卵巢組織冷凍保護(hù)劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。但白藜蘆醇在卵巢組織冷凍復(fù)蘇中的臨床應(yīng)用，還需要進(jìn)一步深入研究。