電針聯(lián)合推拿對大鼠卒中后認(rèn)知功能障礙的恢復(fù)作用及海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的參與機(jī)制

李子康， 余小江， 萬婷， 羅貴聰， 張蕊， 張靜

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

卒中后認(rèn)知功能障礙被定義為多個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域（如學(xué)習(xí)、記憶和執(zhí)行功能）的衰退，這可能長期影響三分之一的中風(fēng)幸存者[1-2]。聯(lián)合療法的概念對于治療復(fù)雜卒中具有重要的指導(dǎo)意義，電針聯(lián)合推拿因其操作簡單易行、副作用少而被廣泛應(yīng)用于臨床。本課題組前期臨床應(yīng)用電針聯(lián)合推拿治療卒中后認(rèn)知功能障礙患者，取得了良好的療效，但其作用機(jī)制尚不明確。小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中大量存在，約占總神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的20%[3]。研究[3]表明，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要常駐免疫細(xì)胞，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中并參與微環(huán)境的調(diào)控。小膠質(zhì)細(xì)胞參與幾乎所有的腦部疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷和精神疾病等，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌促炎和抗炎介質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程中發(fā)揮重要的作用[4]。因此，本研究建立大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠模型，觀察電針聯(lián)合推拿對大鼠卒中后認(rèn)知功能障礙的治療作用及對海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，以期為臨床治療卒中提供更多的理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物無特定病原體（SPF）級成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量250 ～300 g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心（中國武漢），生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照國家衛(wèi)生研究院和廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。本研究方案已經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，動物倫理批號：AEWC-2001461。

1.2 試劑與儀器戊巴比妥鈉（美國Merck Millipore公司）；TRIzol試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶MASTER MIX 試劑盒（日本TaKaRa 公司）。單絲尼龍縫線（L3600，廣州嘉陵有限公司）；電針裝置（KWD-808 Ⅱ，常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 模型建立與分組用1%戊巴比妥鈉（200 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，根據(jù)Longa等[5]研究構(gòu)建MCAO模型。具體操作步驟如下：暴露左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）并小心隔離。在遠(yuǎn)端結(jié)扎ECA 后，在ECA 上開一個(gè)小切口，將單絲尼龍縫線從ECA切口處插入ICA，直到感覺到輕微的阻力。在2 h 的缺血期后，緩慢移除單絲尼龍縫線以恢復(fù)大腦中動脈（MCA）區(qū)域的血液供應(yīng)，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠給予相同的手術(shù)，但不插入單絲尼龍縫線。若觀察到大鼠未能伸出右前爪，向右盤旋，甚或向右跌倒則判斷造模成功[5]。

分組如下：假手術(shù)組、模型組、治療組，每組6只。假手術(shù)組，作為空白對照；模型組大鼠構(gòu)建MCAO 模型；治療組大鼠構(gòu)建MCAO 模型后，給予電針聯(lián)合推拿治療。

1.4 電針聯(lián)合推拿干預(yù)電針與推拿在一天的同一時(shí)間（大約上午9∶00）先后進(jìn)行。大鼠被固定在固定裝置（在針刺干預(yù)前至少3 d，使大鼠適應(yīng)制動裝置）中。采用0.25 mm × 13 mm 一次性無菌不銹鋼針插入百會（GV20）和足三里（ST36）[6]。根據(jù)華興邦等發(fā)表的“大鼠穴位圖譜的研制”[7]確定穴位操作的準(zhǔn)確位置。GV20 位于頭頂，正中矢狀線與兩耳尖連線的交點(diǎn)處。ST36 位于膝關(guān)節(jié)下腓骨頭遠(yuǎn)端5 mm 處，脛骨結(jié)節(jié)外側(cè)2 mm 處。將兩個(gè)電極附著在電針治療組大鼠的頭部，使用電針裝置對大鼠進(jìn)行刺激，疏密波頻率為2/15 Hz。選擇頭頂部百會、神庭（GV24，大鼠頭前正中線，額頂骨縫交界線前方），腿部足三里，點(diǎn)按法操作每次10 min。術(shù)后第1 天開始電針聯(lián)合推拿治療，每日1次，連續(xù)7 d。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 神經(jīng)學(xué)評分 所有行為學(xué)檢測均在白天進(jìn)行，且提前3 d 進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，避免大鼠產(chǎn)生焦慮和恐慌，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（1）滾軸試驗(yàn)（rotard test）：將大鼠首先放置在以4 r/s轉(zhuǎn)動的滾軸上，然后以加速度為0.3 r/s逐漸調(diào)整滾軸轉(zhuǎn)速并開始計(jì)時(shí)，當(dāng)大鼠掉落滾軸時(shí)停止計(jì)時(shí)，將大鼠從開始加速至掉落滾軸的時(shí)間進(jìn)行記錄。每隔1min 檢測1 次，共檢測5 次，取平均值作為最終試驗(yàn)結(jié)果。

（2）網(wǎng)格試驗(yàn)（grid test）：將大鼠首先置于水平金屬網(wǎng)格（12 cm × 12 cm，格間距為1 cm）上，待大鼠四腳爪均抓住金屬網(wǎng)格后，180°翻轉(zhuǎn)金屬網(wǎng)格裝置并開始計(jì)時(shí)，當(dāng)大鼠四腳爪均掉落網(wǎng)格時(shí)停止計(jì)時(shí)，懸掛時(shí)間超過180 s時(shí)僅計(jì)為180 s。每隔1 min檢測1次。共檢測5次，取其平均值作為最終試驗(yàn)結(jié)果。

1.5.2 莫里斯水迷宮試驗(yàn) 將大鼠置于EthoVision XT Morris 水迷宮視頻跟蹤測試系統(tǒng)中，該系統(tǒng)可以自動記錄大鼠找到平臺的時(shí)間。該程序如前所述[8]進(jìn)行。在干預(yù)的第40 天，開始為期5 d 的隱藏平臺試驗(yàn)。訓(xùn)練時(shí)間為60 s，所有動物每天訓(xùn)練2 次。找到平臺的時(shí)間被記錄為逃避潛伏期。大鼠需要人工引導(dǎo)在平臺上停留10 s，如果大鼠前5 d沒有找到平臺，則記錄逃避潛伏期為60 s。在第六天，移除平臺以測試大鼠的空間搜索能力，隨后記錄大鼠通過平臺最初放置處的頻率[9]，計(jì)算停留在目標(biāo)象限的時(shí)間百分比和在60 s內(nèi)首次到達(dá)平臺區(qū)的時(shí)間。

1.5.3 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法觀察腦梗死面積 使用戊巴比妥鈉（800 mg/kg）給予大鼠安樂死，經(jīng)心臟灌注生理鹽水。迅速取出腦，從口側(cè)至尾側(cè)冠狀切片，37 ℃避光，采用1%的TTC染色15 min。根據(jù)白色梗死區(qū)和紅紫色非梗死區(qū)區(qū)分腦組織。按照公式[10]計(jì)算：腦梗死面積=[對側(cè)半球面積-（同側(cè)半球面積-梗死面積）/對側(cè)半球面積]×100%。

1.5.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測腦組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CD206、Arg-1、IL-10 mRNA 表達(dá) 按照說明書指示，用TRIzol 試劑從各組大鼠腦組織中提取總RNA。用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶MASTER MIX 試劑盒獲得cDNA。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性35 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。引物擴(kuò)增長度為100 ～200 bp。用2-ΔΔCT方法[11]進(jìn)行目的基因定量，以GAPDH 做內(nèi)參。引物序列如下：IL-1β 上游引物為5’- TCCA GGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游引物為5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’；TNF-α 上游引物為5’-TGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’，下游引物為5’-GGAGGCCATTTGGGAACT-3’；IFN-γ上游引物為5’-TGAACGCTACACACTGCATCTTG G-3’，下游引物為5’-CGACTCCTTTTCCGCTTCC TGAG-3’；CD206 上游引物為5’-CTTCGGGCCTT TGGAATAAT-3’，下游引物為5’-TAGAAGAGCC CTTGGGTTGA-3’；Arg-1 上游引物為5’- CTTGG CTTGCTTCGGAACTC-3’，下游引物為5’-GGAG AAGGCGTTTGCTTAGTTC-3’；IL-10 上游引物為5’-GGTTGCCAAGCCTTATCGGA-3’，下游引物為5’-ACCTGCTCCACTGCCTTGCT-3’；GAPDH 上游引物為5’-AT GACCACAGTCCATGCCATC-3’，下游引物為5’-GAGCTTCCCGTTCAGCTCTG-3’。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（USA）和Graph prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），事后檢驗(yàn)采用Tukey’s多重比較法。P為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針聯(lián)合推拿改善MCAO 模型大鼠腦梗死面積及神經(jīng)功能為探究電針聯(lián)合推拿是否能夠減輕卒中大鼠腦損傷及恢復(fù)神經(jīng)功能，本研究進(jìn)行了滾軸試驗(yàn)和網(wǎng)格試驗(yàn)觀察其行為學(xué)表現(xiàn)，采用TTC染色觀察腦梗死面積。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠滾軸和網(wǎng)格停留時(shí)間縮短（均P＜0.01），腦梗死面積增大；與模型組比較，治療組大鼠滾軸和網(wǎng)格停留時(shí)間延長（均P＜0.01），腦梗死面積減小。見圖1。上述結(jié)果表明，電針聯(lián)合推拿可有效改善卒中大鼠腦梗死面積及神經(jīng)功能。

圖1 各組大鼠神經(jīng)學(xué)評分、腦梗死面積比較Figure 1 Comparison of neurological scores and cerebral infarct size among various groups of rats

2.2 電針聯(lián)合推拿改善MCAO 大鼠認(rèn)知功能障礙為探究電針聯(lián)合推拿是否可以改善MCAO大鼠的認(rèn)知功能障礙，本研究進(jìn)行了莫里斯水迷宮試驗(yàn)，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數(shù)降低，第1次達(dá)到平臺的時(shí)間增加，停留在目標(biāo)象限的時(shí)間比降低（均P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數(shù)升高，第1次達(dá)到平臺的時(shí)間減少，停留在目標(biāo)象限的時(shí)間比升高（均P＜0.01）。見圖2。上述結(jié)果表明，電針聯(lián)合推拿可有效改善MCAO 大鼠的認(rèn)知功能障礙。2.3 電針聯(lián)合推拿促進(jìn)MCAO 大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞M2 極化為了探究電針聯(lián)合推拿是否對MCAO大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生了影響，本研究通過qRT-PCR 法檢測了各組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中M1、M2 極化標(biāo)志物的mRNA 表達(dá)變化，結(jié)果顯示：模型組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞M1 極化標(biāo)志物（IL-1β、TNF-α、IFN-γ）表達(dá)較假手術(shù)組升高（均P＜0.01），而M2 極化標(biāo)志物（CD206、Arg-1、IL-10）表達(dá)較假手術(shù)組降低（均P＜0.01）；治療組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞M1 極化標(biāo)志物表達(dá)較模型組降低（均P＜0.01），而M2 極化標(biāo)志物表達(dá)較模型組升高（均P＜0.01）。見圖3。以上結(jié)果表明，電針聯(lián)合推拿可促進(jìn)MCAO 大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞從M1 極化向M2極化發(fā)展。

圖2 各組大鼠認(rèn)知功能比較（莫里斯水迷宮試驗(yàn)）Figure 2 Comparison of cognitive function among various groups of rats（Morris water maze test）

圖3 各組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2極化標(biāo)志物mRNA表達(dá)比較Figure 3 Comparison of mRNA expressions of M1 and M2 polarization markers in microglial cells among various groups of rats

3 討論

卒中后認(rèn)知功能障礙歸屬于中醫(yī)學(xué)“善忘”“呆癡”“神呆”“愚癡”“呆病”等范疇，病位主要在腦，臟腑虛衰以致痰瘀內(nèi)生、痹阻腦竅是本病發(fā)生、發(fā)展的共性機(jī)制，開竅醒神、健脾通絡(luò)為主要治法。百會和足三里是中醫(yī)臨床治療中風(fēng)最常用的穴位。百會屬于督脈，具有清頭散風(fēng)、開竅醒神之功效。足三里屬于胃經(jīng)，具有健脾和胃、益氣補(bǔ)虛、通絡(luò)除痹的功效。兩穴同用具有補(bǔ)中益氣、安神定志、調(diào)節(jié)陰陽之效，研究表明，電針百會、足三里穴可以通過多種途徑和環(huán)節(jié)減輕中風(fēng)后炎癥損傷，減少腦梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[12-16]。而推拿可以改善組織灌注、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞應(yīng)激和炎癥[17-18]，有助于機(jī)械刺激后運(yùn)動/神經(jīng)肌肉系統(tǒng)重塑[19-20]。神庭穴屬于督脈，具有清頭散風(fēng)、鎮(zhèn)靜安神之功效，主治頭痛、眩暈、癲狂癇、失眠、健忘等證。本研究應(yīng)用電針百會穴、足三里穴聯(lián)合點(diǎn)按百會、神庭、足三里穴治療MCAO 模型大鼠，神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果表明，MCAO模型大鼠的運(yùn)動和感覺協(xié)調(diào)性降低，而電針聯(lián)合推拿可在一定程度上改善這種情況。本研究進(jìn)一步通過TTC 染色法觀察了MCAO 大鼠大腦梗死情況，其結(jié)果與神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果相一致，MCAO模型大鼠腦梗死面積顯著增加，而電針聯(lián)合推拿可減輕大鼠腦梗死，表明MCAO 大鼠接受電針聯(lián)合推拿治療后，運(yùn)動協(xié)調(diào)性、認(rèn)知功能及腦梗死情況均得到顯著改善。

小膠質(zhì)細(xì)胞是具有高度可塑性的細(xì)胞，對改變其環(huán)境的刺激反應(yīng)多樣[21-22]。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活被定義為經(jīng)典激活（M1）和選擇性激活（M2）表型[23]，M1 小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放促炎細(xì)胞因子破壞神經(jīng)元，相反，M2 小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌神經(jīng)保護(hù)介質(zhì)和營養(yǎng)因子[24]。有研究揭示了缺血性卒中后梗死周圍區(qū)域存在M2-M1 小膠質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變[25]。這種小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化亦在脊髓損傷模型中報(bào)道[26]。提示小膠質(zhì)細(xì)胞的表型改變可能是多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的共同病理機(jī)制。小膠質(zhì)細(xì)胞的M1/M2極化主要通過M1（例如IL-1β、TNF-α、IFN-γ）和M2（例如CD206、IGF-1、TGF-β、Arg-1、IL-10）相關(guān)基因的表達(dá)來分類[27-29]。M2 小膠質(zhì)細(xì)胞可吞噬受損的神經(jīng)細(xì)胞碎片，抑制過度的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)和神經(jīng)元再生，防止繼發(fā)性炎癥損傷，并維持正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境[30]。維持小膠質(zhì)細(xì)胞的M2 表型，同時(shí)抑制M1 小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，對于減輕缺血性卒中后腦損傷具有很大的潛力。Lu 等[31]通過觀察小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2 極化標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素促進(jìn)動脈閉塞-再灌注（MCAO/R）小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化，抑制M1 極化，可使神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，MCAO大鼠接受電針聯(lián)合推拿治療后，腦組織M1極化標(biāo)志物IL-1β、TNF-α、IFN-γ mRNA 表達(dá)顯著減弱，M2 極化標(biāo)志物CD206、Arg-1、IL-10 mRNA 表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示MCAO大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的極性由M1 轉(zhuǎn)變到了M2，表明聯(lián)合治療在一定程度上促進(jìn)了MCAO 大鼠腦組織抗炎反應(yīng)。

綜上所述，電針聯(lián)合推拿可通過介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M2 極化改善大鼠卒中后認(rèn)知功能障礙，但調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化過程復(fù)雜，具體的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。