南、北五味子對(duì)離體大鼠氣管平滑肌張力的影響

董 陽(yáng),王碧涵,鄒一卓,李 婷,孫靖輝,李 賀,陳建光,王春梅

(北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是一種慢性炎癥性氣管疾病,臨床上治療大部分使用西藥,如腎上腺糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物、腎上腺素受體激動(dòng)劑等,西藥雖然能緩解癥狀,但長(zhǎng)期服用大多會(huì)引發(fā)不良反應(yīng)[1-2].因此,迫切需要更加安全和更加有效的哮喘治療方法.五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有斂肺、滋腎、生津、收汗、澀精等功效,歷代醫(yī)家均重視其在疾病防治方面的獨(dú)特運(yùn)用.王佳然等[3]通過(guò)對(duì)眾多方劑數(shù)據(jù)深度挖掘與分析,在《中國(guó)方劑數(shù)據(jù)庫(kù)》中將含有五味子的所有方劑進(jìn)行了歸納,篩選出600多含有五味子的方劑,在這些方劑中以治療肺部疾病占大多數(shù),頻率高達(dá)55%.夏瑜楨等[4]通過(guò)對(duì)《中醫(yī)方劑大辭典》、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)等搜索、查閱,對(duì)治療哮喘的中藥分布規(guī)律進(jìn)行了研究,明確了五味子在治療哮喘所用中藥中排名靠前.由此可見(jiàn),五味子在治療哮喘中占據(jù)重要地位.

五味子由于生長(zhǎng)區(qū)域不同,有南北之分,主要產(chǎn)于東北地區(qū)的五味子習(xí)慣性稱(chēng)為“北五味子”,主要產(chǎn)于西南地區(qū)及長(zhǎng)江流域以南地區(qū)的五味子習(xí)慣性稱(chēng)為“南五味子”.2000年版本的《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)北五味子和南五味子分別進(jìn)行了收錄,并各自制定了相對(duì)應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn).2015年版本的《中華人民共和國(guó)藥典》中記錄了因南、北五味子形態(tài)、產(chǎn)地不同,成分各有差異,功能主治也各有側(cè)重[5-6].李時(shí)珍在《本草綱目》中有“五味子今分南北,南產(chǎn)者色紅,北產(chǎn)者色黑,入藥補(bǔ)必用北者乃良”.在治療咳喘癥方面,《本草會(huì)編》中記載“五味子治喘嗽,須分南北.生津液止渴、潤(rùn)肺、補(bǔ)腎、勞嗽,宜用北者;風(fēng)寒在肺,宜用南產(chǎn)”[7];《本草備要》記載“北產(chǎn)紫黑者良,入滋補(bǔ)藥,蜜浸蒸,入滋嗽藥,生用俱褪碎核;南產(chǎn)色紅而枯,苦風(fēng)寒在肺宜南者.從蓉為使,惡萎荻,熬膏良”[8];《本草蒙荃》記載“風(fēng)寒咳嗽,南五味為奇,虛損勞傷,北五味最妙”[9].由此可見(jiàn),南、北五味子在哮喘的傳統(tǒng)用藥上是有差異的.目前,有關(guān)于五味子及其有效成分治療哮喘疾病的藥理學(xué)基礎(chǔ)研究較少,其發(fā)揮治療作用的有效成分和作用機(jī)制尚不明確.因此,本研究擬采用現(xiàn)代工藝分離提取南、北五味子木脂素及多糖成分,通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析南、北五味子不同成分對(duì)氣管平滑肌張力的影響,揭示其發(fā)揮作用的最佳活性部位,為該藥治療肺系疾病的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠(動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(吉)2018-0007,長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司)40只,體質(zhì)量250～300 g.大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng),可自由進(jìn)食飲水,動(dòng)物用水為生活飲用水,供水方法是由飲水瓶自由攝取,每日一換;更換墊料1～2次/周.試驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)定.

1.1.2 試 劑

北五味子(吉林);南五味子(四川);五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司);無(wú)水乙醇、氯化乙酰膽堿(ACh)、二甲基亞砜(DMSO)、氯化鈉(NaCl)、氯化鎂(MgCl2)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

1.1.3 儀 器

HW-1000恒溫水浴、JH-2張力換能器、BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(泰盟科技有限公司);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 五味子木脂素的制備與含量測(cè)定

將五味子粉碎后過(guò)40目篩,按料液比m∶V=1∶8(g∶mL)的比例加入95%乙醇,加熱回流1 h,連續(xù)提取兩次,合并兩次的濾液進(jìn)行抽濾,將抽濾后的液體進(jìn)行旋蒸濃縮;加入蒸餾水使乙醇濃度達(dá)到70%,放置24 h后再次進(jìn)行抽濾并旋蒸,然后用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行洗滌,再用95%的乙醇洗脫,收集乙醇洗脫液進(jìn)行旋蒸濃縮;最后將濃縮液在水浴鍋上加熱直至完全無(wú)醇味,放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥即得五味子木脂素粗提物[10].

采用HPLC法測(cè)定木脂素含量.具體步驟:分別精確稱(chēng)取3 mg五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子醇乙、五味子丙素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇超聲溶解于10 mL容量瓶中,制備標(biāo)準(zhǔn)溶液,4 ℃保存?zhèn)溆?將50 mg木脂素粉末溶解在10 mL容量瓶中,用于制備5 mg/mL的樣品儲(chǔ)備溶液;取混合標(biāo)準(zhǔn)品及樣品儲(chǔ)備液各1.5 mL,通過(guò)0.45 μm的有機(jī)膜注入進(jìn)樣瓶中,放置4 ℃?zhèn)溆?作為待測(cè)樣品.

檢測(cè)條件:色譜柱為Waters ODC(上海楚定分析儀器有限公司,250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫為30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm.以甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL.梯度洗脫程序?yàn)?～15 min(40%～25%B),16～20 min(25%B),21～30 min(25%～10%B),31～40 min(10%～0B),41～45 min(0B),46～55 min(0～40%B)[11-12].

1.2.2 五味子多糖的制備與含量測(cè)定

將五味子粉碎,按料液比m∶V=1∶10(g∶mL)的比例將五味子加入蒸餾水中進(jìn)行浸泡,24 h后回流提取2次,2.5 h/次;合并溶液后將其抽濾旋蒸濃縮,向濃縮液中加入95%乙醇,使乙醇終濃度為75%,4 ℃靜置24 h,抽濾收集沉淀物;依次用95%乙醇和無(wú)水乙醇對(duì)沉淀物進(jìn)行洗滌,待醇味揮發(fā)后水浴蒸干,得粉末狀五味子多糖[13].

采用苯酚-硫酸法測(cè)定五味子多糖含量.具體步驟:吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL(相當(dāng)于葡萄糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg),置于25 mL比色管中,分別補(bǔ)水至2.0 mL,加入5%苯酚溶液1.0 mL,緩慢加入10 mL濃硫酸,混勻,置沸水浴中煮沸2 min,冷卻后測(cè)定吸光度值(485 nm);以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);準(zhǔn)確吸取五味子多糖溶液2.0 mL,置于25 L比色管中,加入5%苯酚溶液1.0 mL,混勻;小心加入濃硫酸10 mL,在旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻,置沸水浴中煮沸2 min,冷卻至室溫;485 nm處測(cè)定吸光度值,計(jì)算粗多糖含量[14].

1.2.3 大鼠離體氣管環(huán)的制備

用25%烏來(lái)糖(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,將大鼠固定在操作臺(tái)上,腹面向上,將頸部正中央的表皮剪開(kāi),沿甲狀軟骨底部至氣管下部分叉處截取氣管;將截取后的氣管迅速放入預(yù)先配制的4 ℃預(yù)冷營(yíng)養(yǎng)液中,使用手術(shù)剪除去氣管環(huán)周?chē)嘤嘟M織后,將氣管剪切成長(zhǎng)度約2～4 mm的氣管環(huán);立即將氣管環(huán)下端固定在恒溫浴槽中,上端固定在張力傳感器上,靜息張力調(diào)節(jié)至1.0 g;使氣管環(huán)在10 mL預(yù)熱 37 ℃的營(yíng)養(yǎng)液中平衡60 min,每間隔15 min更換一次預(yù)熱的營(yíng)養(yǎng)液,并持續(xù)向浴槽內(nèi)通入混合氣體(95%O2和5%CO2)[15];待氣管環(huán)張力趨于穩(wěn)定后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.4 南、北五味子木脂素和多糖對(duì)大鼠氣管環(huán)張力的直接影響

在大鼠離體氣管環(huán)張力穩(wěn)定后,分別累積加入終濃度為0.25～1.75 mg/mL的五味子木脂素溶液和0.06～2.00 mg/mL的五味子多糖溶液,加藥后氣管環(huán)的張力趨于穩(wěn)定后再加入下一個(gè)濃度的藥物;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組累計(jì)加入相應(yīng)體積的二甲基亞砜(DMSO)或蒸餾水,記錄每一次加藥后平穩(wěn)狀態(tài)下氣管環(huán)張力值,并計(jì)算抑制率:抑制率=(給藥后氣管環(huán)的張力值-靜息狀態(tài)下的氣管環(huán)張力值)/靜息狀態(tài)下氣管環(huán)的張力值×100%.

1.2.5 南、北五味子木脂素和多糖對(duì)ACh預(yù)收縮氣管環(huán)張力的影響

在大鼠離體氣管環(huán)張力穩(wěn)定后,用1 mmol/L ACh誘導(dǎo)浴槽中的氣管環(huán)收縮,待氣管環(huán)收縮幅度趨于平穩(wěn)時(shí),向浴槽中按濃度遞增的順序累積加入五味子木脂素溶液(0.25～1.75 mg/mL)或五味子多糖溶液(0.06～2.00 mg/mL);實(shí)驗(yàn)對(duì)照組累積加入相應(yīng)體積的DMSO或蒸餾水,加藥方法同1.2.4,并計(jì)算抑制率:抑制率=(ACh刺激氣管環(huán)所產(chǎn)生的最大收縮張力-加入待測(cè)藥物后氣管環(huán)的張力)/(ACh刺激氣管環(huán)所產(chǎn)生的最大收縮張力-靜息狀態(tài)下的氣管環(huán)張力)×100%[16-17].

1.2.6 南、北五味子木脂素對(duì)KCl預(yù)收縮氣管環(huán)張力的影響

在大鼠離體氣管環(huán)張力穩(wěn)定后,用80 mmol/L KCl誘導(dǎo)浴槽中的氣管環(huán)收縮,待氣管環(huán)收縮幅度趨于平穩(wěn)時(shí),向浴槽中按濃度遞增的順序累積加入五味子木脂素溶液(0.06～1.75 mg/mL);對(duì)照組累積加入等濃度的DMSO,加藥方法同1.2.4,并計(jì)算抑制率:抑制率=(KCl誘發(fā)氣管環(huán)的最大收縮張力-加入待測(cè)藥物后的氣管環(huán)張力)/(KCl誘發(fā)氣管環(huán)的最大收縮張力-靜息狀態(tài)下氣管環(huán)張力)×100%.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 五味子木脂素含量

本研究結(jié)果顯示,北五味子中6種木脂素總含量為(19.33±0.95)mg/g,南五味子中6種木脂素總含量為(18.63±0.89)mg/g.

2.2 五味子多糖含量

本研究結(jié)果顯示,北五味子多糖提取率為18.1%,粗多糖含量為20.5 mg/g;南五味子多糖提取率為16.3%,粗多糖含量為19.27 mg/g.

2.3 南、北五味子多糖和木脂素對(duì)大鼠氣管環(huán)靜息張力的抑制率

本研究結(jié)果顯示,南、北五味子多糖對(duì)靜息狀態(tài)下離體大鼠氣管環(huán)的張力無(wú)明顯影響,與蒸餾水對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見(jiàn)表1.南、北五味子木脂素對(duì)靜息狀態(tài)下離體大鼠氣管環(huán)的張力亦無(wú)明顯影響,與DMSO對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見(jiàn)表2.提示南、北五味子多糖和木脂素對(duì)離體大鼠氣管環(huán)均無(wú)明顯的直接作用.

表1 南、北五味子多糖對(duì)大鼠氣管環(huán)靜息張力的抑制率Tab.1 Inhibition rate of polysaccharides of southern and northern Schisandra chinensis on resting tension of tracheal rings in rats (n=6)

表2 南、北五味子木脂素對(duì)大鼠氣管環(huán)靜息張力的抑制率Tab.2 Inhibition rate of lignans of southern or northern Schisandra chinensis on resting tension of tracheal rings in rats (n=6)

2.4 南、北五味子多糖和木脂素對(duì)ACh預(yù)收縮氣管環(huán)張力的抑制率

本研究結(jié)果顯示,南、北五味子多糖對(duì)ACh預(yù)收縮氣管環(huán)張力未見(jiàn)明顯影響,與蒸餾水對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見(jiàn)表3.與DMSO對(duì)照組比較,南、北五味子木脂素均可顯著抑制ACh誘導(dǎo)的氣管環(huán)收縮(P<0.05),最大抑制率分別為(68.21±10.08)%和(71.72±9.80)%.見(jiàn)表4.提示木脂素可能是南、北五味子發(fā)揮平喘作用的主要成分.

表3 南、北五味子多糖對(duì)ACh預(yù)收縮氣管環(huán)張力的抑制率Tab.3 Inhibition rate of polysaccharides of southern and northern Schisandra chinensis on tracheal ring tension precontracted by ACh (n=6)

表4 南、北五味子木脂素對(duì)ACh預(yù)收縮氣管環(huán)張力的抑制率Tab.4 Inhibition rate of lignans of southern and northern Schisandra chinensis on tracheal ring tension precontracted by ACh (n=6)

2.5 南、北五味子木脂素對(duì)KCl預(yù)收縮氣管環(huán)張力的抑制率

本研究結(jié)果顯示,與DMSO對(duì)照組比較,南、北五味子木脂素均可顯著抑制KCl誘導(dǎo)的氣管環(huán)收縮(P<0.05),最大抑制率分別為(79.36±11.66)%和(82.89±11.90)%,提示木脂素可能是南、北五味子發(fā)揮平喘作用的主要成分.見(jiàn)表5.

表5 南、北五味子木脂素對(duì)KCl預(yù)收縮氣管環(huán)張力的抑制率Tab.5 Inhibition rate of lignans of southern and northern Schisandra chinensis on tracheal ring tension precontracted by KCl (n=6)

3 討 論

哮喘致病原因比較復(fù)雜,目前,世界范圍內(nèi)哮喘病患者已達(dá)3億,中國(guó)的哮喘患者已達(dá)2 000萬(wàn),并且哮喘病患者呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì).專(zhuān)家預(yù)測(cè),到2025年,世界范圍內(nèi)哮喘病患者將超過(guò)4億[18].五味子是治療肺系疾病的“要藥”,止咳平喘的臨床療效肯定,然而有關(guān)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少.所以,探究南、北五味子不同成分的平喘作用、揭示其發(fā)揮作用的最佳活性部位具有重要意義.

本研究采用離體灌流方法對(duì)大鼠離體氣管環(huán)張力值的變化進(jìn)行分析,此方法可直觀地根據(jù)張力值的變化分析出藥物對(duì)大鼠離體氣管平滑肌張力值的影響.將南、北五味子木脂素和多糖按照濃度由低到高逐次累加到浴槽內(nèi)作用于離體大鼠氣管環(huán),結(jié)果表明,處于靜息狀態(tài)下的氣管平滑肌的張力值沒(méi)有顯著的變化,提示南、北五味子多糖和木脂素對(duì)離體大鼠氣管環(huán)均無(wú)顯著的直接作用.大鼠氣管平滑肌上存在可以釋放乙酰膽堿的膽堿能神經(jīng),能使大鼠氣管平滑肌趨于靜息狀態(tài)[19].當(dāng)氣管平滑肌細(xì)胞膜表面偶聯(lián)的特異性受體與細(xì)胞外的其他生物信號(hào)結(jié)合后,能夠激活相應(yīng)的信號(hào)通路,實(shí)現(xiàn)信息的傳輸,通過(guò)信息的傳輸可以實(shí)現(xiàn)氣管平滑肌的舒張與收縮[20].氣管平滑肌上存在很多特異性與非特異性的受體,其中影響平滑肌舒張與收縮的受體主要是M膽堿能受體與組胺受體,兩種受體興奮狀態(tài)下會(huì)造成氣管平滑肌收縮[21].本研究使用M膽堿受體激動(dòng)劑ACh預(yù)收縮氣管環(huán),待張力穩(wěn)定后,將南、北五味子木脂素和多糖按照濃度由低到高的方式逐次累加到浴槽內(nèi)作用于離體大鼠氣管環(huán).結(jié)果顯示,南、北五味子多糖對(duì)Ach誘導(dǎo)的氣管環(huán)收縮沒(méi)有明顯影響;南、北五味子木脂素可劑量依賴(lài)性地抑制由Ach誘導(dǎo)的氣管環(huán)收縮,從最大抑制率可以看出南、北五味子木脂素對(duì)由ACh引起的收縮所產(chǎn)生舒張氣管平滑肌作用的強(qiáng)弱無(wú)明顯差異.

有研究[22-23]顯示,高鉀可引起細(xì)胞膜去極化,并特異性激活電壓依賴(lài)性鈣通道(VDCCs)使細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流,引起氣管平滑肌收縮.本研究使用KCl預(yù)收縮氣管環(huán),待張力穩(wěn)定后,將南、北五味子木脂素按濃度累加方式刺激離體大鼠氣管.結(jié)果顯示,南、北五味子木脂素可劑量依賴(lài)性的抑制由KCl誘導(dǎo)的氣管環(huán)收縮,從最大抑制率可以看出,南、北五味子木脂素對(duì)由KCl引起的收縮所產(chǎn)生舒張氣管平滑肌作用的強(qiáng)弱無(wú)明顯差異.

綜上所述,南、北五味子木脂素和多糖對(duì)離體大鼠氣管平滑肌靜息張力均未見(jiàn)明顯影響;而南、北五味子木脂素對(duì)ACh或KCl預(yù)收縮的氣管環(huán)張力均呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性的抑制作用,但二者之間比較無(wú)明顯差異,提示木脂素可能是五味子發(fā)揮平喘作用的主要成分.有關(guān)其舒張氣管平滑肌的機(jī)制將在后續(xù)的工作中進(jìn)一步深入研究.