國內(nèi)新一代高精準無創(chuàng)多癌早期篩查專家
——探癌者

山東中醫(yī)藥大學(xué)

焦欣怡，郝 昊，蘇浩然，孫艷茹，楊 帆

1 作品介紹

本文研發(fā)的探癌者是一種癌癥早期診斷試劑盒，采用新一代“高精準無創(chuàng)多癌”早期癌癥篩查基因檢測技術(shù)，通過檢測著名的原癌基因——MicroRNA-21，可以實時監(jiān)控癌癥狀態(tài)，及時反映受檢者當下是否患癌，是具有實際意義的多種癌癥早篩技術(shù)。

圖1 抗癌者試劑盒

本產(chǎn)品是一種檢測癌癥標志物MicroRNA 及癌細胞內(nèi)MicroRNA 的試劑盒。該試劑盒操作程序簡單、靈敏度高、特異選擇性好，可大大地減少假陽性等誤診情況，適用于各種動物和人體內(nèi)MicroRNA 的快速檢測。

本產(chǎn)品試劑盒的組成為：四螺旋結(jié)構(gòu)DNA 分子探針（200 μL）、聚合酶（200 μL）、切刻內(nèi)切酶（200 μL）、緩沖液（500 μL）、SERS 信號探針（500 μL）、引物1（500 μL）、引物2（500 μL）、發(fā)夾引物（500 μL）。

產(chǎn)品使用說明：

（1）抽取外周血，分離使細胞分層，取其中一層破碎并用試劑盒測。

（2）循環(huán)反應(yīng)實驗：在四螺旋結(jié)構(gòu)DNA 分子探針的懸浮液中，加入待測的細胞粉碎（提取的MicroRNA）、引物1、引物2、dNTP、 聚合酶、適量緩沖液在37 ℃環(huán)境下反應(yīng)2 h；然后取上清液，再加入 dNTP、聚合酶、切刻內(nèi)切酶、適量緩沖液、 SERS 信號探針和發(fā)夾引物，反應(yīng)2 h。

（3）SERS 強度測試：上述反應(yīng)完成后，經(jīng)過磁分離，取磁珠部分稀釋到200 μL 進行SERS 測試。

（4）SERS 檢測操作：用吸液器吸取待測液。擠壓吸液器，輕輕將液滴置于基片上；將基片置于加熱板上，將溫度調(diào)到30～40 ℃，等待待測樣品液滴揮發(fā)完畢，留下痕跡；設(shè)置好拉曼光譜儀，將基片置于顯微鏡下，調(diào)光源為可見光，將待測樣品覆蓋區(qū)域置于視野下，以高倍鏡對其精確對焦；將光源切換為激光，獲取拉曼光譜。

2 技術(shù)原理

本產(chǎn)品是利用四螺旋結(jié)構(gòu)DNA 的循環(huán)放大技術(shù)對癌癥標志物微小核糖核酸（MicroRNA）和癌細胞內(nèi)MicroRNA進行表面增強拉曼散射（SERS）識別和免疫檢測。該試劑盒設(shè)計是受癌癥標志物MicroRNA 的適體識別啟發(fā)，通過與四螺旋結(jié)構(gòu)DNA 的雜交以及DNA 剪切-聚合反應(yīng)循環(huán)實現(xiàn)對SERS 檢測信號的放大，進而實現(xiàn)對癌癥標志物MicroRNA及癌細胞內(nèi)MicroRNA 高靈敏和高特異選擇性的識別和檢測。以下是產(chǎn)品的主要技術(shù)說明

（1）表面增強拉曼散射（SERS）檢測：拉曼散射是指光通過介質(zhì)時由于入射光與分子運動相互作用而引起的頻率發(fā)生變化的散射。當一些分子被吸附到某些粗糙的金屬時，如金、銀或銅的表面，它們的拉曼譜線強度會得到極大的增強，這種不尋常的拉曼散射增強現(xiàn)象被稱為表面增強拉曼散射效應(yīng)。

SERS 檢測技術(shù)因具有高靈敏度、光譜選擇性、測定快、數(shù)據(jù)準確、靈敏度高等特點成為分析檢測癌癥疾病的一個非常有前景的手段。此外，表面增強拉曼檢測技術(shù)具有制樣簡單、非入侵和無損等獨特優(yōu)點。拉曼信號分子標記物不會自猝滅和光漂白，這樣就可以通過增加探針上染料分子的個數(shù)和增加光譜累積時間來增強拉曼信號，提高檢測的靈敏度。SERS 檢測手段具有背景低、有效避免光致褪色、有效增強分子的拉曼強度、靈敏度高的優(yōu)勢，越來越受到科學(xué)界的關(guān)注，在癌癥疾病分析檢測領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

（2）DNA 循環(huán)網(wǎng)絡(luò)：作為一種納米級別的分子，DNA 以其自身的可編程性、結(jié)構(gòu)的多樣性和變化的可控性等諸多優(yōu)點而活躍于納米科學(xué)、生物科學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域。

本技術(shù)利用DNA 堿基的精確配對和序列可設(shè)計的特性，可以設(shè)計具有信號放大功能的DNA 循環(huán)網(wǎng)絡(luò)，將DNA 循環(huán)放大方法引入試劑盒生物傳感分析中，具有消耗樣品量少、快速、靈敏的優(yōu)勢，近年來被廣泛應(yīng)用于DNA、細胞、生物分子和胚胎的檢測。將DNA 反應(yīng)設(shè)計成可以自發(fā)循環(huán)的過程，從而能夠?qū)z測信號放大，有效提高對目標物的檢測限，同時減少被測樣品的消耗量。

（3）癌癥標志物微小核糖核酸（MicroRNA-21）：核糖核酸（RNA）是廣泛存在于生物體內(nèi)的重要遺傳信息載體。其中，能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA 分子稱為編碼RNA，也稱信使RNA（mRNA）；不能翻譯成蛋白質(zhì)的 RNA 分子稱非編碼RNA（ncRNA）。微小RNA（MicroRNA）是ncRNA 的一種。

MicroRNA（miRNA）是一類具有調(diào)控功能的小分子非編碼RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，對生物體的生長、發(fā)育、衰老和死亡等生命過程都有著重要的作用。近年來，大量研究結(jié)果表明，許多miRNA 可作為原癌基因或者抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色，其中miR-21 最受人重視。大量實驗證明，在多種腫瘤細胞中，miR-21 的表達均出現(xiàn)顯著異常，揭示miR-21 作為一個致癌miRNA，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。因此，本產(chǎn)品選用癌癥標志物miR-21 作為檢測對象，進行實時動態(tài)監(jiān)測。

3 應(yīng)用前景

據(jù)2019年國家癌癥中心發(fā)布的最惡性腫瘤發(fā)病數(shù)據(jù)，近十年我國癌癥的新發(fā)人數(shù)和死亡人數(shù)逐年增加。平均每分鐘就有7.5 人被確診為癌癥，4.4 人死于癌癥，癌癥已成為當前危及人類生命健康的第一殺手。癌癥防治的唯一出路為“三早”，即早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計，一般癌癥早、中、晚期發(fā)現(xiàn)的治愈率有顯著差異，早期發(fā)現(xiàn)的5年以上治愈率高達90%，而中晚期發(fā)現(xiàn)的5年以上治愈率大多在40%以下，可見早診早治是癌癥治愈的重要保障。探癌者，致力于多種癌癥的早期篩查與預(yù)防技術(shù)的研究應(yīng)用，能夠幫助人類減少因惡性疾病所導(dǎo)致的健康損傷與生命財產(chǎn)損失。