小花老鼠簕可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及其生物學(xué)活性研究

李喆 黃媛林 朱俊華 胡文進(jìn) 王巧貞 黃庶識 潘信利

摘 要：小花老鼠簕（Acanthus ebracteatus）是一種生長在紅樹生態(tài)系統(tǒng)的珍稀真紅樹植物，具有較高的藥用價值。為研究小花老鼠簕內(nèi)生及根際可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，挖掘其潛在新物種及具有特殊生物學(xué)活性的菌株，該文利用7種不同培養(yǎng)基，通過傳統(tǒng)稀釋涂布法對小花老鼠簕各植物組織及根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離，基于16S rRNA基因序列解析其內(nèi)生及根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征，應(yīng)用植物病原菌平板對峙實驗和平鋪捕食活性測試分析其可培養(yǎng)細(xì)菌的抗菌活性。結(jié)果表明：（1）基于16S rRNA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)從小花老鼠簕的根、莖、葉、花及根際土壤中分離得到144株可培養(yǎng)細(xì)菌，這些細(xì)菌隸屬于18目26科37屬66種，芽孢桿菌屬（Bacillus）和鏈霉菌屬（Streptomyces）為優(yōu)勢菌屬，分別占細(xì)菌種數(shù)的15.1%和13.6%；（2）拮抗多種植物病原菌試驗結(jié)果顯示，獲得29株具有拮抗植物病原菌活性的細(xì)菌，10株具有廣譜抑菌活性，其中鏈霉菌屬菌株拮抗作用最強(qiáng)且菌株Y129為潛在新物種。（3）捕食活性測試結(jié)果顯示，有5株細(xì)菌對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（multi－drug resistance Staphylococcus aureus）及大腸埃希氏菌（Escherichia coli）具有捕食活性，假單胞菌屬菌株捕食活性最強(qiáng)，其中菌株Y90為潛在新物種。綜上表明，紅樹植物小花老鼠簕及其根際土壤中蘊含著豐富的細(xì)菌種質(zhì)資源且具有多種生物活性，可作為生防菌和藥源菌的來源之一，該研究結(jié)果為提高紅樹植物小花老鼠簕的藥效和栽培提供了理論參考。

關(guān)鍵詞： 小花老鼠簕， 可培養(yǎng)細(xì)菌， 植物病原菌， 捕食活性

中圖分類號：Q939.96

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000－3142（2023）04－0635－14

Abstract：Acanthus ebracteatus is a special kind of rare mangrove plant， possessing great medicinal value. In this paper， in order tostudy the diversity of endophytic and rhizosphere culturable bacteria in the A. ebracteatus， we explored new potential bacterial species and strains with special biological activities. The culturable bacteria were isolated from A. ebracteatus by dilution separation method. The bacterial diversity was investigated based on the 16S rRNA gene sequence analysis. In addition， the confrontation experiment and lawn predation assay were utilized to screen bacteria with anti－microorganism activities. The results were as follows： （1） A total of 144 culturable bacteria were isolated from A. ebracteatus root， stems， leaves， flowers and rhizosphere soil. These bacteria were affiliated into 66 species based on the analysis of the 16S rRNA gene sequence. The bacterial genera Bacillus and Streptomyces were dominant in plant tissue and rhizosphere soil with that of the value 15.1% and 13.6%， respectively. （2） The bioactivity assays revealed that there were 29 strains with anti－fungal activity and 10 strain possessing a broad spectrum of anti－fungal activity. Among them， the Streptomyces strains had the strongest antagonistic effect， and the active strain Y129 was a potential new species. （3） A total of five strains showed predation activity on Staphylococcus aureus， multi－drug resistance Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Pseudomonas had the strongest predatory activity， and the active strain Y90 was a potential new species. In conclusion， A. ebracteatus and their rhizosphere soil contain rich bacterial germplasm resources and have a variety of functional strains， which can be used as one of the sources of biocontrol bacteria and medicinal bacteria. This study provides the theoretical reference for improving the efficacy and cultivation of A. ebracteatus.

Key words： Acanthus ebracteatus， culturable bacteria， plant pathogens， predation activity

珍稀瀕危真紅樹植物小花老鼠簕屬于爵床科（Acanthaceae）老鼠簕屬（Acanthus），主要分布于我國海南、廣東和廣西等地的紅樹林潮間帶（中國植物志，2004）。其果實具有解毒消腫的功效，葉子提取物具有保護(hù)神經(jīng)作用，根可用于乙型肝炎的治療（中華本草，1999；陳玫伶等，2019）。近十幾年來，紅樹林的過度開發(fā)導(dǎo)致紅樹物種多樣性減少，有近1/3紅樹植物處于瀕危狀態(tài)，其中包括小花老鼠簕。黃麗艷等（2020）的研究調(diào)查了該物種在廣西的分布及種群特征，發(fā)現(xiàn)僅在防城港市江山半島西南側(cè)和黃竹江中游潮灘存有不足2 000株小花老鼠簕。林誠（2009）研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌部分或全部定殖于植物組織，與植物生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性、抗逆性甚至藥用活性等密切相關(guān)且部分內(nèi)生細(xì)菌具有與宿主植物相同或相似的活性功能，表明藥用植物內(nèi)生細(xì)菌是抗生素、生物農(nóng)藥的來源之一。近幾年來，許多研究學(xué)者熱衷于挖掘紅樹林生境來源細(xì)菌的生物學(xué)活性，如抗血栓（李菲等，2020）、抗衰老（李蜜等，2020）、拮抗植物病原菌（顏棟美等，2018；李菲等，2021）、抗腫瘤（梁靜娟等，2006）、耐受重金屬（De La Rosa－Acosta et al.， 2015）和降解多環(huán)芳烴（Guo et al.， 2005）等。紅樹植物內(nèi)生及根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌不僅多樣性豐富，還是一個理想的藥源菌和生防菌資源庫。

近年來，臨床上多重耐藥菌感染嚴(yán)重威脅人類健康，其耐藥范圍廣，毒性大，濫用抗生素加重了治愈的難度，因此尋找新型藥源來解決這一瓶頸尤為重要（陳方圓等，2010；王曉彤等，2020）。捕食性細(xì)菌（predatory bacteria）能夠在營養(yǎng)缺乏或者競爭環(huán)境下通過“吞噬”其他細(xì)菌來獲取能量和營養(yǎng)物質(zhì)（Kadouri et al.，2013；Negus et al.，2017）。Arend等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，被確定為滑柱菌屬（Herpetosiphon）的菌株CA052B能對大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）、奇異變形桿菌（Pfiodeus mirabidis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等10種具有臨床相關(guān)性的病原菌進(jìn)行捕食活動。Livingstone等（2018）的研究指出，黃色粘球菌（Myxococcus xanthus）的捕食機(jī)制能以廣泛的細(xì)菌為食，并使用不同的多因素機(jī)制來殺死和降解不同的獵物。研究表明部分捕食性細(xì)菌也是專性的細(xì)菌捕食者，對部分哺乳動物細(xì)胞系不造成傷害（Gupta et al.， 2016；Monnappa et al.， 2016），如在小鼠、兔子、豚鼠和雞中，已經(jīng)驗證了在其體內(nèi)施用捕食性細(xì)菌的安全性，說明捕食性細(xì)菌具有“活抗生素”作用的潛力（Westergaard et al.， 1977；Atterbury et al.， 2011；Shatzkes et al.， 2017.）。另外在農(nóng)業(yè)上，香蕉枯萎尖孢鐮刀菌、芒果炭疽病原菌等有害微生物導(dǎo)致的流行病對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了較大影響，目前對植物病原菌的防控措施主要包括栽培管理、培育抗病品種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、物理防治和生物防治等方面，其中以化學(xué)防治為主，化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用致使農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞（詹儒林等，2005；許家輝等，2007）且使有害微生物表現(xiàn)出抗藥性，因此亟須找到新的防治手段（黃媛林等，2021）。目前，普遍認(rèn)為低毒、污染小的生物防治是最有潛力的防治措施（張魯斌，2010；王超等，2017）。

本研究以采集自海南的紅樹植物小花老鼠簕為研究材料，采用傳統(tǒng)稀釋涂布法對其植物組織和根際土壤進(jìn)行可培養(yǎng)細(xì)菌分離，并通過以多種植物病原菌和人類致病菌為指示菌測試細(xì)菌活性，擬探討以下問題：（1）小花老鼠簕內(nèi)生和根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性；（2）可培養(yǎng)細(xì)菌的不同生物活性；（3）對活性菌株的抑菌能力及其功能酶活性進(jìn)行初步鑒定，以獲得具有潛在藥用價值的菌株。本研究為開展小花老鼠簕的保護(hù)育種及新型生物醫(yī)藥的開發(fā)等工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 小花老鼠簕樣本采集于海口市東寨港紅樹林保護(hù)中心（11°34′47″ E、19°57′1″ N）， 分別收集小花老鼠簕的根、莖、葉、花及其根際10 cm處土壤，密封袋分裝，4 ℃保藏帶回實驗室進(jìn)行預(yù)處理。

1.1.2 指示菌 香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense）1號（Tr1）和4號（Tr4）侵染小種、香蕉炭疽病原菌（Colletotrichum musae）、芒果炭疽病原菌（C. gloeosporioides）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院李其利老師提供。

金黃色葡萄球菌ATCC6538、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300來源于ATCC菌種保藏中心（American Type Culture Collection）；大腸埃希氏菌CMCC（B）44102來源于CMCC保藏中心（National Center for Medical Culture Collections）。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基。AGG：可溶性淀粉10 g，葡萄糖1 g，甘油5 mL，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL。ISP7：甘油15 mL，L－酪氨酸0.5 g，L－天冬酰胺1 g，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。ISP3：可溶性燕麥粉20 g，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL。M7：酵母提取粉5 g，L－天冬酰胺1 g，甘油10 mL，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。M5：海藻糖5 g，脯氨酸1 g，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂15 g，維生素母液1 mL，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。腐殖酸培養(yǎng)基：腐殖酸1 g，CaCO3 0.02 g，Na2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 1.7 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

M10：淀粉10 g，水解酪素0.5 g，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL。復(fù)合鹽母液：KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NH4NO3 0.1 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，MnCl2·H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g，去離子水10 mL（注：K2HPO4 溶液須單獨配置，高溫滅菌后按比例加入培養(yǎng)基）。抑制劑：分別配備重鉻酸鉀及放線菌酮溶液，使用0.22 μm無菌過濾器進(jìn)行過濾備用，添加終濃度分別為25 mg·L－1和50 mg·L－1。改良ISP2培養(yǎng)基：酵母提取粉2 g，麥芽浸出粉2 g，無水葡萄糖2 g，去離子水1 000 mL。

（2）指示菌培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取粉5 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL。

（3）捕食活性測試培養(yǎng)基。TPM培養(yǎng)基：1 mL 1 mol·L－1 Tris－HCl溶液，1 mL 0.8 mol·L－1 MgSO4·7H2O溶液，使用l mol·L－1 KH2PO4溶液調(diào)節(jié)pH至7.6。

（4）酶活鑒定培養(yǎng)基。酯酶篩選培養(yǎng)基：分別以吐溫20、吐溫60及吐溫80為底物（添加量為1%），胰蛋白胨1 g，去離子水1 000 mL，瓊脂15 g。脲酶篩選培養(yǎng)基：以30%尿素溶液為底物（添加量為2%），胰蛋白胨1 g，NaCl 5 g，葡萄糖1 g，KH2PO4 2 g，酚紅0.012 g，瓊脂15 g ， 去離子水1 000 mL，pH 6.8～6.9。其他參考文獻(xiàn)進(jìn)行纖維素酶（宋朝霞等，2018）、幾丁質(zhì)酶（Roberts & Selitrennikoff，1988）、淀粉酶及蛋白酶（趙雅慧等，2018）篩選培養(yǎng)基的配制。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 植物組織：使用無菌水沖洗小花老鼠簕各組織器官表面泥土，預(yù)處理方法（李菲等，2017）對樣品表面進(jìn)行消毒，依次使用5%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，0.2%吐溫20溶液浸泡3 min，75%酒精浸泡3 min且浸泡每種消毒液后均使用無菌水沖洗樣品3次。消毒完成后將其晾干，使用無菌手術(shù)刀分別將各植物組織剪成1 cm ×1 cm大小，充分研磨后加入1 mL無菌水制成母液。

根際土壤：取適量根際土壤樣品均勻平鋪于陶瓷蒸發(fā)皿中，90 ℃熱激30 min后稱取1 g樣品，加入9 mL無菌水制成母液。

1.2.2 菌株分離和純培養(yǎng) 使用無菌水將各植物組織及根際土壤母液稀釋至10－3和10－4，分別吸取0.2 mL稀釋懸液涂布于7種不同的分離培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)7～28 d。通過肉眼觀察記錄不同菌株的形態(tài)及數(shù)目，對其進(jìn)行編號，并挑取不同菌落劃線至改良ISP2培養(yǎng)基上不斷純化直至得到純菌株。將獲得純培養(yǎng)后的菌株接種至改良ISP2斜面培養(yǎng)基并放置4 ℃保藏，同時制備30%（V/V）甘油凍存液，挑取新鮮菌苔制成凍存管保藏于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析及菌株鑒定 采用Chelex－100法（周雙清等，2010）提取菌株DNA，取0.1 mL高溫滅菌的20%樹脂水溶液，無菌牙簽挑取適量純培養(yǎng)菌株單菌落與其充分混合、研磨。100 ℃金屬浴10 min，通過離心充分沉淀Chelex－10顆粒，取上清作為PCR擴(kuò)增模板，參考Walsh等（1991）的方法，擴(kuò)增引物為27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和1522R（5′－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3′），PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性8 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行32個循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后，對陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，采用pGM－18T載體及感受態(tài)大腸桿菌Trans 10對其進(jìn)行克隆，采用引物M13F（5′－GTTTTCCCAGTCACGA－3′）和M13R（5′－CAGGAAACAGCTATGA－3′）對克隆菌落進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢驗合格后，將陽性克隆子送往上海生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。使用BioEdit及DNAstar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行整理，并將其提交至EZbiocloud序列比對平臺與儲存在該數(shù)據(jù)庫（https：//www.ezbiocloud.net/）已發(fā)表序列進(jìn)行序列比對，運用 MEGA10.0軟件，采用鄰近法（Neighbor－Joining）法、最大似然（Maximum－likelihood）法構(gòu)建系統(tǒng)樹，基于1 000次自展值（Boostrap值）分析各活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（Tamura et al.， 2011）。

1.2.4 拮抗植物病原真菌活性測試 采用平板對峙法對6種指示植物病原菌進(jìn)行菌株拮抗測試。每4株可培養(yǎng)菌株為一組，采用點植法依次將純化后的可培養(yǎng)菌株接種于PDA平板四周距離邊緣2 cm處，同時使用無菌打孔器將各植物病原真菌制成直徑5 mm菌餅，接種于PDA平板中心，設(shè)置只接種植物病原菌的PDA平板作為空白對照，每組試驗重復(fù)3次，置于28 ℃倒置培養(yǎng)數(shù)天，觀察記錄菌株生長及抑制情況，計算其抑菌率。

抑菌率=（對照組植物病原真菌菌落半徑-處理組植物病原真菌菌落半徑）/對照組植物病原真菌菌落半徑×100%。

1.2.5 捕食活性測試 將金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃，180 r·min－1震蕩培養(yǎng)24 h后離心去除培養(yǎng)基，并使用TPM液體培養(yǎng)基將菌體沖洗3次后重懸，將其稀釋到106 CFU·mL－1，吸取0.3 mL菌懸液均勻涂布于TPM瓊脂平板上制成含有被捕食細(xì)菌的平板待用。將可培養(yǎng)菌株以點植法接種于含有被捕食細(xì)菌的TPM平板上，同時將可培養(yǎng)菌株接種于不含被捕食細(xì)菌的TPM平板作為對照組，每組實驗重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察并測量出現(xiàn)的抑菌圈直徑。

1.2.6 酶活鑒定 對植物病原真菌拮抗活性測試及捕食活性測試篩選出的陽性菌株進(jìn)行不同酶活鑒定。使用無菌打孔器將待鑒定菌制成直徑5 mm菌餅，并接種到不同酶活篩選培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)2～7 d，通過觀察是否出現(xiàn)透明圈來對活性菌株酶活性進(jìn)行初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 小花老鼠簕內(nèi)生及根際可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

對采集來自?？谑袞|寨港紅樹林保護(hù)中心的小花老鼠簕樣品進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌及根際土壤細(xì)菌多樣性分離，通過菌株的形態(tài)、顏色和狀態(tài)進(jìn)行初步排重，選取144株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因測序分析，結(jié)果顯示獲得66種細(xì)菌，隸屬于18目26科37屬（表1），其中植物組織獲得46種，隸屬于17目19科28屬，根際土壤獲得37種，隸屬于14目19科21屬。基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)（圖1和圖2），內(nèi)生細(xì)菌及根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌均為芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas），此外，鏈霉菌屬（Streptomyces）也作為植物根部及根際土壤的優(yōu)勢菌屬之一。

從不同植物組織和根際土壤分離菌屬情況來看（圖3），根際土壤分離得到的細(xì)菌種屬數(shù)量最多，分布于21屬37種，其次為根部，而花中最少，分布于8屬9種。其中，根際土壤和植物組織分離得到12個相同的菌屬（圖4），分別來自不動桿菌屬（Acinetobacter）、Acuticoccus、芽孢桿菌屬、戈登氏菌屬（Gordonia）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、微桿菌屬（Microbacterium）、小單孢菌屬（Micromonospora）、分枝桿菌屬（Mycolicibacterium）、新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）及鏈霉菌屬。

從不同分離部位特異性來看，根際土壤獲得的細(xì)菌來自短桿菌屬（Brevibacterium），Diaphorobacter、假芽孢桿菌屬（Fictibacillus）、Jiella、Metabacillus，諾卡氏菌屬（Nocardia）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Rosenbergiella及沙雷氏菌屬（Serratia），而植物組織獲得的內(nèi)生菌株來自馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、壤霉菌屬（Agromyces）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、戴爾福特菌屬（Delftia）、甲基萘醌菌屬（Demequina）、歐文氏菌屬（Erwinia）、Ferrovibrio、Martelella、微球菌屬（Micrococcus）、莫拉氏菌屬（Moraxella）、Neobacillus、新根瘤菌屬（Neorhizobium）、泛菌屬（Pantoea）、普羅威登斯菌屬（Providencia）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）及黃單孢菌屬（Xanthomonas）。

2.2 菌株生物活性測試

采用平板對峙法篩選具有拮抗植物病原菌活性的菌株，結(jié)果顯示以寡營養(yǎng)培養(yǎng)基對可培養(yǎng)菌株進(jìn)行捕食活性測試試驗（圖5），獲得5株對3株人體指示病原菌均具有捕食活性的菌株；共有29株細(xì)菌能夠抑制至少一種植物病原菌，總陽性率為43.9%，其中10株對4種以上植物病原菌都具有抑制能力（圖6）。

采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，對10株拮抗多種植物病原菌菌株及5株捕食活性菌株的抗菌能力進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果如圖7所示，菌株Y108、Y263、Y553和Y130具有顯著活性，對6株植物病原菌都具有超過30%的抑制率，而菌株Y134、Y133和Y454拮抗植物病原菌能力相對較弱。從活性菌株對不同植物病原菌生長的抑制能力來看，菌株 Y108對葡萄座腔菌和香蕉炭疽病原菌的拮抗能力較強(qiáng)，菌株Y553對香蕉枯萎尖孢鐮刀菌4號小種和葡萄座腔菌的拮抗能力較強(qiáng)，而菌株 Y130和Y129分別對香蕉炭疽病原菌和芒果病原菌顯示出較強(qiáng)抑制活性；另外，5株捕食活性菌株對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌顯示出不同程度的捕食活性，除菌株Y330對大腸埃希氏菌表現(xiàn)出較弱捕食活性外，其余菌株對大腸埃希氏菌的捕食活性無明顯差別。其中，菌株Y90對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的捕食活性，其次為菌株Y522，而菌株Y145對兩種金黃色葡萄球菌的捕食活性較弱。

由分析結(jié)果表2可知，抑制多種植物病原菌菌株來源于芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、馬杜拉放線菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬及諾卡氏菌屬，其中，菌株Y129為潛在新物種。具有捕食活性的菌株分布于戴爾福特菌屬、Diaphorobacter、假單胞菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬，其中，菌株Y90為潛在新菌。從活性菌株屬級水平分析，芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬獲得最多抑制多種植物病原菌的菌株，均占拮抗植物病原菌活性菌株的30%，假單胞菌屬獲得最多捕食活性菌株，占捕食活性菌株的40%。此外，芽孢桿菌屬和假單胞菌屬均獲得具有拮抗植物病原菌活性及捕食活性的菌株；從活性菌株分離來源分析，活性菌株主要分布于根際土壤、植物根部和植物莖部，分別占活性菌株的60%、26.7%和13.3%。

2.3 生物活性菌株酶活分析

選用不同底物制備酶活測試平板，對15株活性菌株進(jìn)行酶活測試，結(jié)果（表3）表明，活性菌株均具有至少3種功能酶活性，其中來自鏈霉菌屬菌株Y130、Y129和馬杜拉放線菌屬菌株Y134具有顯著的功能酶活性，產(chǎn)酶陽性率均為75%，另外芽孢桿菌屬菌株Y553和Y263，假單孢菌屬菌株Y523，戴爾福特菌屬菌株Y330，沙雷氏菌Y319以及來自寡養(yǎng)單胞菌屬菌株Y145均表現(xiàn)出良好的酶活性，產(chǎn)酶陽性率均為62.5%；通過對不同酶活的陽性菌株數(shù)量進(jìn)行分析，對產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、脲酶、酯酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶顯示為陽性的活性菌株分別是15、12、8、5、5、3株，陽性率分別為100%、73.3%、53.3%、33.3%、33.3%、20%。

3 討論與結(jié)論

紅樹林特殊的生境必然會造就獨特而豐富的微生物種類， 微生物同時又是推動紅樹林生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動的主力軍（曹啟民等，2008）。本研究基于16S rRNA基因測序分析，對小花老鼠簕的根、莖、葉、花4種植物組織中內(nèi)生細(xì)菌及根際土壤細(xì)菌的多樣性進(jìn)行研究， 共分離得到可培養(yǎng)細(xì)菌66種，分布于18目26科37屬。相較于植物組織，根際土壤細(xì)菌的多樣性最為豐富，其次為根部，花中內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性最低，與李蜜等（2020）和李菲等（2021）的結(jié)果相似，這可能是由于紅樹林土壤中富含有機(jī)質(zhì)，紅樹植物落葉及其根系分泌物進(jìn)入土壤，為微生物生長和繁殖提供了豐富的能量來源（莊鐵誠和林鵬，1993）。此外，植物組織內(nèi)生細(xì)菌和根際土壤細(xì)菌群落構(gòu)成相似，優(yōu)勢菌屬均為芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，都含有來自放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria的細(xì)菌。然而，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)又顯示出特異性，從植物組織中獲得11個特有菌屬，從植物根際土壤中分離得到9個特有菌屬，這可能與不同微生物定殖于植物組織的選擇性有關(guān)，進(jìn)一步證實了內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)隨植物組織的不同具有多樣性、普遍性和特異性。

肖勝藍(lán)等（2011）研究表明，藥用植物中的部分內(nèi)生細(xì)菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分，是抗菌、抗植物病蟲害、抗病毒、抗癌等活性物質(zhì)來源的資源寶庫。紅樹林生境具有典型的海洋生境特征，為了適應(yīng)高鹽、低壓、潮濕及有機(jī)物富集的特點，紅樹林微生物類群形成了獨特的代謝路徑和生物學(xué)活性，具有開發(fā)新型海洋醫(yī)藥的潛力（曹啟民等，2008；呂佩帥等，2021）。本研究通過活性測試從小花老鼠簕內(nèi)生及根際可培養(yǎng)細(xì)菌中篩選到多個具有生物活性的菌株，就多樣性而言，獲得10株具有抑制多種植物病原菌活性的菌株，分別隸屬于芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、馬杜拉放線菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬及諾卡氏菌屬，5株分別來自戴爾福特菌屬、Diaphorobacter、假單胞菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬的細(xì)菌具有捕食多種人類病原菌活性，活性菌株表現(xiàn)出不同程度的生物活性， 其中鏈霉菌屬菌株對植物病原菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的拮抗作用， 而假單胞菌屬捕食活性最強(qiáng)；就新穎性而言，鏈霉菌屬菌株Y129及假單胞菌屬菌株Y90均為潛在新物種，同時相關(guān)研究表明植物內(nèi)生細(xì)菌的整個生命周期都生活在植物組織中，能夠通過產(chǎn)生具有活性的次生代謝產(chǎn)物和各種功能酶來保護(hù)植物免受病毒和病原菌的侵害，并能促進(jìn)植物生長發(fā)育（Saikkonen et al.， 2004；Afzal et al.， 2014; Fan et al.， 2020）。因此，具有良好生物活性的潛在新菌可作為開發(fā)新型無害的生物醫(yī)藥材料。另外，就活性菌株來源分析，活性菌株主要來源于根際土壤和植物根部，這與陳華等（2006）對海南18種紅樹和4種半紅樹植物的根際土壤、根、葉和果中分離篩選活性菌株的結(jié)果相似，活性菌株多分布于根際土壤，根部次之。研究表明植物根部和根際土壤細(xì)菌能夠通過產(chǎn)生活性次生代謝產(chǎn)物和鰲鐵化合物來抑制植物病原菌的生長，是理想的藥源菌來源之一（Strobel，2003；劉峰和洪葵，2006）。此外，通過酶活測試發(fā)現(xiàn)活性菌株普遍具有分泌多種功能酶的潛力，尤其對酯酶、蛋白酶及纖維素酶表現(xiàn)出顯著酶活力，這可能是因為紅樹林易受間歇性潮水浸淹影響，使得大量海洋動植物殘體聚集和落葉堆積，為微生物提供了豐富的代謝產(chǎn)物、纖維素和蛋白類等營養(yǎng)有機(jī)質(zhì)（趙雅慧等，2018）。同時，這些水解酶可能與細(xì)菌的捕食活性相關(guān)，捕食性細(xì)菌不僅能夠通過生產(chǎn)活性化合物來抑制病原菌，還能夠通過分泌多種溶解酶來裂解被捕食性細(xì)菌（Lambert et al.， 2006，2008；Keane & Berleman，2015）， 如粘球菌利用抗生素Myxovirescin、水解酶及蛋白酶MepA與細(xì)胞外膜囊泡協(xié)作共同裂解獵物細(xì)胞，并在捕食過程中產(chǎn)生多種不同活性的次級代謝產(chǎn)物和裂解酶，它們能作為新型活性化合物的來源（Keane & Berleman，2015），多種功能酶活的菌株能為針對性開發(fā)和利用藥用微生物資源提供理論依據(jù)和指導(dǎo)方向。

綜上所述，海南東寨港紅樹林保護(hù)中心藥用紅樹植物小花老鼠簕內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性豐富，并且具有多種生物活性，是后續(xù)研究新型生物醫(yī)藥的理想材料。

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（責(zé)任編輯 李 莉 王登惠）