豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染Marc-145 細(xì)胞的長(zhǎng)鏈非編碼RNA 和mRNA 轉(zhuǎn)錄組分析

張小霞，楊艷青，王秋云，杜俊陽(yáng)，曹瀚文，梁振普

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種母豬妊娠流產(chǎn)和仔豬呼吸困難的傳染性免疫抑制疾病[1]，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2?3]。PRRSV 是單股正鏈RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)約15 kb，屬動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的成員[4]。PRRSV 具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，能在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）、非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞（Marc-145）等細(xì)胞中增殖[5]。Marc-145細(xì)胞常被用于研究PRRSV 的感染機(jī)制及相關(guān)分子操控模式[6]。由于PRRSV具有突變率高、免疫抑制、持續(xù)感染且垂直傳播、抗體依賴性增強(qiáng)作用以及中和抗體產(chǎn)生延遲等特征，目前尚無(wú)有效疫苗預(yù)防[7?9]。因此，亟待研發(fā)有效的治療產(chǎn)品。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non?coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可能參與癌癥等人類疾病的發(fā)生[10]，也可能參與宿主抗病毒反應(yīng)的過(guò)程[11]。病毒入侵會(huì)引起自身或宿主產(chǎn)生lncRNA參與天然免疫應(yīng)答[12]，從而調(diào)節(jié)宿主與病毒的相互作用。如lincRNA-Tnfaip3 充當(dāng)NF-κB 共調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎性基因的表達(dá)[13]；lncRNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（Malat1）抑制細(xì)胞核中DNA 結(jié)合蛋白（TDP43）的降解，從而抑制核干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）啟動(dòng)的抗病毒天然免疫[14]。

ZHANG 等[15]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）對(duì)PRRSV 毒株GSWW/2015 和VR2332 感染24 h 的PAM 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)lnc_000397 通過(guò)誘導(dǎo)干擾素刺激基因（ISG）的表達(dá)負(fù)調(diào)控PRRSV 復(fù)制。PRRSV抗原在感染Marc-145 細(xì)胞10～20 h 內(nèi)可檢測(cè)到，并在感染后3～4 d 出現(xiàn)細(xì)胞病變[16?17]。然而，關(guān)于lncRNA 在PRRSV 感染初期過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制還有待研究。為探究PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞初期的lncRNA 和mRNA 的表達(dá)情況，對(duì)PRRSV 感染12 h的Marc-145細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析PRRSV感染后宿主細(xì)胞lncRNA 和mRNA 的表達(dá)譜變化及其二者的關(guān)聯(lián)情況，篩選出PRRSV感染中潛在的候選lncRNA 和靶基因，以期為PRRS 的防治提供新的研究思路及藥物靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

Marc-145和PRRSV 經(jīng)典毒株BJ-4均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。胎牛血清（FBS）、0.25%-EDTA 胰酶、DMEM 培養(yǎng)基均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；24 孔板、一次性培養(yǎng)瓶購(gòu)自Thermo Fisher 公司；TRIzol、SuperScript ⅡReverse Transcriptase 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit 試劑購(gòu)自Illumina 公司；Agencourt AMPure XP 試劑購(gòu)自Beckman Coulter 公司；Qubit RNA Assay Kit 和Qubit dsDNA Assay Kit 購(gòu)自Life Technologies 公司；Bioanalyzer 2100 RNA-6000 Nano Kit 和Bioanalyzer 2100 DNA-1000 Kit購(gòu)自Aglient公司。

1.2 樣品制備

將Marc-145 細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，分為2 組，一組為未接種PRRSV 的MARC-145 細(xì)胞的對(duì)照組，另一組為PRRSV 經(jīng)典毒株BJ-4 感染12 h的試驗(yàn)組（MOI=1）。每組3 個(gè)重復(fù)，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 總RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè)

利用TRIzol 試劑提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA 降解和污染情況。分別用Nanodrop、Qubit 和Agilent 2100 檢測(cè)總RNA 的純度（OD260/280）、質(zhì)量濃度和RNA 完整值（RNA integrity number，RIN）。

1.4 文庫(kù)制備

樣品檢測(cè)合格后，以總RNA 為起始樣品建立cDNA 文庫(kù)。使用DNase 消化初始樣品中的DNA后，用帶有Oligo dT 的磁珠富集mRNA，加入打斷試劑，將mRNA 打斷成的短片段作為模板，用隨機(jī)引物合成單鏈cDNA，然后配制雙鏈合成反應(yīng)體系合成雙鏈cDNA，并使用試劑盒純化雙鏈cDNA；將純化后的雙鏈cDNA 進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾、連接測(cè)序接頭、片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到cDNA文庫(kù)。將構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqTM2500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.5 raw reads質(zhì)控、序列比對(duì)與轉(zhuǎn)錄本拼接

對(duì)測(cè)序得到的raw reads 進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，去除掉raw reads 中的少量帶有測(cè)序接頭、poly-N 以及測(cè)序質(zhì)量較低的reads，并對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤率檢查后得到后續(xù)分析使用的clean reads。用TopHat 2 軟件對(duì)clean reads 進(jìn)行參考基因組的比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)其可以mapping 到參考基因組的有效數(shù)據(jù)。使用HTSeq 軟件對(duì)該物種每個(gè)樣品進(jìn)行已知類型基因的定量分析，根據(jù)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，得到樣品中各類型基因的表達(dá)情況。利用TopHat 2 軟件比對(duì)的結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的拼接，可得到盡可能小的轉(zhuǎn)錄本集合，并對(duì)轉(zhuǎn)錄本定量分析。另外，還針對(duì)鏈特異性文庫(kù)有特定的參數(shù)，可準(zhǔn)確提供轉(zhuǎn)錄本鏈方向信息。

1.6 lncRNA和mRNA的篩選

lncRNA 是通過(guò)外顯子篩選、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度篩選、數(shù)據(jù)庫(kù)已知轉(zhuǎn)錄本篩選、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量篩選、編碼潛能預(yù)測(cè)等篩選得到，并將最終篩選到的lncRNA用于后續(xù)分析。

對(duì)lncRNA 的特征進(jìn)行分析，將lncRNA 與mRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度、外顯子（Exon）個(gè)數(shù)以及開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度對(duì)比，以此驗(yàn)證是否符合lncRNA的一般特征。

mRNA 是通過(guò)轉(zhuǎn)錄本外顯子個(gè)數(shù)篩選、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度篩選、轉(zhuǎn)錄本已知注釋篩選以及編碼潛能篩選等篩選得到，并將篩選出的mRNA用于后續(xù)分析。

1.7 差異表達(dá)lncRNA（DElncRNA）和差異表達(dá)RNA（DEG）的分析及DEG功能分析

使用Cuffdiff 軟件將篩選到的lncRNA 和mRNA進(jìn)行定量分析，得到各樣本轉(zhuǎn)錄本的FPKM信息，以此估算基因表達(dá)水平。

基于lncRNA 和mRNA 的測(cè)序結(jié)果，以q-value<0.05 和|Fold change|>1.5 為顯著性差異篩選條件進(jìn)行差異表達(dá)分析。將顯著差異的mRNA 進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，GO 富集分析方法為GOseq，此方法 基 于 Wallenius non-central hyper-geometric distribution。

1.8 DElncRNA靶基因的預(yù)測(cè)及功能分析

將篩選到的顯著差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行共表達(dá)預(yù)測(cè)mRNA，并將lncRNA 共表達(dá)mRNA 進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.9 DElncRNA靶基因和DEG的關(guān)聯(lián)分析

在lncRNA共表達(dá)mRNA的KEGG富集分析中，以相關(guān)性排名前30通路中的mRNA 為篩選數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出顯著差異表達(dá)的mRNA，將其與關(guān)聯(lián)的lncRNA 作為數(shù)據(jù)來(lái)源，使用Cytoscape 軟件構(gòu)建lncRNA和mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-seq測(cè)序樣品的總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

選取PRRSV 感染12 h 后的Marc-145 細(xì)胞為試驗(yàn)組（標(biāo)記為M12_1、M12_2、M12_3），未經(jīng)PRRSV感染的Marc-145 細(xì)胞為對(duì)照組（標(biāo)記為M0_1、M0_2、M0_3）。提取6 組細(xì)胞的總RNA，利用Agilent 2100生物分析儀精準(zhǔn)檢測(cè)RIN評(píng)分，分別為9.9、9.5、9.7、10、9.8 和9.8。6 組樣品RNA 的純度、質(zhì)量濃度和RIN 評(píng)分表明，提取的RNA 質(zhì)量好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序和lncRNA鑒定

利用Illumina HiSeqTM2500平臺(tái)對(duì)6組樣品進(jìn)行測(cè)序。從113 598 015.7 個(gè)raw reads 中獲得106 397 660.7（93.66%）個(gè)clean reads。采用TopHat 2軟件對(duì)clean reads進(jìn)行參考基因組的比對(duì)分析。

使用Cuffdiff工具將拼接的轉(zhuǎn)錄本合并，得到本次測(cè)序完整的轉(zhuǎn)錄組信息，再將轉(zhuǎn)錄本集合進(jìn)行l(wèi)ncRNA 的鑒定與篩選，經(jīng)過(guò)5 個(gè)步驟的過(guò)濾，得到824 個(gè)已注釋lncRNA 和419 個(gè)新lncRNA，所有l(wèi)ncRNA 具有相似的ORF 長(zhǎng)度和外顯子數(shù)量。與mRNA 相比，lncRNA 轉(zhuǎn)錄本較短，外顯子數(shù)量較少，ORF較短，并且表達(dá)水平較低（圖1）。

圖1 lncRNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄本分布（A）、外顯子數(shù)量（B）和ORF長(zhǎng)度（C）Fig.1 Transcript distribution（A），number of exons（B）and ORF length（C）of lncRNAs and mRNAs

2.3 基于RNA-seq的lncRNA差異表達(dá)分析和功能分析

以q-value<0.05 和|Fold change|>1.5 為顯著性差異篩選條件對(duì)PRRSV感染組和對(duì)照組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，共有39 個(gè)差異lncRNA，其中19 個(gè)上調(diào)，20 個(gè)下調(diào)（圖2A）。對(duì)差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行分層聚類分析，熱圖顯示，與對(duì)照組中相比，PRRSV 感染組存在明顯的自分離簇（圖2B）。

為更好了解PRRSV 感染組與對(duì)照組中差異的lncRNA 的生物學(xué)功能，對(duì)lncRNA 共表達(dá)靶基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO 分析結(jié)果顯示，PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞中，與lncRNA 共表達(dá)的mRNA 在生物學(xué)過(guò)程（Biological process，BP）中主要與細(xì)胞代謝過(guò)程（Cellular metabolic process）和細(xì)胞含氮化合物代謝過(guò)程（Cellular nitrogen compound metabolic process）有關(guān)，在分子功能（Molecular function，MF）上主要與蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）和細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合（Cytoskeletal protein binding）有關(guān)（圖2C）。

以q-value<0.05 為KEGG 富集分析條件，結(jié)果顯示，PRRSV 感染組的lncRNA 共表達(dá)基因主要富集在MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、胰島素信號(hào)通路（Insulin signaling pathway）、碳代謝（Carbon metabolism）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF?1 signaling pathway）和子宮內(nèi)膜癌（Endometrial cancer）（圖2D）。富集結(jié)果提示，PRRSV 可能通過(guò)lncRNA 調(diào)控靶基因的碳氮代謝或者M(jìn)APK 信號(hào)通路等營(yíng)造宿主病毒的互作環(huán)境，這對(duì)深入解析lncRNA與PRRSV的關(guān)系有重要作用。

圖2 基于RNA-seq的lncRNA的差異表達(dá)分析和lncRNA共表達(dá)mRNA的功能分析Fig.2 Differential expression analysis of lncRNAs and functional analysis of lncRNAs co-expressed mRNAs based on RNA-seq

2.4 基于RNA-seq的mRNA差異表達(dá)分析和功能分析

以q-value<0.05 與|Fold change|>1.5 為顯著性差異篩選條件對(duì)PRRSV感染組和對(duì)照組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，共有1 320 個(gè)差異表達(dá)mRNA，其中552個(gè)上調(diào)，768 個(gè)下調(diào)（圖3A）。對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，PRRSV 感染組與對(duì)照組中存在明顯差異（圖3B）。

為了更好地了解PRRSV 感染組與對(duì)照組之間差異表達(dá)mRNA 的生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PRRSV 感染組差異顯著的mRNA 在分子功能上主要與氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）、醌或類似化合物受體（Quinone or similar compound as acceptor）有關(guān)；在細(xì)胞組分（Cellular component，CC）上主要與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器（Intracellular membrane?bounded organelle）和膜結(jié)合細(xì)胞器（Membrane?bounded organelle）有關(guān)；在生物學(xué)過(guò)程上主要與細(xì)胞對(duì)壓力的反應(yīng)（Cellular response to stress）、DNA 修復(fù)（DNA repair）、自噬（Autophagy）、對(duì)DNA 損傷刺激的反應(yīng)（Response to DNA damage stimulus）、細(xì)胞含氮化合物代謝過(guò)程和有機(jī)環(huán)狀化合物代謝過(guò)程（Organic cyclic compound metabolic process）有關(guān)（圖3C）。

以q-value<0.05 為KEGG 富集分析條件，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PRRSV 感染組差異顯著的mRNA 主要富集在氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、亨廷頓?。℉untington’s disease）、帕金森?。≒arkinson’s disease）、非酒精性脂肪肝（Non?alcoholic fatty liver disease）、蛋白酶體（Proteasome）和碳代謝（圖3D）。GO 富集結(jié)果提示，PRRSV 感染引起宿主細(xì)胞死亡與修復(fù)等應(yīng)激反應(yīng)；KEGG 富集結(jié)果提示，差異顯著的基因與能量代謝通路和疾病信號(hào)通路有關(guān)，這些疾病的臨床表征與PRRS 癥狀相似。因此，以能量代謝通路和疾病信號(hào)通路相關(guān)的基因?yàn)檠芯繉?duì)象，有利于進(jìn)一步研究PRRSV的致病機(jī)制。

圖3 基于RNA-seq的mRNA的差異表達(dá)分析和功能分析Fig.3 Differential expression analysis and functional analysis of mRNAs based on RNA-seq

2.5 基于RNA-seq的DEG和DElncRNA靶標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

為了解差異表達(dá)lncRNA 的調(diào)控功能，對(duì)差異的lncRNA 共表達(dá)mRNA 進(jìn)行預(yù)測(cè)和KEGG 功能分析，以rich factor、q-value 和富集基因數(shù)量為篩選條件，篩選出富集最顯著的30條pathway條目，結(jié)果顯示，與lncRNA共表達(dá)mRNA大部分富集在MAPK信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、胰島素信號(hào)通路、碳代謝、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路（Neurotrophin signaling pathway）、AMPK 信號(hào)通路（AMPK signaling pathway）、HIF-1 信號(hào)通路和前列腺癌（Prostate cancer）等。為了闡明PRRSV 感染組lncRNA 與mRNA 的關(guān)系，使用Cytoscape 軟件構(gòu)建差異顯著的lncRNA 和lncRNA 共表達(dá)mRNA 中富集最顯著的30 條pathway 條目的交互網(wǎng)絡(luò)（圖4）。結(jié)果顯示，1個(gè)lncRNA 可以對(duì)應(yīng)不同的靶點(diǎn)，如XR_497637.1靶向超氧化物歧化酶1（SOD1）和熱休克因子1（HSPB1）等，lncRNA XR_500765.1 靶向FOS，XR_494665.1靶向Jun等。

圖4 基于RNA-seq的DEG和DElncRNA靶標(biāo)的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Association network of DEGs and DElncRNAs targets based on RNA-seq

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)未感染和PRRSV 感染12 h 的Marc-145 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 高通量測(cè)序，揭示lncRNA 及其共表達(dá)的靶標(biāo)可能在PRRSV 感染初期發(fā)揮的重要作用。經(jīng)生物信息學(xué)分析，共有39個(gè)差異lncRNA 和1 320 個(gè)差異mRNA。為了解這些lncRNA 的調(diào)控功能，對(duì)差異的lncRNA 共表達(dá)的mRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA共表達(dá)的mRNA 主要富集在MAPK 信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路等。其中，HSPB1、Jun、FOS、SOD1等基因與PRRSV感染相關(guān)。

本研究中，與對(duì)照組相比，PRRSV 感染組lncRNA XR_500765.1 和XR_494665.1 的表達(dá)量均上調(diào)，同時(shí)預(yù)測(cè)其共表達(dá)的靶基因FOS和Jun的表達(dá)量也升高。通過(guò)KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)FOS和Jun均參與MAPK 信號(hào)通路。MAPK 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，與發(fā)育異常、腫瘤形成、癌癥發(fā)生、自身免疫性疾病等有關(guān)[18]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（Extracellular signal?regulated kinase 1/2，ERK1/2）屬于絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen?activated protein kinase，MAPK）家族，其過(guò)度激活是癌癥發(fā)展的一個(gè)主要因素。ERK1/2可將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)各種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性，如原癌基因FOS、Jun、Myc以及含ETS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)Elk-1和cAMP依賴性轉(zhuǎn)錄因子ATF2[19]，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、耐藥和轉(zhuǎn)移的癌表型[20]，最終影響細(xì)胞的特定生物學(xué)效應(yīng)。這提示PRRSV 感染機(jī)體后可能通過(guò)XR_500765.1和XR_494665.1促進(jìn)FOS和Jun表達(dá)。研究表明，F(xiàn)OS 和Jun 可激活核轉(zhuǎn)錄因子AP-1 的轉(zhuǎn)錄[21]，從而進(jìn)一步激活核基因的表達(dá)，以應(yīng)對(duì)病毒的入侵。有研究報(bào)道，PRRSV 感染后也參與MyD88-ERK1/2-AP-1 信號(hào)通路[22]，這提示FOS和Jun在PRRSV 感染初期在MAPK 信號(hào)通路中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

PRRSV 感染可引起動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。研究表明，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和SOD 在生物體氧化與抗氧化平衡中起重要作用[24]。本研究中，PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞后，lncRNA XR_497637.1 表達(dá)量下調(diào)，預(yù)測(cè)其共表達(dá)的靶標(biāo)SOD1的表達(dá)量降低，推測(cè)lncRNA 可能作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（ceRNA）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而調(diào)控miRNA 的靶標(biāo)，導(dǎo)致SOD1表達(dá)下調(diào)，這可能進(jìn)一步影響PRRSV的復(fù)制。ROS尤其是超氧化物的產(chǎn)生，是殺死入侵病原體的重要宿主防御機(jī)制，抗氧化劑SOD 含量降低可能會(huì)抑制機(jī)體對(duì)病毒感染產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)的作用。但也有報(bào)道病毒感染引起機(jī)體免疫過(guò)度，ROS 大量表達(dá)造成免疫損傷，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，從而引起病毒復(fù)制能力增強(qiáng)[25]。LEE 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV 感染Marc-145 細(xì) 胞 后 ，ROS 含 量 增 加 ；CHARERNTANTANAKUL等[27]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV 感染PAM 12 h 后，PAM 中O2-·和H2O2含量增加。這與本研究中PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞后預(yù)測(cè)lncRNA XR_497637.1 共表達(dá)的SOD1表達(dá)下調(diào)一致。XU 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，lncRNASNHG14表達(dá)量上調(diào)后，通過(guò)結(jié)合miRNA-217，直接靶向上調(diào)IGF1R和KLF5表達(dá)量，以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。前人研究表明，lncRNACTC-497E21.4 與miR-22 競(jìng)爭(zhēng)以調(diào)節(jié)NET1的表達(dá)，并通過(guò)RhoA 信號(hào)通路調(diào)節(jié)胃癌的惡性進(jìn)展[29]。LNC00689 直接與miR-338-3p 相互作用促進(jìn)丙酮酸激酶M2（PKM2）的表達(dá)，發(fā)揮ceRNA 的作用[30]。這與本研究中l(wèi)ncRNA XR_497637.1 可能作為ceRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，導(dǎo)致SOD1表達(dá)量下調(diào)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。本研究中，PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞12 h 后lncRNA XR_497637.1 表達(dá)下調(diào)，預(yù)測(cè)其共表達(dá)的HSPB1的表達(dá)量下調(diào)。

綜上，本研究對(duì)差異表達(dá)的lncRNA 和mRNA進(jìn)行功能分析，以及差異表達(dá)的lncRNA 與mRNA聯(lián)合分析，篩選出PRRSV 感染中潛在的候選lncRNA 和靶基因，如lncRNA XR 靶向500765.1 靶向FOS、XR_494665.1 靶向Jun、XR_497637.1 靶向SOD1、HSPB1。下一步可以對(duì)這些lncRNA 和靶基因進(jìn)行缺失和過(guò)表達(dá)的功能研究，以便進(jìn)一步了解lncRNA 在PRRSV感染宿主中的作用，為PRRS的治療提供新的研究思路。