超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定白酒中乙基麥芽酚

陳永發(fā)，王 遠(yuǎn)，張金磊，鞏婧婷

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測(cè)試中心，新疆石河子 832000）

乙基麥芽酚（Ethyl maltol），學(xué)名為2 -乙基-3 - 羥基- 4 -吡喃酮，其分子式為C7H8O3[1]，是國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)在2015 年5 月實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》 （GB 2760—2014）[2]中規(guī)定允許食品生產(chǎn)企業(yè)在食品中添加使用的增香劑。在熱水、甲醇及甘油等試劑中溶解度較高。由于具有濃郁的焦糖味和水果味，可在不同類型食品中起到改善口感與增強(qiáng)香味的效果，所以目前乙基麥芽酚在食品行業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用很普遍，如在酒類、果蔬汁、飲料等中適量添加，能明顯改善產(chǎn)品的香氣及口感[3]。但是，乙基麥芽酚并非天然的增香物，是由淀粉發(fā)酵得到曲酸，再經(jīng)一系列加工而得的發(fā)酵增香物。研究表明，食用添加過量乙基麥芽酚的食品，對(duì)人體健康存在一定危害，尤其是對(duì)人體的肝臟危害較大，嚴(yán)重時(shí)甚至可能出現(xiàn)呼吸困難、嘔吐等癥狀，對(duì)人體的危害程度較大[4]。因此，在食品中添加乙基麥芽酚含量的大小是評(píng)價(jià)食品安全性的一個(gè)重要指標(biāo)。

目前，分析測(cè)定乙基麥芽酚含量的主要方法有電化學(xué)法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、離子色譜方法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光法、拉曼光譜法、氣相色譜法、分光光度法、液相色譜法[5-11]等。其可以添加的基質(zhì)有食用植物油、酒類、肉制品、面包、糕點(diǎn)、果凍、飲料、煙草、糖果、餅干、乳粉[12]等。然而，目前針對(duì)白酒中乙基麥芽酚含量檢測(cè)方法較少。試驗(yàn)擬通過對(duì)儀器參數(shù)及前處理優(yōu)化，建立快速、簡(jiǎn)單的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定白酒中乙基麥芽酚的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲醇、乙腈、甲酸（HPLC 級(jí)），德國(guó)CNW 公司提供；乙基麥芽酚（純度＞99.0 %），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司提供；白酒，購(gòu)自新疆市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

AB SCIEX QTRAP 5500+ 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)AB 公司產(chǎn)品；MS3 basic 型漩渦混合器，德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品；KQ-600DE 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；IQ7000 型超純水儀，美國(guó)Milli-Q 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg） 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃條件下避光保存，有效期6 個(gè)月。準(zhǔn)確移取0.10 mL 質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，置于-20 ℃條件下避光保存，有效期1 個(gè)月。

1.3.2 樣品前處理

稱取經(jīng)超聲5 min 后的白酒10 g（精確至0.01 g）于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻線，漩渦1 min，混勻，過0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，供UPLC-MS/MS法測(cè)定。

1.3.3 UPLC-MS/MS 分析

色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫25 ℃，流動(dòng)相組成：0.1 %甲酸水-甲醇（梯度），進(jìn)樣量5 μL，流速0.3 mL/min，梯度洗脫。

以0.1%甲酸水-甲醇為流動(dòng)相的梯度洗脫程序見表1。

表1 以0.1%甲酸水-甲醇為流動(dòng)相的梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源類型：ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式：MRM，IS 電壓5 500 V，源溫度500 ℃，霧化氣GS1 50 ℃，氣簾氣CUR 35 psi，輔助氣50 psi，碰撞氣CAD 8 psi。

乙基麥芽酚的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 乙基麥芽酚的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

分別取適量10 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)中間液于容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的乙基麥芽酚系列工作液，用0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X） 為橫坐標(biāo)、峰面積（Y） 為縱坐標(biāo)，采用外標(biāo)法建立乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3 倍噪音計(jì)算出檢出限，以10 倍噪音計(jì)算出定量限。

1.3.5 回收率和精密度

在不含乙基麥芽酚的白酒樣品中添加3 個(gè)水平標(biāo)準(zhǔn)液（5，25，50 μg/kg），按照1.3.2 節(jié)方法處理樣品，在1.3.3 節(jié)儀器條件下對(duì)處理好的樣品進(jìn)行測(cè)定，對(duì)添加不同水平的樣品進(jìn)行6 次平行試驗(yàn)。計(jì)算加標(biāo)回收率考查其準(zhǔn)確性，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 考查其精密度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)通過Microsoft Excel 2016 軟件對(duì)3 次重復(fù)試驗(yàn)得到的試驗(yàn)結(jié)果平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在電噴霧電離和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)質(zhì)量濃度為100 ng/mL 的乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行多次注射進(jìn)樣，通過對(duì)去簇電壓和碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，選擇穩(wěn)定性好、離子豐度比高和干擾較小的2 個(gè)碎片離子分別作為乙基麥芽酚的定量離子和定性離子，并通過比較2 個(gè)離子對(duì)的響應(yīng)值大小，選擇響應(yīng)值較高的作為定量離子對(duì)。

乙基麥芽酚的MRM 離子對(duì)質(zhì)譜圖見圖1。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

不同流動(dòng)相體系對(duì)乙基麥芽酚的影響見圖2。

圖2 不同流動(dòng)相體系對(duì)乙基麥芽酚的影響

通過比較0.1%甲酸水溶液-甲醇，水-甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈3 種流動(dòng)相體系對(duì)同一質(zhì)譜參數(shù)下乙基麥芽酚峰形的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（圖2（b））和水-甲醇（圖2（c）） 體系時(shí)，乙基麥芽酚洗脫效果不佳，峰形較寬且對(duì)稱性差，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性；當(dāng)流動(dòng)相為0.1 %甲酸水溶液- 甲醇（圖2（a）） 時(shí)，乙基麥芽酚的峰形尖銳且對(duì)稱性好。因此選擇0.1%甲酸水-甲醇體系作為檢測(cè)白酒中乙基麥芽酚的流動(dòng)相。

2.1.3 色譜柱溫度的優(yōu)化

色譜柱溫度是影響化合物峰型和響應(yīng)值的重要因素之一，試驗(yàn)考查了不同溫度變化對(duì)乙基麥芽酚響應(yīng)值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)色譜柱溫度為25 ℃時(shí)，乙基麥芽酚的響應(yīng)較高。因此試驗(yàn)選25 ℃作為檢測(cè)白酒中乙基麥芽酚的色譜柱溫度。

不同色譜柱溫度對(duì)乙基麥芽酚響應(yīng)值的影響見表3。

表3 不同色譜柱溫度對(duì)乙基麥芽酚響應(yīng)值的影響

2.2 線性關(guān)系、檢出限及定量限

乙基麥芽酚的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表4。

表4 乙基麥芽酚的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

由表4 可知，在0.5~10.0 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，乙基麥芽酚呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 2。檢出限為2.5 μg/kg，定量限為5 μg/kg。與郭建博等人[13]建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定調(diào)味醬中乙基麥芽酚含量的檢出限和定量限（檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.04 mg/kg） 相比有明顯提高。

2.3 回收率及精密度

乙基麥芽酚的回收率和精密度見表5。

表5 乙基麥芽酚的回收率和精密度

由表5 可知，在白酒中添加乙基麥芽酚的回收率范圍為95.4%~102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 的范圍為1.0%~1.6%。表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足白酒中乙基麥芽酚的檢測(cè)要求。

乙基麥芽酚的MRM 譜圖見圖3。

圖3 乙基麥芽酚的MRM 譜圖

3 結(jié)論

采用BEH C18色譜柱分離，通過優(yōu)化液相和質(zhì)譜條件，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定白酒中乙基麥芽酚含量。方法學(xué)驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果表明，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確性好、靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，適用于白酒中乙基麥芽酚的快速測(cè)定，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)白酒中乙基麥芽酚含量的檢測(cè)方法制定提供參考依據(jù)。