高效液相色譜法測(cè)定苦丁茶中孔雀石綠殘留量

范志平，陳紅霞，兌靖冬，范子瑋，張娟娟，謝 勇，聶 立

（1. 宜賓市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川宜賓 644600；2. 四川省藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644600；3. 銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

0 引言

苦丁茶屬于冬青科冬青屬植物，又稱(chēng)茶丁、富丁茶、皋盧茶等。主要分布在我國(guó)西南地區(qū)及華南地區(qū)。其成品茶清香有苦味，具有清熱消暑、生津止渴、健胃消積、預(yù)防炎癥等保健功能，目前苦丁茶已成為人們?nèi)粘Ｉ钪械囊环N天然植物飲料[1-8]。

孔雀石綠別名孔雀綠、堿基綠，是一種三苯甲烷類(lèi)綠色染料，曾用于制陶、印染、皮革、生物染色等方面，由于其具有有效的殺菌效果，曾被用來(lái)預(yù)防和治療水產(chǎn)品真菌或細(xì)菌感染，但對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生極大的危害性，具有致癌、致畸和致突變的作用，同時(shí)孔雀石綠在水產(chǎn)品物內(nèi)可代謝為隱色孔雀石綠，其毒性更大[9-16]。鑒于此，許多國(guó)家已經(jīng)將孔雀石綠及其代謝物列為水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥物，我國(guó)在2019 年發(fā)布《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250 號(hào)》明確規(guī)定，孔雀石綠屬于食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物[17-18]。目前，國(guó)家現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于孔雀石綠分析檢測(cè)的品種主要有養(yǎng)殖水體、水產(chǎn)品、飼料和淀粉制品[19-27]。

近年來(lái)，在市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)送檢的苦丁茶中發(fā)現(xiàn)有不法人員使用孔雀石綠對(duì)其進(jìn)行染色，使其顏色更加鮮綠誘人，以謀取不法利益。但目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)都沒(méi)有高效液相色譜法測(cè)定苦丁茶中孔雀石綠及其代謝物，因此需要建立一種準(zhǔn)確度好、靈敏度高的方法測(cè)定苦丁茶中的孔雀石綠及其代謝物的含量，可以更好地為市場(chǎng)品監(jiān)管部門(mén)嚴(yán)厲打擊苦丁茶中非法添加孔雀石綠提供有利的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（配備四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、配紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器），美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；電子天平，METTLER TOLEDO；渦旋振蕩器，MX-S SciloGEX；高速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司產(chǎn)品；TSC-II 型氮吹儀，廣州泰思科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；pH 計(jì)（PHSJ-4A），上海雷磁產(chǎn)品。

固相萃取柱：MCX 陽(yáng)離子交換柱，60 mg/3 mL；孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL，1.0 mL）、隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL，1.0 mL），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所提供。

樣品為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的苦丁茶，將樣品混勻后用料理機(jī)粉碎，過(guò)20 目篩，密封，作為試樣。陰性樣品為市售樣品中篩選出不含待測(cè)組分的試樣；陽(yáng)性樣品為市售樣品中篩選出含待測(cè)組分的試樣。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（孔雀石綠1 μg/mL；隱色孔雀石綠3 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10 mL、隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.30 mL 置于同一個(gè)10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，-18 ℃下避光保存。

混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：稱(chēng)取5 份均質(zhì)混勻的空白基質(zhì)各2 g（精確至0.001 g） 置于50 mL 具塞塑料離心管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液30，60，120，240，360，600 μL，加入10 mL 2%乙酸水溶液，渦旋混勻，浸泡30 min，余下操作同樣品處理。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g（精確至0.001 g） 試樣置于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL 2%乙酸水溶液，渦旋混勻，浸泡30 min。加入10 mL 2%乙酸乙腈溶液，混勻，于渦旋振蕩器上渦旋1 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心4 min，取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，重復(fù)上述操作提取2 次，提取液置同一容量瓶中，用2%乙酸乙腈溶液定容至刻度，搖勻，準(zhǔn)確吸取10 mL 置于玻璃氮吹管中，于45 ℃下氮吹至約2 mL，待凈化。

凈化：將上述溶液以低于1.0 mL/min 的流速加載在固相萃取小柱上，再依次用2 mL 水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL 甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液，真空抽干2 min，用3 mL 5%氨水甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液至玻璃氮吹管。洗脫液在45 ℃下氮?dú)饬鞔蹈?，加? mL 2%乙酸乙腈溶液溶解殘?jiān)?，樣液過(guò)0.22 μm 濾膜后，供液相色譜儀測(cè)定。

1.4 液相色譜分析條件

液相色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 色譜柱；柱后氧化柱規(guī)格35 mm×4.6 mm，填料類(lèi)型為硅藻土∶二氧化鉛=3∶1。

流動(dòng)相：(A)20 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 值4.5），(B)乙腈，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量50 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)618 nm。

梯度洗脫參考條件見(jiàn)1。

表1 梯度洗脫參考條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取是否加水浸泡的優(yōu)化

考慮到孔雀石綠與隱色孔雀石綠均為弱堿性化合物，為了提高待測(cè)組分的提取效率，試樣初步采用含酸乙腈溶液提取。試驗(yàn)考查了不加水浸泡2%乙酸乙腈提取、加水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取、加入2%乙酸水浸泡后再用純乙腈提取，以及加入2%乙酸水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取4 種方式浸泡陽(yáng)性樣品。

樣品提取是否加水浸泡的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 樣品提取是否加水浸泡的優(yōu)化結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，先將樣品加入2%乙酸水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取，測(cè)得樣品待測(cè)組分含量最高。分析原因，其一由于干茶葉粉末對(duì)待測(cè)組分有一定的吸附性，在用2%乙酸乙腈提取前先用乙酸水溶液浸泡，減小了茶葉的吸附性，從而提高了提取效率；其二，孔雀石綠及隱色孔雀石綠呈弱堿性，在水和乙腈中加入一定量的乙酸有利于孔雀石綠的溶出。因此，選擇先用2%乙酸水浸泡，再用2%乙酸乙腈提取。

2.2 加2%乙酸水溶液浸泡時(shí)間的優(yōu)化

試驗(yàn)考查了加2%乙酸水浸泡0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 h 及浸泡過(guò)夜7 種浸泡時(shí)間對(duì)待測(cè)組分測(cè)定結(jié)果的影響。

不同浸泡時(shí)間對(duì)待測(cè)組分含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同浸泡時(shí)間對(duì)待測(cè)組分含量的影響

結(jié)果表明，浸泡時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)孔雀石綠和隱色孔雀石綠的測(cè)定幾乎無(wú)影響，為節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)又保證待測(cè)組分的溶出，加2%乙酸水溶液浸泡的時(shí)間選擇0.5 h。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

由于孔雀石綠與隱色孔雀石綠均為弱堿性，考慮在提取溶劑乙腈中加入適量有機(jī)酸使提取液呈弱酸性，更利于孔雀石綠和隱色孔雀石綠的溶出。通過(guò)試驗(yàn)比較純乙腈溶液，0.1%甲酸乙腈，0.2%甲酸乙腈，0.5%甲酸乙腈，1%甲酸乙腈，、0.2%乙酸乙腈，0.5%乙酸乙腈，1%乙酸乙腈，2%乙酸乙腈9 種提取溶劑。

不同提取溶劑對(duì)待測(cè)組分含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同提取溶劑對(duì)待測(cè)組分含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，甲酸乙腈溶液提取時(shí)，待測(cè)組分峰形較差，乙酸乙腈溶液提取時(shí)，待測(cè)組分峰形較好，且乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 時(shí)，測(cè)得陽(yáng)性樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的含量都較高。因此，選擇2%乙酸乙腈溶液作為提取溶劑。

2.4 提取方式的優(yōu)化

試驗(yàn)考查了均質(zhì)1 min、超聲30 min、渦旋提取1 min 和加入均質(zhì)子渦旋1 min 4 種提取方式。

不同提取方式對(duì)待測(cè)組分含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同提取方式對(duì)待測(cè)組分含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，4 種提取方式對(duì)孔雀石綠和隱色孔雀石綠的測(cè)定幾乎無(wú)影響，為節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間且考慮操作簡(jiǎn)單，選擇渦旋1 min 的提取方式。

2.5 渦旋時(shí)間的優(yōu)化

試驗(yàn)考查了0，15，30，60，90，120 s 6 種渦旋時(shí)間的提取效果。

不同渦旋時(shí)間對(duì)待測(cè)組分含量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同渦旋時(shí)間對(duì)待測(cè)組分含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，渦旋時(shí)間達(dá)到30 s 以上時(shí)，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的含量幾乎無(wú)明顯差異，為節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)又保證待測(cè)組分的充分溶出，試驗(yàn)選擇渦旋時(shí)間1 min。

2.6 流動(dòng)相的選擇

考查了乙腈作為有機(jī)相，不同濃度的乙酸銨溶液（20，40，60，80，100 mmol/L） 作為水相時(shí)，對(duì)待側(cè)化合物峰形及靈敏度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈作為有機(jī)相，20 mmol/L 乙酸銨溶液作為水相時(shí)，各待測(cè)化合物響應(yīng)好、靈敏度高、峰形好，隨著乙酸銨濃度的增加，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的峰形變差，響應(yīng)變小， 故采用乙腈-20 mmol/L 乙酸銨溶液作為流動(dòng)相。試驗(yàn)考查了不同pH 值的乙酸銨溶液（pH 值3.5，pH 值4.5，pH 值5.5，pH 值7.5） 對(duì)待測(cè)化合物的影響，結(jié)果表明，水相具有一定酸性可有效改善各待測(cè)化合物的峰形，提高分離度，以及提高待測(cè)化合物的響應(yīng)。當(dāng)乙酸銨溶液的pH 值為4.5 時(shí)，各待測(cè)化合物的峰形好、靈敏度高、響應(yīng)好。因此，采用乙腈-20 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 值4.5） 作為流動(dòng)相。

2.7 采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量的必要性

以苦丁茶為基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g 粉碎后陰性樣品，添加孔雀石綠和隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，制成孔雀石綠添加水平為15，30，150 μg/kg的樣品各6 份，隱色孔雀石綠添加水平為45，90，450 μg/kg 的樣品各6 份，按12.3 方法，分別采用裸標(biāo)和空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液2 種定量方式進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)；由表2 可知，孔雀石綠采用裸標(biāo)定量方式的3 種添加水平的平均回收率均偏低，而隱色孔雀石綠采用裸標(biāo)定量方式的3 種添加水平的平均回收率均偏高，不滿足食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法編制技術(shù)的要求；由表3 可知，孔雀石綠采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量方式，3 種添加水平的平均回收率為96.7%～111.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～4.6%，隱色孔雀石綠采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量方式，3 種添加水平的平均回收率為99.7%～103.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～5.8%，均滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》規(guī)定。綜上所述，選取空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量的方式。

孔雀石綠及隱色孔雀石綠采用裸標(biāo)定量方式的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） （n=6） 見(jiàn)表2，孔雀石綠及隱色孔雀石綠采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量方式的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6） 見(jiàn)表3。

表2 孔雀石綠及隱色孔雀石綠采用裸標(biāo)定量方式的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） （n=6）

表3 孔雀石綠及隱色孔雀石綠采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量方式的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） （n=6）

2.8 方法的線性范圍

取孔雀石綠質(zhì)量濃度為3，6，12，24，36，60 ng/mL 的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和隱色孔雀石綠質(zhì)量濃度為9，18，36，72，108，180 ng/mL 的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在已優(yōu)化的色譜條件下，以峰面積比（Y） 對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度比（X） 作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖6），并計(jì)算各待測(cè)物線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，孔雀石綠和隱色孔雀石綠線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均在0.990 以上，分別對(duì)苦丁茶中添加孔雀石綠5 μg/kg 和隱色孔雀石綠15 μg/kg 時(shí)，信噪比均大于10，因此最終確定該方法的定量限：孔雀石綠5 μg/kg 和隱色孔雀石綠15 μg/kg。

孔雀石綠和隱色孔雀石綠的基質(zhì)加標(biāo)工作液液相色譜圖見(jiàn)圖6，孔雀石綠和隱色孔雀石綠在基質(zhì)中的保留時(shí)間和線性關(guān)系見(jiàn)表4。

圖6 孔雀石綠和隱色孔雀石綠的基質(zhì)加標(biāo)工作液液相色譜圖

表4 孔雀石綠和隱色孔雀石綠在基質(zhì)中的保留時(shí)間和線性關(guān)系

2.9 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用該方法對(duì)從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的苦丁茶共計(jì)13 批次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 份苦丁茶樣品中檢出孔雀石綠殘留。

實(shí)際樣品測(cè)定情況見(jiàn)表5。

表5 實(shí)際樣品測(cè)定情況

3 結(jié)論

采用高效液相色譜技術(shù)建立了苦丁茶中孔雀石綠及其代謝物的測(cè)定方法，方法對(duì)提取溶劑、提取方式及液相色譜條件進(jìn)行了研究。方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能夠符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》規(guī)定，可有效為食品安全監(jiān)管提供更有力的技術(shù)支撐。