無(wú)果枸杞葉茯茶加工過(guò)程中活性成分及體外抗氧化作用

段 潔，孫 敏，邊文文，劉 靜，曾 橋，趙文強(qiáng)，余鄭綠，谷文軍，劉國(guó)祥

（1. 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048；2. 陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西西安 710021；3. 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；4. 陜西樸道茶業(yè)股份有限公司，陜西 西安 713700；5. 寧夏童子茶科技有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755100）

枸杞屬茄科落葉灌木植物[1]，寧夏枸杞是中國(guó)枸杞屬植物中唯一被載入《中國(guó)藥典》的品種，常于夏、秋二季果實(shí)呈紅色時(shí)采收，經(jīng)干燥后入藥，其性味甘，平，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的作用，常用于治療虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目昏不明等[2]。無(wú)果枸杞是寧夏枸杞與野生枸杞嫁接培育的新品種，現(xiàn)有研究表明，無(wú)果枸杞的芽和葉含有豐富的多酚、多糖、黃酮及氨基酸等活性成分[3]，其含量隨季節(jié)不同而有較大差異，由于不開(kāi)花和結(jié)果，故其嫩梢和葉中的營(yíng)養(yǎng)活性成分較普通枸杞葉更高。藥理研究表明，無(wú)果枸杞葉提取物具有較好的抗氧化、抗衰老、降血脂和預(yù)防老年性癡呆癥等作用[3，5]，因而具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。當(dāng)前，對(duì)無(wú)果枸杞葉的利用以枸杞葉茶最為常見(jiàn)，然而現(xiàn)有枸杞葉茶普遍存在滋味苦澀、青辛味較重等缺點(diǎn)，由于口感較差，因而尚未得到市場(chǎng)廣泛認(rèn)可。

茯茶為黑茶類(lèi)全發(fā)酵茶，是以黑毛茶為原料，經(jīng)冠突散囊菌為主的多菌群發(fā)酵制作而成，具有金花普茂、菌香濃郁、湯色紅濃、口感醇厚的獨(dú)特特征和風(fēng)味，品質(zhì)較加工前顯著提升[5]。為此，前期以采摘于寧夏中寧的無(wú)果枸杞嫩梢和葉為原料，經(jīng)殺青、干燥等工藝制成枸杞葉茶，進(jìn)一步與黑毛茶拼配，并采用涇陽(yáng)茯茶加工工藝制成枸杞葉茯茶，不僅改善了枸杞葉茶的口感，而且豐富了茯茶產(chǎn)品類(lèi)型。在枸杞葉茯茶成功制作的基礎(chǔ)上，對(duì)枸杞葉茯茶加工過(guò)程中主要活性成分的變化及發(fā)花后枸杞葉茯茶抗氧化作用進(jìn)行了研究，從而為枸杞葉茯茶的飲用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞葉茶以采摘于寧夏中寧無(wú)果枸杞嫩梢和葉為原料，寧夏童子茶科技有限公司加工制作而成；黑毛茶產(chǎn)自湖南石門(mén)，陜西樸道茶業(yè)股份有限公司提供；枸杞葉茶和黑毛茶按1∶1 拼配混勻，經(jīng)揀選、拌釉渥堆、氣蒸（9～12 s）、壓制成型、發(fā)花、干燥等工藝制成。

分別在加工過(guò)程中的原料揀選、拌釉渥堆、氣蒸與壓制成型（即發(fā)花0 d），發(fā)花8 d 和25 d 取樣，所有樣本均取樣約200 g，依次編號(hào)為S1～S5，取樣后立即進(jìn)行冷凍干燥處理，均勻磨碎后貯藏于-20 ℃下備用。

蘆丁、葡萄糖、沒(méi)食子酸、咖啡堿、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司提供；濃鹽酸、濃硫酸、水合茚三酮（均為分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、苯酚、福林酚、碳酸鈉、甲醇、堿式乙酸鉛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化亞錫、乙酸乙酯、草酸、碳酸氫鈉、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸、過(guò)硫酸鉀（均為分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼（DPPH）、ABTS 二胺鹽，上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810 型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；FA1004N 型電子分析天平，上海精科天平有限公司產(chǎn)品；TG16-WS 型臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；RE52CS-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；GZX-9246MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；TD5A 型大容量低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2 型電熱恒溫水浴鍋，金壇市江南儀器廠產(chǎn)品；FD5-2.5 型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM 公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 枸杞葉茯茶活性成分分析

水浸出物含量，參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；多糖含量，參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行測(cè)定；總黃酮含量，參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行測(cè)定；游離氨基酸含量，參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；咖啡堿含量，參考GB/T 8312—2013《茶咖啡堿測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；多酚含量，參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》進(jìn)行測(cè)定；茶色素含量，參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 體外抗氧化作用研究

（1） 枸杞葉茯茶水提取物母液制備[9-11]。稱(chēng)取2.0 g 貯藏于-20 ℃下的發(fā)花25 d 枸杞葉茯茶凍干樣本，加40 mL 沸水，沸水浴提取45 min，期間每15 min 振搖1 次，趁熱抽濾，濾渣重復(fù)提取1 次，合并濾液置于100 mL 容量瓶中，定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的枸杞葉茯茶水提取物母液，待用。

（2） ABTS+清除活性測(cè)定。參照文獻(xiàn)[12]的方法稍作改進(jìn)。等體積混合ABTS+溶液（8.1 mmol/L） 與過(guò)硫酸鉀溶液（3.2 mmol/L），暗處放置16 h，進(jìn)一步用無(wú)水乙醇稀釋至在波長(zhǎng)734 nm 處吸光度（A）為0.70 左右，得ABTS+工作液。取一定體積枸杞葉茯茶水提取物母液，分別稀釋至質(zhì)量濃度為5，10，20，30，40，50，80 μg/mL，取上述稀釋后不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶提取液1 mL 置于具塞試管中，每管加入ABTS+工作液4.0 mL，室溫下避光反應(yīng)6 min，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光度（A），記為A樣品；以蒸餾水代替枸杞葉茯茶提取液為空白組，測(cè)定吸光度（A） 記為A空白，按照公式（1） 計(jì)算ABTS+清除率。同時(shí)，以維C 為陽(yáng)性對(duì)照。

（3） DPPH 自由基清除活性測(cè)定。參照文獻(xiàn)[10]的方法稍作改進(jìn)。取一定體積枸杞葉茯茶水提取物母液，分別稀釋至質(zhì)量濃度為20，30，40，50，70，100 μg/mL，取上述稀釋后不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶提取液2 mL 置于具塞試管中，各管加入0.1 mmol/L DPPH 溶液2 mL，混勻后于室溫下靜置30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度（A） 記為A樣品。用蒸餾水代替DPPH 溶液按照上述方法操作，測(cè)定吸光度（A） 記為A對(duì)照，以蒸餾水代替枸杞葉茯茶提取液按上述方法操作，測(cè)定吸光度記為A空白，按照公式（2） 計(jì)算DPPH 自由基消除率。同時(shí)，以維C 為陽(yáng)性對(duì)照。

（4）·OH 清除活性測(cè)定。參照文獻(xiàn)[11]的方法稍作改進(jìn)。將枸杞葉茯茶水提取物母液梯度稀釋為0.01，0.05，0.10，0.40，0.80，1.60，2.40，3.20 mg/mL。于不同試管中分別加入上述不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶提取液2 mL，再依次加入2 mL 的9 mmol/L 的FeSO4、水楊酸和8.8 mmol/L 的H2O2溶液，搖勻，于37 ℃下水浴30 min，以蒸餾水調(diào)零，于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)吸光值，記為A樣品。以蒸餾水代替枸杞葉茯茶提取液按上述方法操作，測(cè)定吸光度記為A空白；用蒸餾水代替水楊酸按上述方法操作，測(cè)定吸光度記為A對(duì)照，按照公式（3） 計(jì)算·OH 清除率。同時(shí)，以維C為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用Graph Pad Prism 軟件進(jìn)行進(jìn)行顯著性分析和繪圖。采用Metabo Analyst 5.0 進(jìn)行主成分分析（Principle component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞葉茯茶不同加工階段活性成分變化

枸杞葉茯茶加工過(guò)程中水浸出物、總黃酮、多糖、多酚、游離氨基酸、咖啡堿、茶色素等活性成分進(jìn)行分析。

枸杞葉茯茶不同加工階段活性成分分析見(jiàn)表1。

由表1 可知，枸杞葉茯茶中活性成分較為豐富，在所檢測(cè)的活性成分中除茶褐素外，其余成分在加工過(guò)程中均呈下降趨勢(shì)，與傳統(tǒng)以黑毛茶為原料加工茯茶變化規(guī)律相似[12]。與S1 相比，發(fā)花結(jié)束后樣本S5 中水浸出物、總黃酮、多糖、多酚、游離氨基酸、咖啡堿、茶紅素分別下降8.54%，22.79%，20.35%，12.16%，39.31%，23.70%和37.90%，而茶褐素增加37.50%，且差異均達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。

表1 枸杞葉茯茶不同加工階段活性成分分析

進(jìn)一步對(duì)各主要活性成分分析可以發(fā)現(xiàn)，在枸杞葉茯茶加工程中，水浸出物主要在渥堆階段（S1～S2） 和發(fā)花中后期（S4～S5） 下降較快，分別下降1.82%和0.79%，上述2 個(gè)階段水浸出物下降量占加工過(guò)程總下降量的76.54%，可能是由于在渥堆和發(fā)花中后期這2 個(gè)階段，微生物的生長(zhǎng)繁殖消耗了大量的營(yíng)養(yǎng)成分而導(dǎo)致。枸杞葉茯茶原料中黃酮含量高達(dá)11.63%，發(fā)花結(jié)束后含量仍達(dá)8.98%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)茯茶[12]?？傸S酮在渥堆階段呈下降趨勢(shì)，但S1和S2 差異不顯著（p＞0.05），發(fā)花階段下降明顯，尤其以S3～S4 階段下降幅度最大，此過(guò)程中總黃酮含量減少1.45%，下降幅度為13.19%，差異達(dá)極顯著水平（p＜0.01），發(fā)花后期（S4～S5） 下降有所減緩，但S4 和S5 中總黃酮含量差異仍達(dá)極顯著水平（p＜0.01）。多糖在枸杞葉茯茶加工過(guò)程中下降明顯，各不同階段樣本間多糖含量均差異顯著（p＜0.05），其中以氣蒸階段下降幅度最大，發(fā)花階段次之，且S2 與后續(xù)各階段樣本，S3 與S5、S4 與S5 之間含量差異達(dá)極顯著水平（p＜0.01）。枸杞葉茯茶加工過(guò)程中多糖含量顯著降低的原因可能是由于糖類(lèi)物質(zhì)一方面在高溫高濕下易發(fā)生脫水、縮合、聚合等焦糖化反應(yīng)，另一方面作為以冠突散囊菌為主的多菌群生長(zhǎng)和繁殖的碳源而被消耗所導(dǎo)致[13]。游離氨基酸在枸杞葉茯茶加工過(guò)程中的各個(gè)階段含量均下降明顯，其在各不同階段樣本間的含量差異不僅顯著（p＜0.05），而且均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）。研究表明，氨基酸主要賦予茶葉鮮爽的口感，而醇和是茯茶的主要特征，因此其含量的下降有助于枸杞葉茯茶品質(zhì)形成。枸杞葉茯茶加工過(guò)程中，咖啡堿含量下降主要集中于渥堆和氣蒸階段，與S1 相比，S3 中咖啡堿含量下降幅度達(dá)19.36%，在發(fā)花后期，咖啡堿含量下降幅度大大降低?？Х葔A是茶葉中苦味物質(zhì)之一，其在加工過(guò)程中含量的降低有助于緩解茶湯苦澀味；同時(shí)，咖啡堿還可與黃酮類(lèi)氧化產(chǎn)物形成絡(luò)合物，有助于枸杞葉茯茶醇和滋味的形成。茶多酚是茶葉中主要的抗氧化活性物質(zhì)，在枸杞葉茯茶加工過(guò)程中多酚的含量變化明顯，總體來(lái)看，加工前期（S1～S3） 多酚含量下降幅度較發(fā)花階段（S3～S5） 小。除S1 和S2 階段多酚含量差異不顯著外（p＜0.05），S1 和S2 與其他階段樣本中多酚含量差異均達(dá)到顯著水平（p＜0.05），且S1 和S3，S4 和S5，S2和S4 和S5，S3 和S5 的含量差異達(dá)極顯著水平（p＜0.01）。多酚和茶葉的苦澀味有較為密切的關(guān)系，其在加工過(guò)程中含量的下降有助于降低枸杞葉茯茶的粗澀味，增進(jìn)其醇和口感。此外，隨著枸杞葉茯茶加工過(guò)程的進(jìn)行，茶多酚經(jīng)酶促氧化或非酶促氧化形成茶色素，進(jìn)一步多酚、茶黃素、茶紅素聚合形成茶褐素。因此，在枸杞葉茯茶加工過(guò)程中，茶紅素逐步下降，而茶褐素逐步上升，且各不同階段樣本間茶紅素和茶褐素含量差異均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），茶紅素和茶褐素含量的變化使得枸杞葉茯茶不同階段樣本沖泡后湯色由黃綠逐步轉(zhuǎn)變橙黃，最終為橙紅。

2.2 主成分分析

不同加工階段枸杞葉茯茶活性成分主成分分析見(jiàn)圖1。

圖1 不同加工階段枸杞葉茯茶活性成分主成分分析

對(duì)枸杞葉茯茶加工過(guò)程中各不同階段樣本活性成分進(jìn)行主成分分析，可直觀地反映各樣本活性成分的差異。由圖1 可知，枸杞葉茯茶不同加工階段活性成分PCA 圖中PC1 為88.97%，PC2 為5.65%，二者累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.62 %，表明PC1 和PC2 的總貢獻(xiàn)率包含了枸杞葉茯茶樣本的大部分信息，較好地反映了不同茶樣之間活性成分差異的影響因素。枸杞葉茯茶各不同加工階段樣本在PCA 圖上均呈現(xiàn)明顯的分離，說(shuō)明茶樣主要活性成分在加工過(guò)程中發(fā)生了較大的變化，活性物質(zhì)能夠得到良好的分離。

2.3 枸杞葉茯茶水提取物體外抗氧化活性

2.3.1 ABTS+自由基清除作用

不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶水提取物對(duì)ABTS+自由基清除作用見(jiàn)圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶水提取物對(duì)ABTS+自由基清除作用

由圖2 可知，枸杞葉茯茶水提取物對(duì)ABTS+自由基具有較好的清除作用，但其清除能力較維C 弱。當(dāng)枸杞葉茯茶水提取物質(zhì)量濃度為5 μg/mL 時(shí)，其對(duì)ABTS+自由基的清除率為8.85%，隨著水提取物質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)ABTS+自由基的清除作用逐步增強(qiáng)。當(dāng)枸杞葉茯茶水提取物質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)，其對(duì)ABTS+自由基的清除率為34.96%，繼續(xù)增大水提物濃度，其對(duì)ABTS+自由基的清除率增加不明顯，當(dāng)水提物質(zhì)量濃度為80 μg/mL 時(shí)，與50 μg/mL 相比，清除率僅增加3.09%。

2.3.2 DPPH 自由基清除作用

不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶水提取物對(duì)DPPH 自由基清除作用見(jiàn)圖3。

圖3 不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶水提取物對(duì)DPPH 自由基清除作用

由圖3 可知，枸杞葉茯茶水提取物具有較好的DPPH 自由基清除作用，但其清除能力較維C 弱。當(dāng)枸杞葉茯茶水提取物質(zhì)量濃度為20 μg/mL 時(shí)，其對(duì)DPPH 自由基的清除率為20.81%，隨著質(zhì)量濃度的增大，清除率逐步增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)100 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH 自由基的清除率可達(dá)64.04%。在20～100 μg/mL 范圍內(nèi)，枸杞葉茯茶水提取物質(zhì)量濃度與DPPH 自由基的清除率呈線性正相關(guān)，擬合方程為Y=0.005 2X+ 0.129 8，R2=0.984 4，線性關(guān)系較好。通過(guò)該擬合方程可計(jì)算出枸杞葉茯茶水提取物對(duì)DPPH 自由基半抑制質(zhì)量濃度（IC50） 為71.19 μg/mL。

2.3.3 對(duì)·OH 的清除作用

不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶水提取物對(duì)·OH 自由基清除作用見(jiàn)圖4。

圖4 不同質(zhì)量濃度枸杞葉茯茶水提取物對(duì)·OH 自由基清除作用

由圖4 可知，枸杞葉茯茶水提取物對(duì)·OH 具有一定的清除作用，當(dāng)水提取物質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH 自由基的清除率為4.19%，繼續(xù)增加水提取物質(zhì)量濃度，其對(duì)·OH 自由基清除率逐步增加。當(dāng)水提取物質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時(shí)，其對(duì)·OH自由基清除率為9.09%；當(dāng)質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH 自由基清除率為30.93%；繼續(xù)增加水提取物質(zhì)量濃度至3.2 mg/mL，清除率為31.02%，上升幅度較小。在0.1～2.4 mg/mL 內(nèi)，枸杞葉茯茶水提取物質(zhì)量濃度與·OH 自由基的清除率之間呈正相關(guān)，擬合方程為Y=0.105 6X+0.048 0，R2=0.989 7，線性關(guān)系較好。

3 結(jié)論

枸杞葉茯茶加工過(guò)程中茶褐素含量呈上升趨勢(shì)，而水浸出物、總黃酮、多糖、多酚、游離氨基酸、咖啡堿、茶紅素等活性成分呈下降趨勢(shì)，上述活性成分的變化對(duì)于促進(jìn)枸杞葉茯茶醇和口感和橙紅湯色等優(yōu)良品質(zhì)的形成具有一定作用。體外抗氧化研究結(jié)果表明，枸杞葉茯茶水提取物具有較好的抗氧化活性，其對(duì)DPPH，ABTS+，·OH 自由基的清除能力隨水提取物質(zhì)量濃度的增大而增大，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這為枸杞葉茯茶的飲用提供了參考。