miR-186-3p通過靶向調(diào)控MCM2對(duì)宮頸癌發(fā)生的作用機(jī)制研究

楊曉飛 田靜偉 劉京 于麗娜

2018年數(shù)據(jù)顯示,宮頸癌在常見惡性腫瘤中位居第4位,其死亡率逐年增加[1],在超過50萬名接受調(diào)查的宮頸癌患者中,死亡率高達(dá)60%[2]。隨著健康教育、人乳頭瘤病毒(human papilpapillomovirus, HPV)疫苗的接種以及宮頸癌篩查力度的加大,其發(fā)病率、死亡率得到有效遏制[3]。但是該病的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,目前仍然是研究的熱點(diǎn)。microRNAs是非編碼RNA,通過與靶標(biāo)mRNA結(jié)合,調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾靶基因的3′非翻譯區(qū)[4]。miR-186參與多種癌癥包括乳腺癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤以及黑色素瘤等的發(fā)生,可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖和有氧糖酵解。有研究表明,miR-186-3p能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡,并抑制細(xì)胞的增殖和有氧糖酵解等[5]。研究發(fā)現(xiàn)miR-186-5p在HPV感染的宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),表明miR-186可抑制宮頸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞,促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡[6]。微染色體維持復(fù)合物組分2(minichromosome maintenance complex component 2, MCM2)參與真核生物基因組復(fù)制的啟動(dòng)[7]。有研究表明,MCM2是診斷和預(yù)測(cè)宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵基因[8]。本研究旨在探討miR-186-3p與MCM2在宮頸癌中的作用,為宮頸癌的治療提供新的見解。

材料與方法

一、一般資料

選取2019年9月至2021年3月在石家莊市婦幼保健院確診為宮頸癌的患者60例,年齡35～65歲,平均(44.35±12.01)歲。收集患者宮頸癌組織及相應(yīng)正常組織(距腫瘤組織約3～5 cm),并儲(chǔ)存于液氮(-196 ℃)中。排除患有其他類型的疾病,如肝腎功能不全、自身免疫系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重精神障礙的患者,以及已接受化療、放療或其他治療的患者。本研究經(jīng)石家莊市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者及其家屬均簽署同意書。

二、主要材料

HeLa(宮頸癌細(xì)胞)和HcerEpic(人正常宮頸上皮細(xì)胞)細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑和RT-qPCR試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó)有限公司);引物由上海生工生物有限公司完成。TRIzol試劑購(gòu)自深圳欣生源生物科技有限公司,PrimeScript RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。MCM2抗體購(gòu)自Abcam,BCA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京凱根生物技術(shù)有限公司。

三、方法

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與培養(yǎng):將Hela及HcerEpic細(xì)胞培養(yǎng)于10%血清蛋白的DMEM培養(yǎng)液中,置于95%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí),胰酶消化,將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)。

2.RT-qPCR檢測(cè)miR-186-3p和MCM2的表達(dá)情況:首先用TRIzol試劑提取總RNA。使用PrimeScript RT-PCR試劑盒合成cDNA。PCR反應(yīng)條件:42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,40 個(gè) 95 ℃循環(huán)5 s和60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用U6作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化miRNA的表達(dá),其他基因的表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參。采用2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。miR-186-3p上游引物序列:5′-GCCCAAAGGTGAA-TTT-TTTGGG-3′,下游引物序列:5′-CAGTG-CGTGTCGTGGAGT-3′;MCM2上游引物序列:5′-AGCACTTGATGAACTCGGGG-3′,下游引物序列:5′-AAGCCAACAGATACCAGCGT-3′;U6上游引物序列:5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下游引物序列:5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH上游引物序列:5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′;下游引物序列:5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′。

3.RT-qPCR檢測(cè)siMCM2的表達(dá)情況:將MCM2的小干擾RNA(siMCM2:5′-CAGGTGACAG-ACTTTATCAAA-3′)和陰性對(duì)照(siNC:5′-CAGGTGACAGACTTTATCAAA-3′)應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中,操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后,用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,測(cè)定目的基因的表達(dá)量。轉(zhuǎn)染分為siNC組和siMCM2組。

4.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:Hela細(xì)胞經(jīng)37 ℃胰蛋白酶處理60 s,以3×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。轉(zhuǎn)染24 h后,向96孔板中加入20 μl MTT。每組重復(fù)3次。4 h后,棄去上清液,每孔中加入150 μl二甲基亞砜,37 ℃孵育10 min。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入10 μl MTT,再孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處各孔內(nèi)的吸光度(OD值)。轉(zhuǎn)染分為空白對(duì)照組、miR-186-3p inhibitor組、miR-186-3p mimics組以及各自的對(duì)照組(NC inhibitor、NC mimics)。

5.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力:取各組細(xì)胞重懸,接種于Transwell小室上層(3×103個(gè)細(xì)胞/孔),用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng);下層加入含10% FBS的培養(yǎng)液,孵育24 h。用棉簽擦去Transwell上室細(xì)胞。下室以4%多聚甲醛固定后以0.1%結(jié)晶紫染色。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染分組為NC組、miR-186-3p inhibitor組、miR-186-3p mimics組、siMCM2組。

6.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn):根據(jù)Targetscan(www.targetscan.org)DB、starbase等網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-186-3p的潛在靶基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCM2 mRNA的3′UTR區(qū)為miR-186-3p的潛在靶基因。將MCM2的3′UTR區(qū)域片段插入到psiCHECK-2載體中,該載體為野生型(MCM2 3′UTR-WT)載體。設(shè)計(jì)針對(duì)MCM2 3′UTR“種子區(qū)”的突變引物,插入到載體多克隆位點(diǎn)中,載體命名為MCM2 mutant(MCM2 3′UTR-MUT)。突變型載體同樣含有突變的MCM2 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)。MCM2 3′UTR-WT、MCM2 3′UTR-MUT分別與miR-186-3p mimics、miR-186-3p inhibitor,以及各自的模擬物對(duì)照(NC mimics)和抑制物對(duì)照(NC inhibitor)兩兩組合共轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h,收集Hela細(xì)胞進(jìn)行各組細(xì)胞螢火蟲螢光素信號(hào)及海腎螢光素信號(hào)的檢測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取對(duì)數(shù)2×105個(gè)細(xì)胞/孔的HeLa細(xì)胞接種在24孔板中并培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞密度增加50%時(shí),按照Lipofectamine?2000說明書操作。轉(zhuǎn)染分為miR-186-3p mimics+3′UTR-WT、miR-186-3p mimics+3′UTR-MUT組,設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作,計(jì)算熒光素酶活性。

7.Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):按照試劑盒的操作說明,將提取的HeLa細(xì)胞在冰上裂解30 min。將細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束,將膜浸入封閉液(含5% 脫脂奶粉的TBS)中緩慢振蕩后洗滌;加入兔抗人MCM2抗體(批號(hào)ab245303),4 ℃緩慢振蕩過夜;加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋),室溫緩慢振蕩2 h后洗滌;以β-actin作為內(nèi)參,目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、miR-186-3p和MCM2在宮頸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)水平

與癌旁正常組織比較,宮頸癌組織miR-186-3p相對(duì)表達(dá)水平明顯下降[(0.58±0.31) vs (1.26±0.47)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A);MCM2相對(duì)表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織[(2.22±1.32) vs (1.05±0.63)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

二、宮頸癌組織中miR-186-3p與MCM2相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示,宮頸癌組織中miR-186-3p和MCM2的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.984,P<0.05)(圖2)。

圖2 miR-186-3p、MCM2在宮頸癌組織中表達(dá)水平的相關(guān)性分析

三、Hela與HcerEpic細(xì)胞中miR-186-3p和MCM2的表達(dá)情況

與正常宮頸上皮細(xì)胞比較,HeLa細(xì)胞中miR-186-3p表達(dá)水平明顯降低[(1.00±0.23) vs (0.31±0.17)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A);而MCM2表達(dá)水平明顯高于正常宮頸上皮細(xì)胞[(0.50±0.03) vs (5.47±0.35)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

A:qPCR結(jié)果表明宮頸癌組織的miR-186-3p的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于正常組織;B:qPCR結(jié)果表明宮頸癌的MCM2相對(duì)表達(dá)水平顯著高于正常癌旁組織圖1 miR-186-3p、MCM2在宮頸癌旁組織及宮頸癌組織中的表達(dá)情況

四、Hela細(xì)胞中siMCM2的表達(dá)情況

利用siRNA驗(yàn)證MCM2在宮頸癌中的功能。與siNC組相比,siMCM2組的MCM2表達(dá)顯著下降[(1.14±0.04) vs (0.28±0.02),P<0.05],見圖4。

圖4 HeLa細(xì)胞中siMCM2表達(dá)水平

五、miR-186-3p靶向調(diào)控MCM2

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,miR-186-3p對(duì)MCM2具有靶向調(diào)控作用(圖5A)。雙熒光素酶活性結(jié)果表明miR-186-3p mimics和MCM2 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,熒光素酶活性較NC mimics組明顯受到抑制[(0.49±0.05) vs (1.04±0.04),P<0.05],而miR-186-3p mimics和MCM2 3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,熒光素酶活性與對(duì)照組相比沒有變化[(1.03±0.04) vs (1.03±0.04),P<0.05,圖5B]。與對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染miR-186-3p mimics后,miR-186-3p的表達(dá)明顯升高[(1.94±0.08)vs (0.11±0.06),P<0.05,圖5C]。轉(zhuǎn)染miR-186-3p mimics可抑制Hela細(xì)胞中MCM2 mRNA的表達(dá)[(0.99±0.06) vs (0.31±0.08),P<0.05,圖5D]。Western blot結(jié)果顯示,與NC mimics組相比,miR-186-3p mimics組中MCM2蛋白的表達(dá)量顯著降低[(0.28±0.02) vs (1.15±0.04),P<0.05,圖5E]。結(jié)果表明,miR-186-3p和MCM2具有靶向調(diào)節(jié)作用。

A:HeLa細(xì)胞中的miR-186-3p的相對(duì)表達(dá)量顯著低于HcerEpic細(xì)胞;B:HeLa細(xì)胞中的MCM2的相對(duì)表達(dá)量顯著高于HcerEpic細(xì)胞圖3 HeLa和HcerEpic細(xì)胞中miR-186-3p和MCM2表達(dá)水平的比較

A:miR-186-3p與MCM2的靶向作用位點(diǎn);B:熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 miR-186-3p與MCM2的靶向作用;C:miR-186-3p mimics增加miR-186-3p的表達(dá)量;D:miR-186-3p mimics下調(diào)MCM2的相對(duì)表達(dá)量;E:蛋白印跡法檢測(cè)MCM2蛋白的相對(duì)表達(dá)量圖5 驗(yàn)證miR-186-3p的作用靶點(diǎn)及檢測(cè)MCM2的表達(dá)情況

六、miR-186-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定了轉(zhuǎn)染不同miR-186-3p的Hela細(xì)胞在不同時(shí)間的增殖活性,見表1。根據(jù)混合效應(yīng)模型的分析結(jié)果,不同轉(zhuǎn)染組間的細(xì)胞增殖活性存在顯著性差異(F=52.53,P<0.001)。細(xì)胞的增殖活性受轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間的影響(F=890.10,P<0.001)。在平衡時(shí)間因素之后,轉(zhuǎn)染miR-186-3p mimics組的細(xì)胞增殖活性顯著低于對(duì)照組(t=-5.60,P=0.003)。轉(zhuǎn)染miR-186-3p inhibitor組的細(xì)胞增殖活性顯著高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.65,P<0.01);轉(zhuǎn)染siMCM2細(xì)胞增殖活性顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.42,P=0.013)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖結(jié)果比較

七、miR-186-3p和MCM2對(duì)細(xì)胞遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-186-3p inhibitor組和NC組的侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(81.07±2.61)和(39.96±0.50),miR-186-3p inhibitor組明顯增多(P<0.05);miR-186-3p mimcs組和siMCM2組的侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(26.02±2.51)和(10.60±2.16),siMCM2組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

討 論

宮頸癌是常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病后死亡率極高[9]。HPV感染已被證明是導(dǎo)致宮頸癌的主要原因,但某些致癌基因也會(huì)促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生與進(jìn)展。早期宮頸癌患者的臨床標(biāo)準(zhǔn)治療是子宮切除術(shù)、淋巴結(jié)切除術(shù)、化療或放療。宮頸癌晚期患者通常接受近距離放射治療[10]。然而,這些臨床治療方法在預(yù)防宮頸癌發(fā)生與發(fā)展方面均存在弊端,且無法預(yù)防宮頸癌的復(fù)發(fā)。因此,迫切需要了解導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生和進(jìn)展的潛在分子機(jī)制。有研究表明,宮頸癌細(xì)胞的抑制可能受到各種miRNAs的影響,如miR-21、miR-29a、miR-451a和miR-106b-5p[11-12]。另有研究表明,miR-186可參與多種細(xì)胞過程,包括細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的全過程,且miR-186在多種癌癥中具有調(diào)控作用[13],如急性髓系白血病、非小細(xì)胞肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌。在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)miR-186-3p可抑制乳腺腫瘤的發(fā)展[5],而在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)miR-186-3p可降低細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)的表達(dá),并影響癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[14]。然而,宮頸癌中miR-186-3p的表達(dá)特征與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。

MCM2是一種穩(wěn)定的異六聚體,對(duì)DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[15]。在G1階段,復(fù)制起點(diǎn)與起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物相互作用,誘導(dǎo)細(xì)胞分裂周期、染色質(zhì)、DNA復(fù)制因子1和MCM2-7的順序募集,形成復(fù)制前復(fù)合物。在S期,細(xì)胞周期激酶對(duì)MCM復(fù)合物的激活觸發(fā)了DNA復(fù)制的啟動(dòng)[16-17]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明小鼠體內(nèi)MCM2表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致淋巴瘤的發(fā)生[18]。另有研究證實(shí),MCM2在口腔癌、胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,提示其可能是一種更可靠的標(biāo)志物[19]。與低度惡性腫瘤相比,MCM2在卵巢腺癌中的表達(dá)水平明顯較高,而高度表達(dá)的MCM2在惡性腫瘤中與預(yù)后不良相關(guān)[20]。

A:HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色,×400);B:HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞數(shù)圖6 轉(zhuǎn)染miR-186-3p inhibitor、miR-186-3p mimcs、siMCM2對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

本研究結(jié)果表明miR-186-3p在宮頸癌組織中低表達(dá),而MCM2在宮頸癌組織中高表達(dá)(P<0.05)。MCM2具有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖的作用,并且我們發(fā)現(xiàn)miR-186-3p與MCM2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和Western blot結(jié)果證實(shí)miR-186-3p和MCM2具有靶向調(diào)控作用。同時(shí),Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-186-3p mimics可抑制MCM2蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染miR-186-3p inhibitor后增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。MCM2在Hela細(xì)胞中表達(dá)明顯升高,且其在腫瘤組織中的表達(dá)高于非腫瘤組織,敲除MCM2可減弱宮頸癌細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果表明MCM2可促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展。

綜上所述,miR-186-3p在宮頸癌組織中低表達(dá),通過靶向調(diào)控MCM2基因抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲進(jìn)而影響宮頸癌的進(jìn)展。本研究為宮頸癌治療提供了新的見解,但仍存在一些局限性,如未進(jìn)行關(guān)于細(xì)胞表型“侵襲能力”實(shí)驗(yàn)以及檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。因此,未來的研究應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注參加該信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。