壞死性凋亡基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后影響的研究

張磊 姜經(jīng)航 鄧全紅

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,也是最常見(jiàn)的腎癌組織病理類(lèi)型[1-2]。盡管ccRCC局部或根治性腎切除有治愈可能性,但術(shù)后仍有部分病例復(fù)發(fā)或發(fā)生轉(zhuǎn)移,并導(dǎo)致較高的死亡率。目前針對(duì)ccRCC的靶向治療和免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療極大改善了患者的治療效果,但也會(huì)出現(xiàn)耐藥情況。因此對(duì)于ccRCC發(fā)生、發(fā)展中分子機(jī)制的探討以及新的靶基因的預(yù)測(cè)研究將有助于開(kāi)發(fā)新的治療策略。

壞死性凋亡是一種特殊類(lèi)型的細(xì)胞死亡方式,具有可調(diào)控性[3]。壞死性凋亡基因在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、免疫調(diào)節(jié)、病理分型和治療中發(fā)揮著重要作用,但其與ccRCC預(yù)后之間的相關(guān)性尚不清楚。本研究從腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取ccRCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床資料,尋找與ccRCC預(yù)后密切相關(guān)的壞死性凋亡基因,構(gòu)建預(yù)測(cè)預(yù)后模型,并使用基因表達(dá)綜合(Gene Expression Omnibus, GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE29609數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

ccRCC患者RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)后病理診斷為ccRCC;②隨訪(fǎng)時(shí)間<30 d的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①無(wú)完整臨床數(shù)據(jù);②其他病理類(lèi)型的腎癌。最終獲得539例ccRCC組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

二、數(shù)據(jù)處理

1.壞死性凋亡基因的獲取:從在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.kegg.jp/)中下載壞死性凋亡基因,總共有159個(gè)基因納入后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.生物信息學(xué)分析:以篩選條件(|log2FC|>1,FDR<0.05)為基礎(chǔ),使用R軟件(4.1.0版本)中l(wèi)imma包(3.13版本)篩選ccRCC和正常組織中的差異表達(dá)壞死性凋亡基因。運(yùn)用基因本體(Gene Ontology, GO)和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes, KEGG)分析差異表達(dá)壞死性凋亡基因的功能富集,使用ggplot包對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。然后繼續(xù)篩選與ccRCC預(yù)后相關(guān)的壞死性凋亡基因,采用單因素Cox回歸分析ccRCC總生存期與壞死性凋亡基因之間的關(guān)系。將單因素Cox回歸分析篩選出的預(yù)后相關(guān)壞死性凋亡基因納入多因素Cox回歸分析,確定與ccRCC預(yù)后密切相關(guān)的壞死性凋亡基因,同時(shí)得到預(yù)后相關(guān)壞死性凋亡基因的回歸系數(shù)和危險(xiǎn)比。通過(guò)在線(xiàn)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cbioportal.org)分析預(yù)后相關(guān)壞死性凋亡基因的突變情況。

3.構(gòu)建ccRCC預(yù)后模型:以壞死性凋亡基因表達(dá)水平和回歸系數(shù)的乘積構(gòu)建預(yù)后模型公式。以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值為分界線(xiàn),將ccRCC患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組,使用Kaplan-Meier法分析兩組的生存率。為了探討風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)ccRCC預(yù)后的可靠性及準(zhǔn)確性,進(jìn)一步通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE29609數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié) 果

一、差異表達(dá)壞死性凋亡基因的功能富集

使用GO和KEGG分析壞死性凋亡基因的生物學(xué)功能和重要調(diào)控網(wǎng)絡(luò),分析結(jié)果見(jiàn)圖1。GO分析結(jié)果顯示壞死性凋亡基因的生物過(guò)程主要涉及病毒反應(yīng)、外源性凋亡信號(hào)通路、調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、壞死性細(xì)胞凋亡過(guò)程以及對(duì)細(xì)胞因子刺激響應(yīng)的調(diào)節(jié),在細(xì)胞組分上主要與膜微囊、膜微區(qū)和炎癥體復(fù)合物密切相關(guān),其分子功能上主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、鈣離子依賴(lài)、磷酸酯酶A2活性(消耗1,2-二棕櫚酸磷脂酰膽堿)以及磷脂結(jié)合等。KEGG分析結(jié)果顯示壞死性凋亡基因與細(xì)胞壞死性凋亡、甲型流感、MAPK信號(hào)通路以及NOD樣受體信號(hào)通路等生物學(xué)途徑密切相關(guān)。

二、差異表達(dá)壞死性凋亡基因與ccRCC患者生存和預(yù)后的關(guān)系

與正常組織比較,ccRCC組織中有29個(gè)壞死性凋亡基因高表達(dá)、7個(gè)壞死性凋亡基因低表達(dá)。對(duì)36個(gè)壞死性凋亡基因進(jìn)行單因素和多因素Cox分析發(fā)現(xiàn),有7個(gè)基因與ccRCC患者的生存和預(yù)后密切相關(guān),其中3個(gè)基因[FAS配體(FAS ligand, FASLG)、溶質(zhì)載體家族25A4(solute carrier family 25 member 4, SLC25A4)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4(signal transducer and activator of transcription 4, STAT4)]是保護(hù)性因素,4個(gè)基因[BH3相互作用域死亡激動(dòng)劑(BH3 interacting domain death agonist, BID)、γ干擾素(interferon gamma, IFNG)、干擾素調(diào)節(jié)因子9(interferon regulatory factor 9, IRF9)和磷酸酯酶A2IVD(phospholipase A2 group IVD, PLA2G4D)]是危險(xiǎn)因素。使用在線(xiàn)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析這些基因的遺傳突變,發(fā)現(xiàn)突變率最高的類(lèi)型是擴(kuò)增突變和深度缺失,其中FASLG突變頻率最高(4%)。依據(jù)壞死性凋亡基因表達(dá)的中位值,將ccRCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,Kaplan-Meier法分析顯示差異表達(dá)壞死性凋亡基因與ccRCC患者的生存密切相關(guān)(圖2)。

A:GO分析圖;B:KEGG分析圖圖1 差異表達(dá)壞死性凋亡基因GO和KEGG分析

A:BID表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系;B:IFNG表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系;C:IRF9表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系;D:PLA2G4D表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系;E:SLC25A4表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系;F:STAT4表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系圖2 不同壞死性凋亡基因表達(dá)ccRCC患者的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)

三、ccRCC患者預(yù)后模型公式構(gòu)建與驗(yàn)證

多因素Cox分析發(fā)現(xiàn),有7個(gè)基因與ccRCC患者的生存和預(yù)后密切相關(guān)。根據(jù)每個(gè)差異表達(dá)壞死性凋亡基因的回歸系數(shù),構(gòu)建的預(yù)后模型公式:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=0.935×BID表達(dá)量-0.647×FASLG表達(dá)量+0.816×IFNG表達(dá)量+0.499×IRF9表達(dá)量+0.587×PLA2G4D表達(dá)量-0.328×SLC25A4表達(dá)量-0.452×STAT4表達(dá)量。根據(jù)該公式計(jì)算每例ccRCC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,然后以該評(píng)分中位值將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier法分析顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率比低風(fēng)險(xiǎn)組患者低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖3)。使用GSE29609數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證同樣發(fā)現(xiàn),高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率比低風(fēng)險(xiǎn)組患者低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047,圖4)。

圖3 ccRCC高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者總體生存率曲線(xiàn)

圖4 GSE29609數(shù)據(jù)驗(yàn)證ccRCC高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者總體生存率曲線(xiàn)

將患者的臨床資料和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分結(jié)合納入單因素和多因素Cox分析,結(jié)果顯示年齡、腫瘤分級(jí)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是影響ccRCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,而其他臨床指標(biāo)不具有預(yù)測(cè)意義(圖5A、B)。同時(shí),以臨床資料和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為基礎(chǔ)構(gòu)建預(yù)測(cè)ccRCC患者預(yù)后的諾莫圖(圖5C),C指數(shù)為0.694,用以預(yù)測(cè)ccRCC患者1年、3年和5年生存率的受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線(xiàn)下面積(area under cure, AUC)分別為0.735、0.702和0.734(圖5D),提示構(gòu)建的預(yù)后諾莫圖具有較好的預(yù)測(cè)效能。

A:單因素Cox回歸分析;B:多因素Cox回歸分析;C:ccRCC患者1年、3年和5年總生存率的諾莫圖;D:預(yù)測(cè)ccRCC患者1年、3年和5年生存率的ROC曲線(xiàn)圖5 ccRCC患者預(yù)后危險(xiǎn)因素分析和諾莫圖模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

討 論

對(duì)于局限性ccRCC,腫瘤切除后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)仍然很高[2]。轉(zhuǎn)移性ccRCC患者使用特異性分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑可以改善生存預(yù)后,如腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥則會(huì)導(dǎo)致其預(yù)后不佳[4]。而對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移性ccRCC患者通常會(huì)給予靶向藥物和(或)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療,對(duì)于這部分患者應(yīng)增加臨床隨訪(fǎng)時(shí)間和頻率,適時(shí)調(diào)整,以選擇最佳的輔助治療方式來(lái)改善其預(yù)后[5]。因此,尋找影響ccRCC患者預(yù)后的因素,用以預(yù)測(cè)其生存率,指導(dǎo)患者進(jìn)行系統(tǒng)化和個(gè)體化治療顯得尤為重要。

有研究指出,壞死性凋亡是由受體結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3以及其底物混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白共同介導(dǎo)、能夠被Necrostain-1抑制的細(xì)胞死亡方式,其與細(xì)胞凋亡不同,允許免疫原性細(xì)胞內(nèi)容物釋放,包括損傷相關(guān)分子模式和炎癥細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素-1受體,從而引發(fā)炎癥[6]。更深入地了解壞死性凋亡的機(jī)制和生理作用將有助于了解這些新的細(xì)胞死亡效應(yīng)因子如何靶向治療炎癥性疾病、或觸發(fā)癌細(xì)胞死亡和抗癌免疫反應(yīng),以及對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響,有可能發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的新靶點(diǎn)[7]。本研究通過(guò)分析發(fā)現(xiàn),相對(duì)于正常組織,ccRCC組織中有36個(gè)壞死性凋亡基因表達(dá)具有差異性。功能分析顯示壞死性凋亡基因主要與炎癥體復(fù)合物、細(xì)胞因子受體結(jié)合、壞死性細(xì)胞凋亡過(guò)程、程序性壞死性細(xì)胞死亡、MAPK信號(hào)通路以及NOD樣受體信號(hào)通路等生物學(xué)途徑密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn),有7個(gè)壞死性凋亡基因與ccRCC患者的生存和預(yù)后密切相關(guān),其中3個(gè)基因(FASLG、SLC25A4和STAT4)是保護(hù)性因素,4個(gè)基因(BID、IFNG、IRF9和 PLA2G4D)是危險(xiǎn)因素,并且其表達(dá)情況與ccRCC患者生存密切相關(guān)。在對(duì)深靜脈血栓的研究中發(fā)現(xiàn),miR-21在其模型中的表達(dá)受到抑制,并通過(guò)靶向FASLG調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和血管生成[8]。在腫瘤中,高表達(dá)的FASLG可能刺激轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對(duì)抗Fas表達(dá)的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,并導(dǎo)致這些細(xì)胞的免疫逃逸[9]。同樣SLC25A4失活會(huì)導(dǎo)致乳酸酸中毒、線(xiàn)粒體的過(guò)度增殖、氧化磷酸化酶的誘導(dǎo)活性增加、活性氧的增加以及線(xiàn)粒體DNA的過(guò)度損傷[10]。STAT4是一種轉(zhuǎn)錄因子,受IL-12信號(hào)的激活,促進(jìn)Th1細(xì)胞分化和IFN-γ的產(chǎn)生[11]。在卵巢癌中,加入Ad-TBID預(yù)處理后,癌細(xì)胞對(duì)順鉑表現(xiàn)出更高的藥物敏感性,線(xiàn)粒體凋亡增加[12]。在胰腺癌患者中使用CDK1/2/5抑制劑可以避免IFNG介導(dǎo)的獲得性腫瘤免疫耐藥,這種免疫化療方法可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡,刺激CD8+T細(xì)胞依賴(lài)的抗腫瘤免疫[13]。Kaplan-Meier法分析也顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率比低風(fēng)險(xiǎn)組患者低(P<0.001),進(jìn)一步使用GEO數(shù)據(jù)驗(yàn)證也得到相同的結(jié)果,證實(shí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者的預(yù)后密切相關(guān)。單因素和多因素Cox分析結(jié)果顯示年齡、腫瘤分級(jí)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是影響ccRCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,而其他臨床指標(biāo)不具有預(yù)測(cè)意義。本研究構(gòu)建的預(yù)測(cè)ccRCC患者預(yù)后的諾模圖,C指數(shù)為0.694,用以預(yù)測(cè)ccRCC患者1年、3年和5年生存率的AUC分別為0.735、0.702和0.734,證實(shí)該模型在患者的預(yù)后預(yù)測(cè)中有一定的意義,可用于指導(dǎo)ccRCC患者的個(gè)體化治療。

本研究也存在一些局限性。首先,本研究只是從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得ccRCC預(yù)后相關(guān)的壞死性凋亡基因,構(gòu)建預(yù)測(cè)預(yù)后模型公式,通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中ccRCC患者數(shù)據(jù)驗(yàn)證預(yù)后模型公式的準(zhǔn)確性,并未嚴(yán)格區(qū)分出人種,所以在應(yīng)用到我國(guó)ccRCC患者中有可能因?yàn)槿朔N以及遺傳性等存在一定的差異。其次,本研究樣本量相對(duì)較小,尚需要前瞻性和多中心研究來(lái)驗(yàn)證獲得標(biāo)記基因的預(yù)測(cè)價(jià)值。最后,本研究?jī)H單一使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理,后續(xù)還需要設(shè)計(jì)一些實(shí)驗(yàn)來(lái)探討所獲得基因與ccRCC患者預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)功能以及作用機(jī)制。