VvmiR164s-VvNAC100作用模塊鑒定及其在葡萄子房發(fā)育過程中響應赤霉素的表達分析

王霏，肖迎珂，宣旭嫻，張曉雯，劉菲，查紫仙，代夢瞳，王西成，吳偉民，房經(jīng)貴，王晨

VvmiR164s-作用模塊鑒定及其在葡萄子房發(fā)育過程中響應赤霉素的表達分析

王霏1，肖迎珂1，宣旭嫻1，張曉雯1，劉菲1，查紫仙1，代夢瞳1，王西成2，吳偉民2，房經(jīng)貴1，王晨

1南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，南京 210014

【目的】鑒定葡萄miR164s（VvmiR164a/b/c/d）及其靶基因，明確VvmiR164s及其靶基因應答外源赤霉素在葡萄單性結(jié)實過程中的調(diào)控作用?！痉椒ā恳浴嚎伞咸眩↙. Wink）為試材，利用miR-RACE、PCR、RLM-RACE與PPM-RACE、qRT-PCR及生物信息學等技術(shù)，分析VvmiR164s-模塊應答外源赤霉素在葡萄單性結(jié)實過程中的時空表達特征及其潛在功能?！窘Y(jié)果】赤霉素在花前處理‘魏可’葡萄，可誘導其單性結(jié)實，導致葡萄的無核?？寺¤b定了VvmiR164a/b/c/d的精確序列，預測到其4條靶基因，結(jié)合匹配程度與前期數(shù)據(jù)，在此重點分析靶基因，并將其命名為?？寺¤b定靶基因，驗證其裂解位點，并對其開展蛋白進化、染色體定位及結(jié)構(gòu)分析。裂解位點位于miRNA 5′端的第9位與第11位，裂解頻度為17/20與11/20，定位于葡萄的Chr14上，編碼363個氨基酸，含有一個NAM結(jié)構(gòu)域，且其定位于細胞核。VvNAC100蛋白與其他物種氨基酸序列保守性較高，功能相似，其中與辣椒、煙草等物種親緣關(guān)系較近。的啟動子與其靶基因的啟動子均包含多種激素作用元件，表明其可能通過響應不同的激素來參與葡萄生長發(fā)育的調(diào)控。RT-qPCR結(jié)果顯示，隨著葡萄子房的發(fā)育，VvmiR164b的表達水平呈下降趨勢，其靶基因在子房發(fā)育前期呈上升的表達趨勢，具有一定的負相關(guān)，而VvmiR164a/c/d與表達模式相似，呈現(xiàn)一定的正相關(guān)；GA處理后，VvmiR164a/c/d在葡萄子房單性結(jié)實過程中的表達極顯著地上升，進而也顯著抑制了在這一時期的表達，從而促進了VvmiR164a/c/d-表達水平的負相關(guān)；但VvmiR164b在GA處理后表現(xiàn)出下降的趨勢，且其與的表達水平呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，表明GA處理增強了VvmiR164a/c/d對的負調(diào)控，減弱了VvmiR164b對的負調(diào)控作用。【結(jié)論】是VvmiR164 家族VvmiR164a/b/c/d的真實靶基因；在葡萄單性結(jié)實過程中，赤霉素誘導了VvmiR164a/c/d對靶基因的負調(diào)控作用，抑制了VvmiR164b對靶基因的負調(diào)控作用，VvmiR164a/c/d是VvmiR164家族參與赤霉素誘導葡萄單性結(jié)實的主效因子。

葡萄；赤霉素；單性結(jié)實；VvmiR164s；

0 引言

【研究意義】葡萄（L.）是一種世界性廣泛種植的多年生果樹，也是我國栽培的重要經(jīng)濟果樹之一。無核是葡萄的一種重要優(yōu)良品質(zhì)性狀[1-2]，無核葡萄因其食用簡便、風味與口感佳，備受消費者喜愛。因此，葡萄無核化是一個重要的發(fā)展趨勢和育種目標[3]。赤霉素（GA）是誘導葡萄單性結(jié)實的關(guān)鍵激素[4]，花前GA處理誘導葡萄單性結(jié)實是生產(chǎn)上廣泛應用的一種重要無核化技術(shù)，但其分子機制尚不甚清楚。因此，開展葡萄無核分子機制的研究對無核葡萄育種具有重要意義。microRNA（miRNA）是一種長度一般在20 bp左右的小分子RNA，其在植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導及逆境脅迫中起著重要作用[5-6]?！厩叭搜芯窟M展】近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與GA信號轉(zhuǎn)導，介導植物花的發(fā)育，從而影響育性與單性結(jié)實[7-9]。其中，miR164家族在很多植物中都被發(fā)現(xiàn)與鑒定[10]，據(jù)報道，miR164在植物細胞分化、生長、花的發(fā)育以及脅迫具有一定的作用[11-13]。NAC家族是存在于植物中的一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，并且其作為miR164的靶基因參與了植物發(fā)育中的多種生理過程，如花發(fā)育[14]、胚發(fā)育[15]、促進側(cè)根形成[16]，果實成熟[17-18]以及衰老等過程。另有研究發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子對植物生長發(fā)育的調(diào)控主要通過結(jié)合NACRS或者NACBS來實現(xiàn)，且NAC也會受到GA的誘導并參與代謝及信號轉(zhuǎn)導從而影響果實的成熟，但具體的機制尚不清楚[19]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葡萄miR164s（VvmiR164s）在花期能夠強烈響應外源GA處理，且可能靶向NAC轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合GA在葡萄果實單性結(jié)實方面的顯著調(diào)節(jié)效果，推測VvmiR164s可能應答GA參與葡萄單性結(jié)實的調(diào)控，但是相關(guān)分子調(diào)控機制有待研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒定‘魏可’葡萄中VvmiR164a/b/c/d的成熟體與前體基因的精確序列，驗證其真實靶基因，通過生物信息學分析其進化保守性和潛在功能，綜合分析其應答GA在葡萄單性結(jié)實期的時空表達特征及其應答GA的時空表達模式，為進一步認識VvmiR164s-作用模塊在葡萄單性結(jié)實中的調(diào)控機制提供重要信息，也為從表觀遺傳學角度揭示GA調(diào)控無核果實的分子機制提供參考。

1 材料與方法

試驗于2020年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院葡萄實驗基地進行。

1.1 材料及試驗處理

選用葡萄有核品種‘魏可’作為試材。在花前5 d隨機選取生長勢基本一致的花序，用50 mg·L-1GA3浸蘸30 s，其對照則采用清水處理30 s。選取生長情況較為一致的葡萄花蕾，于處理后的0、1、3、5、7和10 d分別采集后用液氮立即速凍，存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 VvmiR164s成熟體序列比較分析及前體序列克隆與鑒定

在miRBase數(shù)據(jù)庫搜索并下載葡萄miR164家族的成熟體與前體序列。在NCBI上根據(jù)前體的序列預測其基因序列，并設(shè)計用于進行PCR擴增的引物（表1）。產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收，送公司測序。VvmiR164s成熟體相關(guān)染色體的定位通過MapInsepet（http://mg2c.iask.in/ mg2c_v2.0/）預測，VvmiR164a/b/c/d的莖環(huán)結(jié)構(gòu)則利用RNA Folding Form進行分析。

表1 VvmiR164s PCR 擴增引物序列

1.3 VvmiR164s靶基因預測及其生物信息學分析

VvmiR164s靶基因利用在線網(wǎng)站PSRNA Target（https://www.zhaolab.org/psRNATarget/）預測VvmiR164s的靶基因，除maximum expectation設(shè)置為3.0外，其余運行參數(shù)均為默認值。利用在線軟件ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析的相關(guān)特性；在線軟件CDD分析靶基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)；Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ plant-multi/）進行亞細胞定位分析。MIR164s與的系統(tǒng)進化樹在MEGA 5.0中選擇鄰近法進行構(gòu)建，并且運用chiplot（https://www.chiplot.online/）對進化樹進行優(yōu)化；作用元件motif分析與基因結(jié)構(gòu)構(gòu)建則分別利用在線軟件MEME（https://meme-suite.org/ meme/tools/meme）與GSDS（http://gsds.gao-lab.org/）進行。

1.4 靶基因VvNAC100的亞細胞定位

構(gòu)建含有GFP報告基因的super1300雙元表達載體。在super1300載體上選擇I和I雙酶切位點，設(shè)計帶有重組臂的擴增引物。將經(jīng)過I和I雙酶切后的super1300載體片段與帶有重組臂的片段進行重組，構(gòu)建驗證正確的載體后，菌液大搖活化至OD600=1.0。離心后，使用對應的緩沖液（10 mmol?L-1MgCl+10 mmol?L-1MES+0.15 mmol?L-1AS）重懸并調(diào)整OD600=0.2后靜置4 h。選擇本式煙草植株從煙草葉片背面注射，確保葉片被浸透。注射后的煙草植株置于25℃黑暗條件下3 d，以上海翊圣生物公司的DAPI染液為核染料，通過激光共聚焦顯微鏡進行GFP信號與DAPI信號的觀察。

1.5 VvmiR164s靶基因裂解及其驗證

利用筆者實驗室前期改良的RLM-RACE和開發(fā)的PPM-RACE技術(shù)[9]，鑒定VvmiR164s的靶基因，驗證其剪切靶基因位點，并通過瞬時轉(zhuǎn)化組織學染色對其進一步驗證。

1.5.1 表達載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時轉(zhuǎn)化 在去除報告基因（GUS）的二元載體pBI121上連接VvmiR164a/c/d，將靶基因和不含裂解位點的靶片段與GUS報告基因融合，使用的引物見表1。在含有利福平（50 μg?mL-1）和卡那霉素（50 μg?mL-1）的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌GV3101的單菌落（包含重組質(zhì)粒）。離心收集菌體后，將細菌沉淀并重懸于懸浮緩沖液（10 mmol?L-1MES，10 mmol?L-1MgCl2，pH 5.6），并調(diào)整OD600=0.2后靜置4 h，加入100 μmol?L-1AS后進行浸潤，室溫靜置4 h。利用注射器針頭將細菌懸浮液注入6周齡煙草植物的葉片中，然后將滲透的幼苗移回25 ℃溫室，并在黑暗中保持3 d。

1.5.2 GUS組織化學染色 在煙草葉片上打孔，取小圓片進行染色。X-Gluc（上海翊圣生物公司）的工作濃度為 2 mmol?L-1，使用適量的DMA將X-Gluc溶解后，加入GUS組織染色緩沖液（pH7.2的PBS 50 mmol?L-1+Triton X-100 0.1%+鐵氰化鉀2 mmol?L-1+亞鐵氰化鉀2 mmol?L-1+EDTA 10 mmol?L-1）（建議現(xiàn)配現(xiàn)用）。將葉圓片浸于配置好的染色液中，37 ℃培養(yǎng)箱中避光放置過夜后將葉圓片取出，洗凈表面染液后，放在75%乙醇溶液中脫色，水浴加熱可直至葉片脫色完全，將脫色完全的葉片貼標簽拍照。

1.6 VvmiR164s與VvNAC100啟動子順式作用元件分析

利用葡萄基因組CRIBI數(shù)據(jù)庫與NCBI數(shù)據(jù)庫，確定VvmiR164a/b/c/d及的啟動子序列，并用在線軟件PlantCARE進行分析。

1.7 VvmiR164s及其靶基因在葡萄單性結(jié)實過程中的表達分析

采用CTAB法提取不同時期的葡萄花組織的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，內(nèi)參基因為，設(shè)置3次生物學重復，對VvmiR164a/b/c/d及進行qRT-PCR檢測，數(shù)據(jù)整理采用Excel，SPSS進行差異顯著性分析，GraphPad Prism軟件繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 GA處理對‘魏可’葡萄單性結(jié)實的影響

為了闡明GA對‘魏可’葡萄單性結(jié)實的影響，比較GA處理（GA）與未處理對照（CK）葡萄的花序、果實及其縱切和種子的形態(tài)（圖1-A、B）。結(jié)果表明，相比于對照，GA處理的葡萄花序更長和更松散，且具有深黃色花藥和大子房，同時呈現(xiàn)早花特性；從圖1-A與圖1-B可以看出，CK中胚珠可以發(fā)育為成熟種子，而GA組中胚珠逐漸退化、消失，導致單性結(jié)實，并且在種子區(qū)域有一條明顯的細線。此外，GA處理明顯減小橫徑，增加果粒縱徑（圖1-C、D）。與CK植株相比，GA處理明顯抑制了種子發(fā)育，改變果實形狀，導致果實單性結(jié)實，形成無核果實。

2.2 VvmiR164s序列鑒定及其進化分析

2.2.1 VvmiR164s序列鑒定與分析 以‘魏可’葡萄總DNA為模板，對VvmiR164s的前體基因進行擴增，經(jīng)凝膠電泳后獲得4條長度不同的特異性條帶（圖2-A）。通過測序與序列比對發(fā)現(xiàn)，克隆鑒定的 VvmiR164a/b/c/d前體基因分別為561、498、543和435 bp。VvmiR164家族的成熟體序列比較分析顯示（圖2-B），其序列長度均為21 bp，其中，VvmiR164a/c/d成熟體序列相同，它們與VvmiR164b成熟體存在兩個堿基不同（G-A與A-U）。VvmiR164 家族成員分別位于葡萄的Chr7、Chr9、Chr8和Chr14等4條染色體上，且它們的前體均可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，表明VvmiR164s能夠在葡萄中穩(wěn)定存在（圖2-C）。

圖1 GA處理對‘魏可’葡萄單性結(jié)實的影響

2.2.2 VvmiR164s的成熟體進化分析 利用MEGA5.0軟件對16種植物的miR164家族進行進化關(guān)系分析與成熟體序列比對（圖3-A）。結(jié)果表明，不同物種中的miR164家族成員數(shù)量不同，如煙草、番茄與擬南芥中miR164家族成員僅有2個，但也有物種含有11個miR164家族成員，如大豆；除gma-miR164b/c/成熟體序列含有20個堿基外，其余物種miR164家族成員成熟體序列為21個堿基。通過進化樹與和成熟體序列比對后發(fā)現(xiàn)，VvmiR164a/d與番木瓜cpa-miR164d/e親緣關(guān)系最近，成熟體序列相同；VvmiR164b與甜瓜cme-miR164b親緣關(guān)系最近且成熟體序列相同；而VvmiR164c與水稻osa-miR164e和高粱sbi-miR164親緣關(guān)系近。雖然不同物種的miR164家族成員序列差異較小，但還是有個別物種間存在一定的差異。

2.3 VvmiR164s的靶基因克隆、鑒定及其序列特征分析

2.3.1 靶基因預測及匹配程度分析 利用在線軟件psRNATarget預測VvmiR164s的靶基因（表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VvmiR164家族不同成員有相同的靶基因、。對VvmiR164a/b/c/d與其靶基因的匹配程度進一步分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，VvmiR164a/c/d、VvmiR164b與預測靶基因的匹配程度存在一定的差異，其中，VvmiR164a/c/d與的匹配程度最高，錯配率為0.5；與、的匹配程度相同，錯配率為1.5，而的錯配率最高，為1.8；相比之下，VvmiR164b與的匹配程度最高，錯配率為1.0，與的錯配率為1.8，與、的匹配程度相同，且其匹配程度低，錯配率為2.5，表明VvmiR164家族成員與靶基因間的作用強度存在差異。通過對匹配程度與前期數(shù)據(jù)綜合分析，本文重點研究靶基因，將其命名為，并分析VvmiR164s-作用模塊鑒定及其應答赤赤霉素調(diào)控葡萄單性結(jié)實的表達水平。

A：VvmiR164s的前體基因擴增；B：VvmiR164家族的成熟體序列比較；C：VvmiR164a/b/c/d染色體定位及莖環(huán)結(jié)構(gòu)

表2 葡萄VvmiR164s及靶基因相關(guān)信息

ath：擬南芥Arabidopsis thaliana；cme：甜瓜Cucumis melo；cpa：番木瓜Carica papaya；csi：柑橘Citrus sinensis；fve：草莓Fragaria vesca；gma：大豆Glycine max；mdm：蘋果Malus domestica；nta：煙草Nicotiana tabacum；osa：水稻Oryzasativa；ppe：桃Prunus persica；ptc：毛果楊 Populus trichocarpa；sbi：高粱Sorghum bicolor；sly：番茄Solanum lycopersicum；mes：木薯Manihot esculenta；zma：玉米Zea mays；vvi：葡萄Vvtis vinifera

圖4 VvmiR164s與靶基因的匹配程度

2.3.2 靶基因克隆鑒定、亞細胞定位與序列分析 對CRIBI數(shù)據(jù)庫中的同源序列一致，鑒定其真實序列（圖5-B）；對其染色體定位發(fā)現(xiàn)，其位于葡萄的Chr14染色體上（圖5-A）。利用Plant-mPLoc分析預測定位于細胞核，并進一步通過農(nóng)桿菌注射煙草對亞細胞定位進行驗證（圖5-C）。以細胞核染料DAPI（4′,6-二氨基-2-苯吲哚）作為參照，在顯微鏡視野下，DAPI熒光的位置與GFP熒光的位置一致，驗證了定位于細胞核。在線預測分析顯示，共編碼363個氨基酸（圖5-D），含有一個NAM結(jié)構(gòu)域，蛋白分子式C1812H2791N487O567S20，理論等電點5.70；含有20個氨基酸，其中，含量最高的為絲氨酸，占11.3%，色氨酸與半胱氨酸含量最低，僅占2.9%。VvNAC100是一種不穩(wěn)定性蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)為44.45；此外，VvNAC100還是親水性蛋白，其總平均輸水指數(shù)為-0.697。

A：VvNAC100的染色體定位；B：VvNAC100克隆；C：VvNAC100的亞細胞定位；D：VvNAC100結(jié)構(gòu)域分析

2.3.3 蛋白進化、motif元件及保守結(jié)構(gòu)域分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫對VvNAC100蛋白序列進行BLAST，獲得了不同植物的相關(guān)序列。對不同物種進行同源比較，并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖6-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草、辣椒與VvNAC100蛋白親緣關(guān)系較近，而楊樹、番木瓜、甜櫻桃、梅花、蘋果等與其關(guān)系較遠。通過對不同物種的基因結(jié)構(gòu)與motif作用元件分析發(fā)現(xiàn)，它們之間都存在著一定的差異性（圖6-A、B）。在基因結(jié)構(gòu)方面，的內(nèi)含子數(shù)量主要是2，外顯子數(shù)量是3，并且葡萄與梅花、蘋果、白梨、荷花、榴蓮與辣椒每個外顯子與內(nèi)含子的長度和分布都相似；而在蛋白motif元件方面，VvNAC100和與大多數(shù)物種的NAC蛋白motif元件的數(shù)量和排列順序相同，表明VvNAC100蛋白與其他物種氨基酸序列保守性較高，功能相似。在線軟件CDD對結(jié)構(gòu)域分析表明，VvNAC100蛋白有1個NAM結(jié)構(gòu)域（14—141位氨基酸），不同物種的NAC蛋白均有一個NAM結(jié)構(gòu)域，且它們大部分位于同一個位置，只有CsNAC、CpNAC與PtNAC位于不同的位置（圖6-C）。

圖6 NAC蛋白進化分析（A）、保守基序分析（B）與作用元件分析（C）

2.4 VvmiR164s-VvNAC100裂解作用驗證

利用5′-RLM-RACE和3′-PPM-RACE技術(shù)驗證VvmiR164s的靶基因。結(jié)果表明（圖7-A），VvmiR164a/c/d均可裂解，裂解位點位于miRNA5′端的第9位與第11位，裂解頻度為17/20與11/20；而PPM-RACE的裂解位點與RLM-RACE相同，只是裂解頻度存在差異，其裂解頻度為5/22與1/22，低于RLM-RACE的結(jié)果。證實了VvmiR164s均可裂解靶基因，后者是前者的真實靶基因。

基于上述VvmiR164家族成員與靶基因表達的匹配分析結(jié)果，推測VvmiR164a/c/d可能是VvmiR164的主效成員，因此進一步利用煙草瞬時表達共轉(zhuǎn)化體系對VvmiR164a/c/d-模塊的裂解作用開展活體驗證。將VvmiR164a/c/d連接到去除（GUS）報告基因的載體pBI121上，而靶基因和靶片段不含裂解位點p與GUS報告基因融合，載體構(gòu)建圖譜如圖7-B所示，同時以pBI121- GUS作為陽性對照，而缺乏GUS的pBI121作為陰性對照（圖7-C），再把構(gòu)建的載體VvmiR164a/c/d分別與和p混合瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片，通過組織化學染色證明靶裂解對轉(zhuǎn)化煙草葉片中GUS活性水平的影響（圖7-C）。結(jié)果顯示，煙草葉片中pBI121-GUS、pBI121-VvNAC100-GUS、pBI121-VvNAC100p-GUS均顯著變藍，而在pBI121- VvmiR164a-GUS、pBI121-VvmiR164c-GUS、pBI121- VvmiR164d-GUS轉(zhuǎn)化的葉片中未觀察到顏色的變化。此外，pBI121-VvNAC100-GUS與pBI121- VvmiR164a/ c/d-GUS共轉(zhuǎn)的葉片中藍色程度與pBI121-VvNAC100- GUS相比明顯減弱，而pBI121-VvNAC100p-GUS和pBI121-VvmiR164a/c/d-GUS共轉(zhuǎn)的葉片中藍色也有所減弱，但減弱程度不及pBI121-VvNAC100- GUS和pBI121-VvmiR164a/c/d-GUS共轉(zhuǎn)化的葉片。VvmiR164a/c/d與混合轉(zhuǎn)化煙草的GUS活性明顯下降，證實了VvmiR164a/c/d對的裂解作用。

2.5 VvmiR164s及其靶基因VvNAC100的潛在功能分析

2.5.1 VvMIR164s及的啟動子作用元件 利用在線軟件Plant CARE對及的啟動子作用元件分析發(fā)現(xiàn)（圖8-A），主要包括光響應作用元件、激素響應作用元件、脅迫響應作用元件與組織特異性元件等。在靶基因的啟動子作用元件中，光響應作用元件數(shù)量最多，類別最多；而脅迫相關(guān)作用元件是厭氧誘導ARE作用元件；在激素相關(guān)響應元件中，其僅含有赤霉素響應元件（P-box），由此推測可能響應赤霉素信號（圖8-B）。而對啟動子作用元件分析發(fā)現(xiàn)，啟動子作用元件的數(shù)量和類型不同，在元件總體數(shù)量上，最多，而次之，與最少。在作用元件類型上，只有、含有組織特異性應答元件，而含有3種作用元件。所有啟動子中都含有激素響應的作用元件，其應答的激素類型主要有赤霉素（GA）、生長素（IAA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）及茉莉酸甲酯（MeJA）（圖8-B），但是不同類型激素作用元件的組成和數(shù)量存在較大的差異。及不同類型的作用元件類型多樣性表明，它們不僅應答光、脅迫等外界環(huán)境的信號，還可能通過響應不同的激素信號參與調(diào)控葡萄的生長發(fā)育。

A：VvmiR164s對靶基因VvNAC100的裂解位點示意圖；B：載體構(gòu)建示意圖；C：煙草共轉(zhuǎn)化葉片GUS染色

圖8 VvmiR164s及VvNAC100的啟動子順式作用元件

2.5.2 VvmiR164s-在葡萄子房發(fā)育過程中的模式分析 對VvmiR164家族不同成員的表達模式分析發(fā)現(xiàn)（圖9），VvmiR164b在葡萄子房發(fā)育過程中基本不表達，VvmiR164a/c/d的表達量在子房發(fā)育過程中呈現(xiàn)倒“V”趨勢；同樣地，靶基因在子房發(fā)育過程中也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢。

對比VvmiR164s和的表達模式（圖9），發(fā)現(xiàn)VvmiR164a/c/d與之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，其中，VvmiR164d的相關(guān)系數(shù)最高。此外，還發(fā)現(xiàn)在子房發(fā)育過程中，的表達量顯著高于VvmiR164s，并且VvmiR164a/c/d與均在花前2 d有高表達，表明它們可能參與坐果過程的調(diào)控。

圖9 VvmiR164s和VvNAC100在葡萄子房發(fā)育過程中的模式

2.5.3 VvmiR164s-在葡萄單性結(jié)實過程中應答GA的表達模式分析 赤霉素處理可誘導葡萄的單性結(jié)實，為了解葡萄miR164家族及其靶基因在葡萄單性結(jié)實發(fā)育過程中應答赤霉素的模式，分析它們在赤霉素處理后的表達水平。結(jié)果表明（圖10-A），赤霉素處理促進了VvmiR164家族的表達，與對照相比，其表達水平在花期上升，尤其VvmiR164a/ c/d的差異表達更為明顯，而赤霉素處理對VvmiR164b表達的影響不大。此外，赤霉素處理顯著抑制了靶基因的表達。

通過對比GA處理后VvmiR164家族及其靶基因的表達變化相關(guān)性發(fā)現(xiàn)（圖10-B），VvmiR164家族的表達在一定水平上與其靶基因的表達呈負相關(guān)趨勢，但它們的相關(guān)系數(shù)存在差異，其中，VvmiR164c與的負相關(guān)性最強。進一步對比赤霉素處理與對照樣品中VvmiR164s和靶基因表達水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)赤霉素的處理改變了VvmiR164s對靶基因的調(diào)控方式，其誘導了VvmiR164a/c/d對的負調(diào)控，抑制了VvmiR164b對的負調(diào)控（圖9、10），表明赤霉素處理增強了VvmiR164a/c/d對的負調(diào)控作用，VvmiR164a/c/d可能是VvmiR164家族中應答赤霉素介導葡萄子房單性結(jié)實的主要調(diào)控因子。

3 討論

3.1 VvmiR164s及其真實靶基因參與葡萄單性結(jié)實

據(jù)報道，外源赤霉素對葡萄的作用十分典型，它能夠影響葡萄的生長發(fā)育[20]，改變果穗的穗形[21]，誘導葡萄的無核化[22]與改善果實品質(zhì)[23]，但到目前為止，GA參與調(diào)控葡萄無核化的分子機制還不清晰。近些年，miRNA被鑒定為基因表達調(diào)控的關(guān)鍵因子[8,24]，其主要通過調(diào)節(jié)一系列與生長發(fā)育相關(guān)的基因來參與植物激素的信號轉(zhuǎn)導、器官的形成、脅迫環(huán)境下的應答能力，對植物的生長發(fā)育具有重要作用[25-26]。另有研究表明，miRNA還可能參與調(diào)控開花時間與器官的發(fā)育形成，影響花器官的形成。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉素誘導miRNA參與葡萄花果發(fā)育過程中的調(diào)控，如miR156[27]、miR159[28]、miR172[29]與miR397[30]。本研究發(fā)現(xiàn)外源GA可介導VvmiR164s-模塊參與葡萄單性結(jié)實過程的調(diào)控。

圖10 VvmiR164s和VvNAC100在葡萄花發(fā)育過程中應答赤霉素的模式

3.2 VvmiR164a/c/d-VvNAC100可能是GA誘導葡萄單性結(jié)實的主效模塊

前人首先在擬南芥中鑒定了miR164家族，之后通過高通量測序、同源比對、克隆測序等方法，陸續(xù)在不同植物中發(fā)現(xiàn)了眾多序列相似或相同的miR164s，它們共同構(gòu)成了miR164家族。本研究在葡萄中鑒定了VvmiR164的4個成員，其和多數(shù)物種的成員數(shù)量相同，但也與一些物種存在差異，如高粱miR164有5個成員，水稻、毛果楊等有6個成員，番茄有2個成員等，表明miR164家族成員在不同物種中存在差異。研究認為，miR164可以通過其靶基因NAC起作用。目前植物中發(fā)現(xiàn)的NAC轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目有8 133種，存在多個物種中[31]，其有多種生物學功能，如調(diào)控植物生長發(fā)育、參與脅迫應答、調(diào)控植物體內(nèi)激素等。其中，作為NAC家族的成員，在植物的生長發(fā)育中也起著重要作用；而在本研究中首次發(fā)現(xiàn)它被VvmiR164a/c/d介導，參與葡萄單性結(jié)實的調(diào)控，影響無核果實的形成。

同一個miRNA家族不同的成員具有不同的時空表達模式及不同的調(diào)控作用[32]。研究表明，在玉米中，miR164a-途徑參與調(diào)節(jié)花生種子生長與膨大；番茄中SlmiR164通過靶向負調(diào)控果實發(fā)育和成熟的時間[33]；擬南芥中miR164通過靶向參與介導生長素信號轉(zhuǎn)導途徑從而調(diào)控正常發(fā)育[34]；而水稻中miR164通過靶向調(diào)控其干旱脅迫[13]。本研究也在葡萄中鑒定了VvmiR164a/b/c/d均可通過裂解靶基因參與調(diào)控葡萄子房的發(fā)育。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，在對照樣品中VvmiR164a/c/d與靶基因表達呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，而在赤霉素誘導葡萄子房單性結(jié)實過程中，它們的表達水平呈現(xiàn)顯著負相關(guān)，結(jié)合前面靶裂解作用驗證結(jié)果，推測赤霉素通過誘導VvmiR164a/c/d對靶基因的裂解作用參與葡萄單性結(jié)實的調(diào)控；另一方面，赤霉素減弱了VvmiR164b對的負調(diào)控，表明VvmiR164家族可能主要通過VvmiR164a/c/d介導靶基因的裂解在赤霉素誘導葡萄單性結(jié)實過程中發(fā)揮作用，VvmiR164a/c/d可能是主要應答GA介導單性結(jié)實的主要響應調(diào)控因子。

4 結(jié)論

本研究鑒定了VvmiR164a/b/c/d 4個成員前體基因的精確序列，預測并驗證了靶基因，并通過RLM-RACE與PPM-RACE技術(shù)驗證了它們均可通過裂解靶基因參與調(diào)控葡萄單性結(jié)實的過程。在葡萄單性結(jié)實過程中，赤霉素誘導了VvmiR164a/c/d對靶基因的負調(diào)控作用，抑制了VvmiR164b對靶基因的負調(diào)控作用，VvmiR164a/c/d是VvmiR164家族參與赤霉素誘導葡萄單性結(jié)實調(diào)控的主效因子。

[1] WANG X C, ZHAO M Z, WU W M, KORIR N K, QIAN Y M, WANG Z W. Comparative transcriptome analysis of berry-sizing effects of gibberellin (GA3) on seedlessL. Genes & Genomics, 2017, 39(5): 493-507.

[2] ACHEAMPONG A K, ZHENG C L, HALALY T, GIACOMELLI L, TAKEBAYASHI Y, JIKUMARU Y, KAMIYA Y, LICHTER A, OR E. Abnormal endogenous repression of GA signaling in a seedless table grape cultivar with high berry growth response to GA application. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 850.

[3] 崔夢杰, 王晨, 張文穎, 湯崴, 朱旭東, 李曉鵬, 房經(jīng)貴. 無核葡萄研究進展. 植物生理學報, 2017, 53(3): 317-330.

CUI M J, WANG C, ZHANG W Y, TANG W, ZHU X D, LI X P, FANG J G. Research progress of seedless grape. Plant Physiology Journal, 2017, 53(3): 317-330. (in Chinese)

[4] WANG M Q, SUN X, WANG C, CUI L W, CHEN L D, ZHANG C B, SHANGGUAN L F, FANG J G. Characterization of miR061 and its target genes in grapevine responding to exogenous gibberellic acid. Functional & Integrative Genomics, 2017, 17(5): 537-549.

[5] PARK M Y, WU G, GONZALEZ-SULSER A, VAUCHERET H, POETHIG R S. Nuclear processing and export of microRNAs in. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(10): 3691-3696.

[6] BRODERSEN P, SAKVARELIDZE-ACHARD L, BRUUN-RASMUSSEN M, DUNOYER P, YAMAMOTO Y Y, SIEBURTH L, VOINNET O. Widespread translational inhibition by plant miRNAs and siRNAs. Science, 2008, 320(5880): 1185-1190.

[7] DA SILVA E M, E SILVA G F F, Bidoia D B, da Silva Azevedo M, de Jesus F A, Pino L E, Peres L E P, Carrera E, López-Díaz I, Nogueira F T S. MicroRNA159-targetedtranscription factors are required for fruit set in tomato. Plant Journal, 2017, 92(1): 95-109.

[8] ACHARD P, HERR A, BAULCOMBE D C, HARBERD N P. Modulation of floral development by a gibberellin-regulated microRNA. Development, 2004, 131(14): 3357-3365.

[9] WANG C, JOGAIAH S, ZHANG W Y, ABDELRAHMAN M, FANG J G. Spatio-temporal expression of miRNA159 family members and their GAMYB target gene during the modulation of gibberellin- induced grapevine parthenocarpy. Journal of Experimental Botany, 2018, 69(15): 3639-3650.

[10] ZHENG G H, WEI W, LI Y P, KAN L J, WANG F X, ZHANG X, LI F, LIU Z C, KANG C Y. Conserved and novel roles of miR164-CUC2regulatory module in specifying leaf and floral organ morphology in strawberry. The New Phytologist, 2019, 224(1): 480-492.

[11] SIEBER P, WELLMER F, GHEYSELINCK J, RIECHMANN J L, MEYEROWITZ E M. Redundancy and specialization among plant microRNAs: Role of the MIR164 family in developmental robustness. Development, 2007, 134(6): 1051-1060.

[12] NIKOVICS K, BLEIN T, PEAUCELLE A, ISHIDA T, MORIN H, AIDA M, LAUFS P. The balance between the MIR164A and CUC2genes controls leaf margin serration in. The Plant Cell, 2006, 18(11): 2929-2945.

[13] FANG Y J, XIE K B, XIONG L Z. Conserved miR164-targetedgenes negatively regulate drought resistance in rice. Journal of Experimental Botany, 2014, 65(8): 2119-2135.

[14] OOKA H, SATOH K, DOI K, NAGATA T, OTOMO Y, MURAKAMI K, MATSUBARA K, OSATO N, JUN K W, CARNINCI P, HAYASHIZAKI Y, SUZUKI K, KOJIMA K, TAKAHARA Y, YAMAMOTO K, KIKUCHI S. Comprehensive analysis of NAC family genes inand. DNA Research, 2003, 10(6): 239-247.

[15] AIDA M, ISHIDA T, FUKAKI H, FUJISAWA H, TASAKA M. Genes involved in organ separation in: An analysis of the cup-shaped cotyledon mutant. The Plant Cell, 1997, 9(6): 841-857.

[16] LARSSON E, SITBON F, SUNDSTR?M J, VON ARNOLD S. NAC regulation of embryo development in conifers. BMC Proceedings, 2011, 5(7): 67.

[17] HE X J, MU R L, CAO W H, ZHANG Z G, ZHANG J S, CHEN S Y. AtNAC2, a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways, is involved in salt stress response and lateral root development. The Plant Journal, 2005, 44(6): 903-916.

[18] LIU Y Z, BAIG M N R, FAN R, YE J L, CAO Y C, DENG X X. Identification and expression pattern of a novel NAM, ATAF, and CUC-like gene fromosbeck. Plant Molecular Biology Reporter, 2009, 27(3): 292-297.

[19] SHAHNEJAT-BUSHEHRI S, TARKOWSKA D, SAKURABA Y, BALAZADEH S.NAC transcription factor JUB1 regulates GA/BR metabolism and signalling. Nature Plants, 2016, 2(3): 1-9.

[20] ZHANG W Y, ABDELRAHMAN M, JIU S T, GUAN L, HAN J, ZHENG T, JIA H F, SONG C N, FANG J G, WANG C. VvmiR160s/interaction and their spatio-temporal expression/cleavage products during GA-induced grape parthenocarpy. BMC Plant Biology, 2019, 19(1): 111.

[21] 吳偉民, 錢亞明, 趙密珍, 王壯偉, 袁驥. 赤霉素處理對‘魏可’葡萄果穗長度和坐果的影響. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2006, 34(6): 257-258.

WU W M, QIAN Y M, ZHAO M Z, WANG Z W, YUAN J. Effects of gibberellin treatment on ear length and fruit setting of Weike grape. Jiangsu Agricultural Sciences, 2006, 34(6): 257-258. (in Chinese)

[22] ABU-ZAHRA T R. Percentage of thompson seeds affected by GIBBERELLIC acid and cance GIRDLING. Pakistan Journal of Botany, 2010, 42(3): 1755-1760.

[23] CHENG C X, XU X Z, SINGER S D, LI J, ZHANG H J, GAO M, WANG L, SONG J Y, WANG X P. Effect of GA3 treatment on seed development and seed-related gene expression in grape. PLoS One, 2013, 8(11): e80044.

[24] LUO Y, GUO Z H, LI L. Evolutionary conservation of microRNA regulatory programs in plant flower development. Developmental Biology, 2013, 380(2): 133-144.

[25] MALLORY A C, VAUCHERET H. Functions of microRNAs and related small RNAs in plants. Nature Genetics, 2006, 38(6): S31-S36.

[26] MA X L, ZHANG X G, ZHAO K K, LI F P, LI K, NING LL, HE J L, XIN Z Y, YIN D M. Small RNA and degradome deep sequencing reveals the roles of microRNAs in seed expansion in peanut (L.). Frontiers in Plant Science 2018, 9: 349.

[27] CUI M J, WANG C, ZHANG W Y, PERVAIZ T, HAIDER M S, TANG W, FANG J G. Characterization of Vv-miR156:pairs involved in the modulation of grape berry development and ripening. Molecular Genetics and Genomics, 2018, 293(6): 1333-1354.

[28] 張文穎, 韓旭, 朱旭東, 解振強, 糾松濤, 黃雨晴, 賈海鋒, 房經(jīng)貴, 王晨. 葡萄miR159s靶基因的鑒定及其應答GA在果實不同組織的調(diào)控作用. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2019, 52(16): 2858-2870.doi: 10.3864/j. issn.0578-1752.2019.16.011.

ZHANG W Y, HAN X, ZHU X D, XIE Z Q, JIU S T, HUANG Y Q, JIA H F, FANG J G, WANG C. Identification of the target genes of VvmiR159s and their regulation in response to GA in different tissues of grape berry. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(16): 2858-2870. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.16.011. (in Chinese)

[29] 宣旭嫻, 盛子璐, 解振強, 黃雨晴, 鞏培杰, 張川, 鄭婷, 王晨, 房經(jīng)貴. vvi-miR172s及其靶基因響應赤霉素調(diào)控葡萄果實發(fā)育的作用分析. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2021, 54(6): 1199-1217. doi: 10.3864/j.issn. 0578-1752.2021.06.011.

XUAN X X, SHENG Z L, XIE Z Q, HUANG Y Q, GONG P J, ZHANG C, ZHENG T, WANG C, FANG J G. Function analysis of wi-miR172s and their target genes response to gibberellin regulation of grape berry development. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(6): 1199-1217. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.011. (in Chinese)

[30] 王文然, 王晨, 解振強, 賈海鋒, 湯崴, 崔夢杰, 房經(jīng)貴. VvmiR397a及其靶基因在葡萄果實發(fā)育中的作用分析. 園藝學報, 2018, 45(8): 1441-1455.

WANG W R, WANG C, XIE Z Q, JIA H F, TANG W, CUI M J, FANG J G. Function analysis of VvmiR397a and its target genesin grape berry development. Acta Horticulturae Sinica, 2018, 45(8): 1441-1455. (in Chinese)

[31] JIN J P, ZHANG H, KONG L, GAO G, LUO J C. PlantTFDB 3.0: A portal for the functional and evolutionary study of plant transcription factors. Nucleic Acids Research, 2014, 42: D1182-D1187.

[32] WANG B J, WANG J, WANG C, SHEN W B, JIA H F, ZHU X D, LI X P. Study on expression modes and cleavage role of miR156b/c/d and its target gene vv-SPL9 during the whole growth stage of grapevine. Journal of Heredity, 2016, 107(7): 626-634.

[33] HENDELMAN A, STAV R, ZEMACH H, ARAZI T. The tomato NAC transcription factor SlNAM2 is involved in flower-boundary morphogenesis. Journal of Experimental Botany, 2013, 64(18): 5497-5507.

[34] GUO H S, XIE Q, FEI J F, CHUA N H. microRNA directs mRNA cleavage of the transcription factor NAC1 to downregulate auxin signals forlateral root development. The Plant Cell, 2005, 17(5): 1376-1386.

Identification of the VvmiR164s-Action Module and Analysis of Their Expressions Responsive to Exogenous GA During Grape Ovary Development

1School of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014

【Objective】The aim of this study was to identify grapevine miR164s (VvmiR164a/b/c/d) and their target genes, and to elucidate the regulatory roles of VvmiR164s and their target genes during exogenous GA-induced grape parthenocarpic process.【Method】Using ‘Wink’ grapes (L. Wink) as the test material, miR-RACE, PCR, RLM-RACE and PPM-RACE, qRT-PCR and bioinformatics were used to analyze the spatio-temporal expression of VvmiR164s-module in response to exogenous GA and its potential functions during grape parthenocarpic process. 【Result】Gibberellin application on ‘Wink’ grapes before flowering induced parthenocarpy, leading to seedless berries. The precise sequence ofwas cloned and identified, and four of its target genes were predicted, including,,,. Combining the degree of match with the comprehensive analysis of the previous data, this work focused on the analysis of the target gene, which was named as. Thecleavage site was located at position 9 and position 11 of the 5′ end of miRNA, with a cleavage frequency of 17/20 and 11/20, respectively, and was localized on Chr14, encoding 363 amino acids and containing a NAM. The VvNAC100 protein is highly conserved in amino acid sequence and functionally similar to other species, among which it is more closely related to species such as pepper and tobacco. The promoters ofand its target geneboth contain multiple hormone-acting elements, suggesting that it might be involved in the regulation of grape growth and development by responding to mult-hormones. The RT-qPCR results showed that the expression level of VvmiR164b tended to decrease as the grape ovary developed, while its target geneshowed an increasing expression trend in the early stage of ovary development with a certain negative correlation. On the other hand, VvmiR164a/c/d showed a similar expression pattern withwith a certain positive correlation. However, after GA treatment, the expression of VvmiR164a/c/d was highly significantly increased during parthenocarpy in the grape ovary, which also significantly suppressed the expression ofduring this period, promoting a negative correlation between VvmiR164a/c/d-their expression levels. VvmiR164b showed a decreasing trend after GA treatment, and it’s the expression levels showed some positive correlation with those of, indicating that GA treatment promoted the negative regulation of VvmiR164a/c/d on, but repressed the negative regulation of VvmiR164b on.【Conclusion】was the true target gene of VvmiR164 family. During grape parthenocarpy, GA induced the negative regulation of VvmiR164a/c/d on the target geneand suppressed that of VvmiR164b on the target gene. VvmiR164a/c/d were the main effectors of the VvmiR164 family involved in modulation of GA-induced grape parthenocarpy.

grape; gibberellin; parthenocarpy; VvmiR164;

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.012

2022-07-04；

2022-12-27

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD1000106）、國家自然科學基金面上項目（31972373）、江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項目（JBGS（2021）086）、江蘇省高等學校優(yōu)勢學科項目（PAPD）

王霏，E-mail：2020104031@stu.njau.edu.cn。通信作者王晨，E-mail：wangchen@njau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）