侵染花葉青木的病毒種類鑒定及其基因序列分析

梁海文，蘭平秀，柳勤海，譚冠林，陳小姣，趙雁，李凡

侵染花葉青木的病毒種類鑒定及其基因序列分析

梁海文1,2，蘭平秀1，柳勤海1，譚冠林3，陳小姣1，趙雁2，李凡1

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明 650201；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代教育技術(shù)中心，昆明 650201

【目的】探明采自云南和海南表現(xiàn)為黃化、皺縮等表型的花葉青木病毒種類?！痉椒ā渴紫?，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對來自云南省昆明市的花葉青木樣品進(jìn)行檢測；然后，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，采用RT-PCR對采自云南省昆明市和海南省海口市的73份花葉青木樣品開展轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的病毒種類檢測驗(yàn)證，并擴(kuò)增獲得相關(guān)病毒基因片段，對這些病毒的基因序列進(jìn)行比對分析?！窘Y(jié)果】轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，送測的花葉青木樣品中含有蠶豆萎蔫病毒2號（broad bean wilt virus 2，BBWV2）、菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、豌豆耳突花葉病毒1號（pea enation mosaic virus 1，PEMV-1）和豌豆耳突花葉病毒2號（pea enation mosaic virus 2，PEMV-2）5種病毒的侵染。但隨后對來自云南和海南的73份花葉青木樣品的RT-PCR驗(yàn)證中，只檢測到BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2 4種病毒。其中，云南和海南的樣品中均能檢測到BBWV2，總檢出率為11.0%；而BYMV、CMV和PEMV-2僅在云南的樣品中被檢測到，檢出率分別為5.5%、1.4%和1.4%。從兩地采集的花葉青木樣品中既未發(fā)現(xiàn)PEMV-1的侵染，也未發(fā)現(xiàn)BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2的復(fù)合侵染。為了進(jìn)一步分析BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2花葉青木分離物與來自其他寄主植物相關(guān)病毒分離物的分子變異，選取檢測到上述4種病毒的樣品，分別對BBWV2、BYMV和CMV 3種病毒的及PEMV-2的序列進(jìn)行擴(kuò)增，并對擴(kuò)增獲得的BBWV2 490 nt的small（GenBank登錄號：OQ137565、OQ137566）、BYMV 499 nt的核心區(qū)域（GenBank登錄號：OQ137568）、CMV 880 nt的（GenBank登錄號：OQ137567）和PEMV-2 800 nt的核心區(qū)域序列（GenBank登錄號：OQ137569）進(jìn)行分析。序列比對分析結(jié)果表明，BBWV2云南與海南花葉青木分離物間存在85.9%的核苷酸序列一致性，二者與GenBank中其他BBWV2分離物分別存在79.8%—94.5%和80.2%—92.0%的核苷酸序列一致性；BYMV、CMV和PEMV-2云南花葉青木分離物與GenBank中相應(yīng)病毒的核苷酸序列一致性分別為79.8%—99.0%、71.5%—99.4%和84.9%—98.0%。利用以上病毒相應(yīng)基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)BBWV2云南和海南花葉青木分離物分別屬于I組中的a亞組和b亞組；BYMV云南花葉青木分離物與伊朗（GenBank登錄號：MN241051，MN241060）和伊拉克（GenBank登錄號：JQ026005）蠶豆分離物具有較近的親緣關(guān)系；CMV云南花葉青木分離物屬于I組中的IB亞組，但與IB亞組的其他成員具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；PEMV-2云南花葉青木分離物與云南豌豆分離物親緣關(guān)系最近并聚為一組，但與其他分離物存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。【結(jié)論】首次報道了花葉青木被病毒感染，同時也是BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2在花葉青木乃至桃葉珊瑚屬植物上的首次報道，BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2花葉青木分離物與來自其他植物的相關(guān)病毒分離物存在較大的分子變異。

花葉青木；病毒鑒定；蠶豆萎蔫病毒2號；菜豆黃花葉病毒；黃瓜花葉病毒；豌豆耳突花葉病毒2號

0 引言

【研究意義】花葉青木（var.）為絲纓花科（Garryaceae）桃葉珊瑚屬（）常綠灌木，其葉片革質(zhì)光亮且具有金黃色斑點(diǎn)，是青木（）最常見的栽培變種，在國內(nèi)外園林綠化中廣泛應(yīng)用。2021年，筆者發(fā)現(xiàn)昆明市園林綠化中的花葉青木葉片大多具有黃化斑點(diǎn)等表型，有的甚至整個植株葉片都布滿黃色斑紋。這些花葉青木葉片的黃色斑紋表型與其原種青木葉片的表型差別很大，同時還觀察到花葉青木“色彩斑斕”的葉片表型與植物病毒侵染引起的癥狀較為相似，而花葉青木主要通過扦插方式進(jìn)行繁殖，極易導(dǎo)致病毒等病原物通過繁殖材料傳播擴(kuò)散。目前尚不清楚昆明市園林綠化中這些表現(xiàn)為黃化斑點(diǎn)的表型是花葉青木固有特性，還是因病毒感染所致。為此，通過對這些表現(xiàn)為黃化斑點(diǎn)等癥狀的花葉青木樣品開展病毒種類鑒定及其分子變異分析，以期為花葉青木葉片表型與病毒侵染的相關(guān)性研究，以及彩葉觀賞植物的品種選育等提供理論依據(jù)，同時也將為觀賞植物病毒病的防控工作提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】多年生的園林觀賞植物很容易遭受各種病原物的侵害，對其觀賞價值等造成嚴(yán)重影響，但有些病毒的侵染對于觀賞植物幾乎沒有危害，反而使其葉片和花朵的色彩變得更加豐富，進(jìn)而增加其觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值[1]。當(dāng)今，彩葉植物的觀賞價值遠(yuǎn)高于同源的綠葉觀賞植物，在園林綠化中使用頻率高，經(jīng)濟(jì)價值也隨之提升。因此在觀賞植物育種過程中，人們有意識地選擇具有花葉或雜色花性狀的品種并廣泛引種栽培。有研究表明觀賞植物豐富表型的產(chǎn)生與病毒侵染相關(guān)，如段永嘉等[2]在香石竹、唐菖蒲、紫羅蘭及虞美人的雜色花品種上分別檢測出香石竹斑駁病毒（carnation mottle virus，CarMV）、菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）、蕪箐花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV），探明了這4種植物的花瓣雜色均為病毒侵染所致。吳康承[3]從具有花葉癥狀的彩葉扶桑上分離得到的番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV），將其接種普通朱槿后可產(chǎn)生全株花葉的朱槿。因此，有些植物病毒的侵染與觀賞植物的彩色葉片或花瓣有關(guān)，有的病毒在提高觀賞植物的觀賞價值方面是有益的。截至目前，與花葉青木同源的青木上僅見日本學(xué)者報道過花椰菜花葉病毒科（）桿狀DNA病毒屬（）的桃葉珊瑚環(huán)斑病毒（aucuba ringspot virus，AuRV）[4]和伴生豇豆病毒科（）線蟲傳多面體病毒屬（）的蘇鐵壞死矮化病毒（cycas necrotic stunt virus，CNSV）[5]兩種病毒的侵染，尚未見有關(guān)花葉青木病毒方面的報道。深度測序（deep sequencing）也稱下一代測序（next-generation sequencing，NGS）和高通量測序（high-throughput sequencing，HTS），是一種可在短時間內(nèi)以較低成本對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定的便捷測序技術(shù)，目前已在植物病毒鑒定和檢測方面廣泛應(yīng)用，可鑒定已知病毒、發(fā)現(xiàn)新病毒及分析病毒間的進(jìn)化關(guān)系等[6]。目前宏基因組測序（metagenome sequencing）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）和小RNA測序（small RNA sequencing，sRNA-seq）是深度測序技術(shù)中主要的病毒檢測鑒定方法，其中轉(zhuǎn)錄組測序在植物病毒研究中應(yīng)用最為廣泛。Lan等通過去除rRNA的轉(zhuǎn)錄組測序，分別在表現(xiàn)為壞死、褪綠癥狀的山藥樣品中發(fā)現(xiàn)柘橙病毒屬（）的一種新病毒——山藥褪綠壞死病毒（yam chlorotic necrosis virus，YCNV）[7]，在諾麗上發(fā)現(xiàn)馬鈴薯Y病毒屬（）的一種新病毒——諾麗花葉病毒（noni mosaic virus，NoMV）[8]；李梁利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在表現(xiàn)為皺縮癥狀的藜上存在蠶豆萎蔫病毒2號（broad bean wilt virus 2，BBWV2）的侵染[9]。轉(zhuǎn)錄組測序也被用于分析病毒侵染后對觀賞植物葉色變化的影響，如王煒等利用轉(zhuǎn)錄組測序探明滇山茶花葉呈色可能與病毒侵染后誘導(dǎo)了多個代謝途徑的基因沉默有關(guān)[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】彩葉植物的葉片呈色機(jī)理受多方面的影響，有的可能為品種本身遺傳特性決定，有的或是被病毒感染所致。然而，病毒感染對園林植物觀賞性方面的影響迄今鮮有報道，也尚未見有關(guān)花葉青木被病毒感染的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合RT-PCR技術(shù)，對采自云南和海南表現(xiàn)為黃化、皺縮和褪綠斑等癥狀的花葉青木樣品進(jìn)行病毒種類檢測鑒定，并對其中發(fā)現(xiàn)的病毒進(jìn)行分子變異和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年8月，從云南省昆明市部分住宅小區(qū)景觀花園中采集表現(xiàn)為黃化（圖1-a）和皺縮、褪綠斑（圖1-b）的花葉青木葉片樣品58份，挑選具有典型癥狀的7份樣品等量混合后于液氮中磨碎，送上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），其余樣品（包括轉(zhuǎn)錄組測序剩余的7份）于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2022年2月，從海南省?？谑胁杉憩F(xiàn)為不規(guī)則黃斑和黃化（圖1-c）的花葉青木樣品15份，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 材料與試劑

DH5菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存，CTAB為國產(chǎn)分析純，pMD19-T Vector和Reverse Trancsriptase M-MLV（RNase H-）購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA Polymerase和DNA純化回收試劑盒（離心柱型）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組測序樣品的總核酸采用Invitrogen公司的Trizol試劑進(jìn)行提取后，運(yùn)用NanoDrop 2000（Wilmington，DE，USA）分光光度計(jì)對核酸質(zhì)量進(jìn)行檢測，將OD260/280在1.6—1.8的核酸利用TruSeq RNA Sample Prep Kit除去rRNA，使用Illumina HiSeq X-ten系統(tǒng)進(jìn)行測序。所得序列經(jīng)CLC Genomic Workbench 9.5（QIAGEN）分析后，組裝成200 bp以上的contigs，利用NCBI中的Blastn和Blastx進(jìn)行比對分析并獲取與病毒相關(guān)的contigs。數(shù)據(jù)分析由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)署（USDA-ARS）國家種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室的李如慧博士幫助完成。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲取的contigs設(shè)計(jì)檢測BYMV、PEMV-1和PEMV-2的特異引物，BBWV2和CMV的檢測引物參考文獻(xiàn)[11]，引物詳細(xì)信息見表1。

表1 花葉青木病毒檢測引物

1.5 總核酸提取、RT-PCR及PCR產(chǎn)物克隆

采用Li等[12]的CTAB法提取樣品總核酸。以總核酸為模板，按照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取病毒的cDNA。使用DNA Polymerase試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10 μL反應(yīng)體系：10×Buffer（Mg2+plus）1 μL、dNTP mix（2.5 mmol·L-1）0.8 μL、上下游引物各0.2 μL、DNA Polymerase 0.2 μL、ddH2O 6.6 μL、cDNA 1 μL，輕彈管壁混勻后進(jìn)行以下反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸若干30 s，擴(kuò)增35次循環(huán)，72 ℃延伸10 min后，取全部PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠于0.5×TBE緩沖液中電泳，35 min后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增結(jié)果。

紫光燈下切下與引物設(shè)計(jì)相符的擴(kuò)增片段，經(jīng)SanPrep柱式膠回收試劑盒純化后，連接至pMD19-T Vector，10 h后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5，在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落擴(kuò)繁10 h并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.6 序列分析

利用NCBI網(wǎng)站中的Nucleotide BLAST（https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫下載BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2的序列，利用Clustal Omega（https://www. ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行多重比對并截取與本研究獲取序列一致的區(qū)域，刪去相互間序列變異小于1%的分離物，利用MEGA7.0軟件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）分別構(gòu)建BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2等病毒相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所使用的最適替代模型分別為TN93（Tamura-Nei）、T92（Tamura 3- parameter）、HKY（Hasegawa-Kishino-Yano）和K2（Kimura 2-parameter）。

2 結(jié)果

2.1 花葉青木樣品轉(zhuǎn)錄組測序

通過對7份花葉青木樣品混合物的轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得67 563 492的reads（讀長），去除reads中的接頭序列及由于接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads，組裝后獲得長度大于200 bp的187 602個contigs（重疊群）。Blastn分析顯示，長度532—5 297 bp的幾個contigs分別與BBWV2、BYMV、CMV、PEMV-1和PEMV-2等病毒擁有94%—99%最高的核苷酸序列一致性（表2），暗示花葉青木樣品中可能存在以上5種病毒的侵染。

表2 利用轉(zhuǎn)錄組測序從花葉青木混合樣中獲取的病毒相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 花葉青木單一樣品中轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)病毒的RT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序獲得的BBWV2、BYMV、CMV、PEMV-1和PEMV-2這5種病毒在花葉青木樣品中的真實(shí)性，利用上述5種病毒的特異性檢測引物（表1），對送轉(zhuǎn)錄組測序的7份采自昆明的花葉青木單一樣品進(jìn)行相關(guān)病毒的RT-PCR檢測，其中4份樣品能分別擴(kuò)增到約490、499、880和800 nt與引物設(shè)計(jì)相符的病毒基因片段（圖2）。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，Blastn分析顯示這些基因片段分別與GenBank中的BBWV2（OP722593）、BYMV（JQ026005）、CMV（MT786689）和PEMV-2（MN399704）擁有95%、99%、99%和96%的核苷酸序列一致性，證明花葉青木中存在BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2這4種病毒的感染，7份花葉青木單一樣品均未檢測到PEMV-1的感染。

2.3 云南和海南花葉青木樣品中BBWV2、BYMV、CMV、PEMV-1和PEMV-2的檢測結(jié)果

利用BBWV2、BYMV、CMV、PEMV-1和PEMV-2的特異檢測引物，對采自云南（58份，含送轉(zhuǎn)錄組測的7份）以及海南（15份）花葉青木樣品進(jìn)行上述5種病毒的RT-PCR檢測，共有14份樣品檢測到BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2，病毒總檢出率為19.2%（表3）。其中檢出BBWV2的樣品數(shù)為8份，檢出率最高，為11.0%；其次為BYMV，樣品檢出數(shù)為4份，檢出率為5.5%；CMV和PEMV-2的樣品檢出率均較低，分別僅有1份樣品檢測到陽性條帶，檢出率為1.4%。BBWV2在云南和海南的樣品中均被檢測到，而BYMV、CMV和PEMV-2僅在云南的樣品中被檢測到。73份花葉青木樣品中未發(fā)現(xiàn)PEMV-1的侵染，也未發(fā)現(xiàn)BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2等病毒之間的復(fù)合侵染。

表3 云南和海南73份花葉青木樣品BBWV2、BYMV、CMV、PEMV-1和PEMV-2的RT-PCR檢測結(jié)果

-：未檢出病毒no virus was detected

1—7：花葉青木樣品A. japonica var. variegata sample；M：Marker；CK：陰性對照Negative control

2.4 BBWV2花葉青木分離物small cp的遺傳變異及系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)合RT-PCR檢測結(jié)果，從云南和海南的BBWV2陽性花葉青木樣品中各選擇一份樣品進(jìn)行BBWV2擴(kuò)增產(chǎn)物的測序，序列分析顯示獲取的490 nt片段為BBWV2的small序列。序列比對結(jié)果顯示BBWV2花葉青木云南分離物（BBWV2-YNHYQM，GenBank登錄號：OQ137565）與海南分離物（BBWV2-HNHYQM，GenBank 登錄號：OQ137566）間具有85.9%的核苷酸序列一致性，且這兩個BBWV2花葉青木分離物與GenBank中的其他BBWV2分離物分別具有79.8%—94.5%和80.2%—92.0%的核苷酸序列一致性。

從GenBank中獲取BBWV2不同分離物的small基因序列，去除相互間序列差異小于1%的分離物，對來自中國、日本、韓國、英國、德國等不同國家和地區(qū)的番茄、辣椒、白術(shù)、山藥、菊三七、車前草、本氏煙、蠶豆等不同寄主植物22個BBWV2分離物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示這些BBWV2分離物可分為I、II兩組，I組又可分為a、b兩個亞組，其中本文獲得的兩個BBWV2花葉青木分離物YNHYQM和HNHYQM分別分布于I組中的a亞組和b亞組，分別與來自德國的本氏煙分離物（OK058514）和來自云南的辣椒分離物（MW271032）具有較近的親緣關(guān)系（圖3）。

2.5 BYMV花葉青木分離物cp核心區(qū)的遺傳變異及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)RT-PCR檢測結(jié)果，對唯一一個含有BYMV感染的花葉青木樣品進(jìn)行病毒擴(kuò)增序列分析，顯示獲取的499 nt片段為BYMV核心區(qū)（BYMV-YNHYQM，GenBank登錄號：OQ137568）。從GenBank下載BYMV其他分離物相應(yīng)區(qū)域序列進(jìn)行多重比對，發(fā)現(xiàn)BYMV花葉青木分離物YNHYQM與其他分離物在核心區(qū)域具有79.8%—99.0%的核苷酸序列一致性，分子變異較大。去除相互間序列差異小于1%的分離物，利用來自中國、日本、韓國、印度、英國、美國、阿根廷、伊朗、伊拉克等不同國家和地區(qū)豆科、蘭科等不同作物上的20個BYMV分離物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示這些BYMV分離物可分為6個組，其中YNHYQM分離物與來自伊朗（MN241051，MN241060）和伊拉克（JQ026005）的蠶豆分離物具有較近的親緣關(guān)系，聚集在一起歸為V組（圖4）。各組中，來自豆科、蘭科等相近寄主的分離物分別顯示了相對較近的親緣關(guān)系。

分離物GenBank登錄號/寄主植物/地理來源GenBank accession number of different isolates/host plant/geographical origin；p：本研究獲得的分離物The isolate obtained in this study；置信值：分支上的數(shù)值，用來評估該分支的可信度，置信值一般＞70%時為可信The value on the branch is used to evaluate the credibility of the branch. The confidence value is generally greater than 70%；距離標(biāo)尺：序列間差異數(shù)值的單位長度，發(fā)育樹的比例尺The unit length of the value of the difference between sequences, the scale of the evolutionary tree。下同The same as below

2.6 CMV花葉青木分離物cp的遺傳變異及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)RT-PCR檢測結(jié)果，對本文獲得的唯一一個CMV花葉青木分離物880 nt序列進(jìn)行分析，所獲得的為CMV的（CMV-YNHYQM，GenBank登錄號：OQ137567）。從GenBank下載CMV其他分離物相應(yīng)區(qū)域序列進(jìn)行多重比對，CMV花葉青木分離物YNHYQM顯示了與其他分離物有71.5%—99.4%的核苷酸序列一致性。去除相互間序列差異小于1%的分離物，利用分布于IA、IB和II組的26個CMV分離物構(gòu)建發(fā)育樹，YNHYQM分離物屬于IB亞組，但單獨(dú)成一簇，與IB亞組的其他成員顯示了較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系（圖5）。

2.7 PEMV-2花葉青木分離物RdRp核心區(qū)的遺傳變異及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)RT-PCR檢測結(jié)果，對獲得的唯一一個PEMV-2花葉青木分離物800 nt的序列進(jìn)行分析，顯示為的核心區(qū)域（PEMV-2-YNHYQM，GenBank登錄號：OQ137569）。從GenBank下載PEMV-2其他分離物相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行多重序列比對，顯示PEMV-2花葉青木分離物YNHYQM與其他PEMV-2分離物擁有84.9%—98.0%的核苷酸序列一致性。去除相互間序列差異小于1%的PEMV-2分離物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)這19個PEMV-2分離物可分為3個組，大多數(shù)的分離物聚集在I組；而II組又可分為a亞組和b亞組，其中德國豌豆分離物（MW961148）單獨(dú)形成II組的a亞組，PEMV-2云南花葉青木分離物與云南的4個豌豆分離物聚集在II組的b亞組，親緣關(guān)系較近；美國豌豆分離物（JF723436）與其他分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)形成亞組III（圖6）。

豆科 Leguminosae；蘭科 Orchidaceae

3 討論

3.1 云南和海南花葉青木的病毒種類

花葉青木是常見的園林植物，國內(nèi)外報道過花葉青木上有炭疽病、白粉病、根腐病、褐斑病等病害的發(fā)生[13-17]，但尚未見病毒病的相關(guān)報道。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序從采自昆明的疑似病毒病癥狀花葉青木樣品中發(fā)現(xiàn)可能有BBWV2、BYMV、CMV、PEMV-1和PEMV-2感染。隨后采用RT-PCR從供試的73份花葉青木樣品中只檢測到BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2，表明花葉青木中存在上述4種病毒的侵染。但4種病毒中只有BBWV2同時在云南和海南的樣品中被檢測到，而BYMV、CMV和PEMV-2僅在云南的樣品中被檢測到。自然界中，PEMV-1與PEMV-2通常復(fù)合侵染引起豌豆耳突花葉病，但植株中也存在僅檢測到PEMV-2而檢測不到PEMV-1的現(xiàn)象[18-19]。本研究轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示獲得了PEMV-1的近全長基因組序列，但利用RT-PCR技術(shù)在73份花葉青木樣品中均未檢測到PEMV-1，原因有待進(jìn)一步探究。此前日本科學(xué)家曾報道在與花葉青木同源的青木上發(fā)現(xiàn)有AuRV和CNSV侵染[4-5]。為此，本研究也利用這兩種病毒的特異引物對供試的73份花葉青木樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，但未擴(kuò)增到相關(guān)病毒的目標(biāo)條帶，因此供試的花葉青木樣品中暫未發(fā)現(xiàn)含有AuRV和CNSV這兩種病毒。

3.2 4種病毒花葉青木分離物與其他分離物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

BBWV2在全世界范圍內(nèi)均有發(fā)生和分布，在44個科186屬328種植物上曾有報道[20-22]。本研究中BBWV2是唯一在云南與海南花葉青木樣品上均檢測到的病毒，但來自這兩個地區(qū)的BBWV2陽性花葉青木樣品上觀察到的癥狀表現(xiàn)不一致，云南的陽性樣品表現(xiàn)為邊緣不清晰的淡黃色斑塊，而海南的陽性樣品嫩葉有邊緣明顯的黃色斑點(diǎn)，老葉黃化。兩個BBWV2花葉青木分離物在small區(qū)域具有85.9%的核苷酸序列一致性，系統(tǒng)發(fā)育上分屬于不同亞組，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。尚不清楚這些差異是否是造成云南和海南兩地花葉青木表型差異的主要原因。另外，本實(shí)驗(yàn)室也在花葉青木BBWV2陽性樣品中檢測到1種新病毒（結(jié)果未發(fā)表），因此云南和海南兩地BBWV2陽性樣品葉片癥狀不一的原因尚無法確定。BYMV是蠶豆和豌豆上發(fā)生最普遍和最嚴(yán)重的病毒之一，可侵染12個科的114種植物[23-24]，本研究中獲得BYMV花葉青木分離物與伊朗（MN241051和MN241060）和伊拉克（JQ026005）蠶豆分離物的親緣關(guān)系較近，但更翔實(shí)的數(shù)據(jù)還有待BYMV花葉青木分離物全基因組序列的獲取及進(jìn)一步分析。CMV被稱為全球第四大植物病毒，可侵染100多個科1 000多種植物并造成危害和嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[25-26]。根據(jù)癥狀特點(diǎn)、寄主范圍、致病性及核苷酸序列同源性的差異，CMV可分為I和II兩個亞群[27]，亞群I進(jìn)一步分為IA和IB兩個亞組，亞群II和IA亞組全球分布，而IB亞組主要在亞洲發(fā)生[28]。本研究在花葉青木上發(fā)現(xiàn)的CMV分離物屬于IB亞組，與IB亞組的印度和烏干達(dá)分離物最近，但與國內(nèi)其他CMV分離物不在同一組，暗示CMV花葉青木分離物可能是從國外傳入。另外，PEMV-2花葉青木分離物在系統(tǒng)發(fā)育中與本實(shí)驗(yàn)室獲得的4個PEMV-2云南豌豆分離物（數(shù)據(jù)未發(fā)表）單獨(dú)聚成一組，與其他國家PEMV-2豌豆分離物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測本研究獲得的PEMV-2花葉青木分離物與云南豌豆中PEMV-2分離物可能有著相同的起源。不過，本研究中花葉青木4種病毒的來源還需進(jìn)行更多深入的探究。

圖5 基于CMV不同分離物cp構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 基于PEMV-2不同分離物RdRp核心區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 花葉青木葉片表型與病毒種類的相關(guān)性

在花葉青木上發(fā)現(xiàn)的4種病毒中，海南的樣品只檢測到BBWV2一種病毒，而云南的樣品BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2這4種病毒均被檢測到，可看出云南和海南的花葉青木樣品上的病毒種類及數(shù)量差異較大，云南的病毒種類多樣性更豐富。暫不清楚造成上述差異的原因，推測可能是兩地栽培的花葉青木種質(zhì)來源不同或是其周圍植物及其攜帶的病毒種類各異、氣候條件差異等，導(dǎo)致兩地花葉青木上的病毒種類不一，致使兩地的花葉青木葉片斑紋也不盡相同。本研究雖未在花葉青木樣品中檢測到AuRV和CNSV，但根據(jù)日本學(xué)者報道，青木受這兩種病毒侵染后均產(chǎn)生黃色環(huán)斑，這與本研究供試的花葉青木樣品表現(xiàn)的不規(guī)則黃色斑點(diǎn)表型相似，因此花葉青木葉片黃色斑紋表型的產(chǎn)生很有可能受病毒侵染影響，且病毒種類不一樣，在花葉青木上造成的表型可能相同，也可能不相同。除了本文中所報道的BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2這4種病毒外，本實(shí)驗(yàn)室還在花葉青木上發(fā)現(xiàn)了多種新病毒（結(jié)果另文報道）。由于目前較難找到不含病毒的青木植株，且尚未分離出單一病毒分離物在花葉青木上進(jìn)行回接試驗(yàn)并驗(yàn)證柯赫式法則，因此暫不能斷定花葉青木上葉片斑紋的變化是否與病毒侵染有關(guān)；若與病毒侵染有關(guān)，則病毒種類與花葉青木上葉片斑紋的相關(guān)性及其形成機(jī)制等都值得深入研究。

4 結(jié)論

采用高通量測序并結(jié)合RT-PCR技術(shù)，從來自云南和海南的73份花葉青木樣品中檢測到BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2 4種病毒，證明花葉青木中存在上述4種病毒的侵染，這是BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2在花葉青木乃至桃葉珊瑚屬植物上的首次報道。研究結(jié)果可為病毒侵染與花葉青木葉片表型相關(guān)性研究提供理論依據(jù)。

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Viruses Identification and Their Gene Sequences Analysis Infectingvar.

LIANG HaiWen1,2, LAN PingXiu1, LIU QinHai1, TAN GuanLin3, CHEN XiaoJiao1, ZHAO Yan2, LI Fan1

1College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;2College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;3Modern Education Technology Center, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201

【Objective】The objective of this study is to identify the viruses infectingvar.plants with symptoms of yellowing and shrinking which collected from Yunnan and Hainan provinces.【Method】Firstly, RNA sequencing was used todetect the viruses infectingvar.plants from Kunming, Yunnan province. Then, based on the RNA sequencing results, RT-PCR was used to detect these viruses in 73var.field samplescollected in Kunming of Yunnan province and Haikou of Hainan province, and the related virus gene fragments were amplified, sequenced and analyzed.【Result】RNA sequencing results showed that 5 viruses were detected from the pooled diseased plants, such as broad bean wilt virus 2 (BBWV2), bean yellow mosaic virus (BYMV), cucumber mosaic virus (CMV), pea enation mosaic virus 1 (PEMV-1), and pea enation mosaic virus 2 (PEMV-2). However, only BBWV2, BYMV, CMV and PEMV-2 were detected in the 73var.samplesfrom Yunnan and Hainan. Among them, BBWV2 was detected in thevar.samples both from Yunnan and Hainan, with total detection rate of 11.0%, while BYMV, CMV and PEMV-2 were only detected in the Yunnan samples with detection rate of 5.5%, 1.4% and 1.4%, respectively. However, neither PEMV-1 nor the co-infections among BBWV2, BYMV, CMV and PEMV-2 was detected in these 73var.samples from Yunnan or Hainan. In order to further analyze the molecular variation of BBWV2, BYMV, CMV and PEMV-2 aucuba isolates with the related virus isolates from other host plants, the 490 nt of smallof BBWV2 (accession number OQ137565, OQ137566), 499 nt of the coreregion of BYMV (accession number OQ137568), 880 nt of theof CMV (accession number OQ137567), and 800 nt of the coreof PEMV-2 (accession number OQ137569) were amplified from thevar.samples infected with the above 4 viruses, and then the amplified gene sequences were analyzed, respectively. Sequence comparison analysis results showed that BBWV2 Yunnan aucuba isolate shared 85.9% nt identity with Hainan aucuba isolate, the BBWV2 Yunnan and Hainan aucuba isolates shared 79.8%-94.5% and 80.2%-92.0% nt identity with other BBWV2 isolates retrieved from GenBank, respectively. BYMV, CMV, and PEMV-2 aucuba isolates shared 79.8%-99.0%, 71.5%-99.4% and 84.9%-98.0% nt identity with other corresponding viruses in GenBank, respectively. Phylogenetic trees based on the gene nucleotide sequences of the above viruses revealed that the BBWV2 Yunnan and Hainan aucuba isolates were grouped into subgroup a and subgroup b in BBWV2 group I, respectively, and the BYMV Yunnan aucuba isolate showed a closest relationship with Iranian (accession number MN241051, MN241060) and Iraqi (accession number JQ026005) broad bean isolates. Moreover, the CMV Yunnan aucuba isolate was clustered into CMV IB subgroup of group I, but showed a distant relationship with other CMV isolates in the same subgroup. While PEMV-2 Yunnan aucuba isolate showed a closest relationship with Yunnan pea isolates and clustered into the same group, and had a distant relationship with other PEMV-2 isolates.【Conclusion】To our knowledge, this is the first record of virus infectingvar., and also the first report of BBWV2, BYMV, CMV and PEMV-2 infectingvar.as well as the plants in genus. Significant molecular variation was detected among the BBWV2, BYMV, CMV and PEMV-2 aucuba isolates with the related virus isolates from other plants worldwide.

var.; virus identification; broad bean wilt virus 2; bean yellow mosaic virus; cucumber mosaic virus; pea enation mosaic virus 2

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.007

2023-02-01；

2023-03-14

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFD1400700）、云南省專家工作站（202005AF150040）

梁海文，E-mail：13627546002@163.com。蘭平秀，E-mail：lanpx22@126.com。梁海文和蘭平秀為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者趙雁，E-mail：744234036@qq.com。通信作者李凡，E-mail：fanli@ynau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）